羅漢果內(nèi)生菌及其周邊土壤中產(chǎn)α-淀粉酶菌株的篩選

趙豐麗， 吳 奔， 張昌志， 范彩琴， 宋云飛， 楊文國， 陳 靜

(1.廣西師范大學 生命科學學院， 廣西 桂林 541004； 2.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004； 3.桂林萊茵生物科技股份有限公司， 廣西 桂林 541199)

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羅漢果內(nèi)生菌及其周邊土壤中產(chǎn)α-淀粉酶菌株的篩選

趙豐麗1,2， 吳 奔1， 張昌志1， 范彩琴1， 宋云飛3， 楊文國3， 陳 靜1

(1.廣西師范大學 生命科學學院， 廣西 桂林 541004； 2.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004； 3.桂林萊茵生物科技股份有限公司， 廣西 桂林 541199)

對羅漢果內(nèi)生菌及其種植區(qū)土壤中的微生物進行分離，篩選淀粉酶產(chǎn)生菌，并研究其發(fā)酵條件，結果得到15株內(nèi)生菌和8株微生物，從中篩選到2株產(chǎn)淀粉酶高的菌株2 -1(土壤)和R - 4(根部內(nèi)生菌)。經(jīng)初步鑒定，菌株2 -1為球菌，菌株R - 4為芽孢桿菌，均為革蘭氏陽性菌。研究顯示，菌株2 -1產(chǎn)酶條件為1.0%氯化銨、0.5%酵母粉、1.0%可溶性淀粉、0.4%氯化鈉，發(fā)酵溫度為40 ℃，發(fā)酵3 d，其產(chǎn)酶量為127.65 U/mL；R - 4菌株產(chǎn)酶條件為0.5%酵母粉、1.0%氯化銨、0.05%氯化鈉、2.0%可溶性淀粉，發(fā)酵溫度為40 ℃，發(fā)酵3 d，其產(chǎn)酶量為197.21 U/mL。

羅漢果； 內(nèi)生真菌； α -淀粉酶； 發(fā)酵條件

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)為葫蘆科羅漢果屬的多年生藤本植物的果實，是我國特有植物[1]，生長于廣西、廣東、江西、湖南及貴州等地，廣西桂林市永福縣是羅漢果發(fā)源地和主產(chǎn)地。羅漢果果實富含多種人體必需氨基酸、微量元素及維生素等，此外，含有黃酮、多糖、甜甙和多酚等活性成分。羅漢果具有多種藥理作用，具有良好的保健價值[2]。羅漢果中含有比蔗糖甜300倍的強甜物質(zhì)——羅漢果甜甙V。羅漢果甜甙V占總甜甙量的30%～40%[3]，是一種低熱量、不吸濕、不引發(fā)齲齒的純天然甜味劑。

甜甙Ⅴ隨羅漢果成熟度的增加而逐步增多，這是受體內(nèi)諸多水解酶參與轉化形成的結果，是低糖苷與葡萄糖逐漸結合轉化而來的[4]。羅漢果甜甙含量的多少受其體內(nèi)水解酶的影響較大，與葡萄糖有關聯(lián)。作為主要的水解酶之一的淀粉酶有可能參與了這一過程，而這些酶與微生物的關系如何，其研究有重要的意義。羅漢果中含有豐富的內(nèi)生菌，它們是否參與了羅漢果甙類物質(zhì)轉化等代謝過程，這些微生物和次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生是否有關，十分值得研究。經(jīng)查閱中外文獻，目前尚未見有從羅漢果中分離微生物、內(nèi)生菌以及內(nèi)生菌產(chǎn)淀粉酶等的研究報道。本研究以羅漢果根、莖、果實以及羅漢果種植地土壤為材料，采用微生物純種分離技術對其內(nèi)生菌以及其他微生物進行分離，并以淀粉水解圈為指標，篩選羅漢果產(chǎn)淀粉酶的內(nèi)生菌和其他微生物，對篩選到的菌株進行初步鑒定，研究其發(fā)酵條件，以期為羅漢果內(nèi)生菌相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

羅漢果的根、莖、果實以及羅漢果根部土壤及其周邊土壤于2015年10月采集于廣西桂林市臨桂縣。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g切塊，用水煮沸30 min，4層紗布過濾，濾液加葡萄糖20 g、瓊脂20 g、自來水補足1 000 mL，pH值自然。

改良PDA培養(yǎng)基：在其中加入2%的可溶性淀粉，用于產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選。

種子培養(yǎng)基[5]：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、pH值為7.4～7.6、自來水1 000 mL。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基[6]：可溶性淀粉20 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、K2HPO41 g、NaCl 1 g、pH值7.4、自來水1 000 mL。

以上培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃，20 min。

1.1.3 儀器與設備

SY100型顯微鏡，Nikon公司；BXM- 30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HZ200LB型恒溫搖床、HP400S型生化培養(yǎng)箱，武漢瑞華儀器設備有限責任公司；UV mini- 1240型紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理

1)根、莖、果表面的消毒及預處理。實驗前，用自來水將羅漢果的根、莖、果沖洗干凈，放入超凈工作臺；先用75%的酒精浸泡3 min，用無菌水清洗一次；用3%(3%～5%)的NaClO浸泡10 min，再用無菌水清洗一次；最后用75%的酒精浸泡30 s，用無菌水清洗5次，每次5 min。將第5次清洗的水保留下來作為對照。對已消毒的羅漢果根、莖、果進行剪切，取大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的組織進行接種。

2)土壤樣品的預處理。分別取20 g羅漢果根部土壤和周邊土壤，加入100 mL無菌水，振蕩30 min，取上清液稀釋后備用。

1.2.2 對照實驗的設置

分別取0.5 mL根、莖、果的第5次清洗的水涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，設置3個平行實驗，靜置5 min后，倒置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察是否長菌，未長菌說明表面消毒徹底，有菌生長說明消毒不徹底，需對材料表面重新消毒。

1.2.3 菌株的分離

將待接種的根、莖、果、土壤稀釋液分別涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，每種做3個平行，26 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d，當樣品周圍菌落長到一定程度，進行菌種分離純化。

1.2.4 菌株的純化

羅漢果內(nèi)生菌及土壤微生物菌落長出后，挑取形態(tài)不同菌落分別接種于PDA培養(yǎng)基平板上，做3個平行實驗，26 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長情況，分離純化1～3次，經(jīng)鏡檢確定無雜菌，可確定為純培養(yǎng)菌，供篩選。

1.2.5 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

1)初篩。將分離到的菌株進行稀釋，取0.2 mL涂布于改良后的PDA分離篩選平板上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d[7]。每天觀察菌落生長情況，在菌落周圍滴加稀碘液，如菌落周圍出現(xiàn)透明水解圈，表明菌株所產(chǎn)生的產(chǎn)物具有分解淀粉的能力。測定菌落及水解圈直徑，計算其比值，測量D/d(水解圈直徑/菌落直徑)值，挑選D/d較大的菌株進行復篩。

2)復篩。在裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中接入初篩菌株，32 ℃，120 r/min 搖瓶培養(yǎng)48 h[8]。取發(fā)酵液離心，收集上清液進行酶活測定。選取酶活高的菌株，備用。

1.2.6 菌株的初步鑒定

將產(chǎn)酶菌株接種在平板上，觀察菌落特征，進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)[9]，對產(chǎn)酶菌株進行初步鑒定。

1.2.7 淀粉酶活力的測定

粗酶液的制備。取2 mL產(chǎn)酶菌株的種子液接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶)，32 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)72 h，4 000 r/min離心20 min，取上清液[6]，參照參考文獻[10]、[11]進行酶活測定。

1.2.8 菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.2.8.1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化單因素實驗

由于培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件可直接影響菌株的生長情況，從而影響酶產(chǎn)量。其中碳源、氮源、氯化鈉濃度、淀粉含量和溫度是影響菌株生長的重要因素[5,8,12]。對復篩得到的產(chǎn)酶菌株通過單因素實驗初步篩選菌株產(chǎn)酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，為正交試驗的因素水平設計提供依據(jù)。按表1進行單因素實驗。

表1 單因素實驗因素水平

基本發(fā)酵條件：250 mL三角瓶中裝50 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，接入種子液2 mL，32 ℃，120 r/min 培養(yǎng)3 d，離心取上清液，按1.2.7方法測酶活。

1.2.8.2 菌株產(chǎn)酶條件的正交試驗

根據(jù)單因素實驗結果，選擇對實驗結果影響大的因素進行正交試驗，研究優(yōu)化產(chǎn)酶條件。

2 結果與分析

2.1 菌株分離純化的結果

羅漢果根、莖、果實等樣品經(jīng)過處理后接種于PDA培養(yǎng)基上，一周之內(nèi)未發(fā)現(xiàn)雜菌污染，并且對照組培養(yǎng)基中沒有長出菌落，表明樣品材料表面消毒符合菌種分離要求。經(jīng)分離培養(yǎng)，從羅漢果

根部樣品中分離到6株菌株，編號為R1、R2、R3、R4、R5、R6；從莖部樣品中得到5株菌株，編號為D1、D2、D3、D4、D5；從果實樣品中得到4株菌株，編號為F1、F2、F3、F4；從羅漢果根部土壤中得到5株菌株，編號為1 -1、1 -2、1 -3、1 - 4、1 -5；從羅漢果周邊土壤中得到3株菌株，編號為2 -1、2 -2、2 -3。

2.2 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選結果

將分離純化所得菌株的培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后涂布在初篩平板培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，共獲得4株淀粉水解圈相對值較大的菌株(如圖1)，編號分別為：1 -5、2 -1、F -1、R - 4。將4株菌進一步劃線分離后，接到斜面培養(yǎng)基上，低溫保存。將初篩得到的4株菌按1.2.5中2)方法進行復篩，結果見表2。

圖1 菌株平板培養(yǎng)基篩選結果Fig.1 Screening results of plate culture medium

編號透明圈直徑D/mm菌落直徑d/mmD/d酶活/(U·mL-1)1?52?1F?1R?41412121174752030172286311233872467835

從表2可以看出，在分離于土壤的2株菌株中，菌株2 -1酶活最高，分離于羅漢果的內(nèi)生菌中活性最高的為R - 4菌株，最終選定2 -1和R - 4兩株菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化。

2.3 菌株鑒定結果分析

對篩選出的產(chǎn)酶較高的2 -1菌株和R - 4菌株采用1.2.6方法進行初步鑒定，其結果見表3和圖2。

2.4 菌株產(chǎn)酶條件分析

為獲得菌株產(chǎn)酶的條件，對篩選出的2株產(chǎn)酶菌株按表1進行單因素實驗，菌株2 -1的產(chǎn)酶條件單因素實驗結果如圖3，菌株R - 4的結果如圖4。

表3 菌株初步鑒定結果

圖2 菌株個體形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strains

圖3 菌株2 -1產(chǎn)酶條件分析Fig.3 Single factor experiment results for strain 2 -1

菌株2 -1發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為0.5%酵母粉、氮源為1.0%氯化銨、0.4%氯化鈉、1.0%可溶性淀粉，當發(fā)酵溫度為40 ℃時酶活性最大，被確定為菌株2 -1的較佳培養(yǎng)條件。其最大酶活為127.65 U/mL。

圖4 菌株R - 4產(chǎn)酶條件分析Fig.4 Single factor experiment results for strain R - 4

菌株R - 4發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為0.5%酵母粉、氮源為1.0%氯化銨、0.1%氯化鈉以及1.5%可溶性淀粉，當發(fā)酵溫度為40 ℃時酶活性最大，被確定為菌株R - 4的較佳培養(yǎng)條件。其最大酶活為183.19 U/mL。

由圖3、圖4可以看出，培養(yǎng)基和環(huán)境條件對來自于土壤的菌株2 -1和來自于羅漢果的內(nèi)生菌R - 4的產(chǎn)淀粉酶的活性有較大影響。在單因素實驗條件下，羅漢果的內(nèi)生菌R - 4產(chǎn)酶活性最大為183.19U/mL，來自于土壤的菌株2 -1的產(chǎn)酶活性最大為127.65 U/mL。因此，選擇內(nèi)生菌R - 4進行產(chǎn)酶優(yōu)化條件選擇的正交試驗。

2.5 R - 4菌株產(chǎn)酶條件正交試驗結果分析

為了獲得內(nèi)生菌R - 4產(chǎn)酶更好的條件，根據(jù)圖4單因素實驗結果，固定碳源和氮源，選擇對產(chǎn)酶影響大的因素氯化鈉、可溶性淀粉和發(fā)酵溫度進行正交試驗。結果見表4。

表4 正交試驗結果與分析

表4結果顯示，各因素影響的順序為：ACB，即培養(yǎng)基中氯化鈉的含量對菌株產(chǎn)酶的影響最大，其次為可溶性淀粉的含量，最后是發(fā)酵溫度。極差分析優(yōu)化條件為A1B3C3，與表4中實驗號為3的條件一致。即優(yōu)化培養(yǎng)條件為氯化鈉0.05%、可溶性淀粉2.0%、發(fā)酵溫度40 ℃。

2.6 優(yōu)化培養(yǎng)條件驗證實驗結果

將內(nèi)生菌R - 4的菌懸液2 mL接種于裝液量為50 mL的最適發(fā)酵培養(yǎng)基中，即0.5%酵母粉、1.0%氯化銨、0.05%氯化鈉、2.0%可溶性淀粉， 40 ℃，120 r/min搖床發(fā)酵3 d，進行3次重復試驗，測定上清液中酶活為197.21 U/mL，顯示正交試驗結果的穩(wěn)定性良好。

3 結 論

本研究采用微生物純種分離技術，從羅漢果的根、莖、果實以及植株附近的土壤中分別分離到6株、5株、4株、8株微生物菌株。采用淀粉酶篩選培養(yǎng)基，從中分離篩選出產(chǎn)酶活性較高的兩株菌株，一株為來自于羅漢果根部的內(nèi)生菌R - 4；一株為來自于土壤的菌株2 -1。經(jīng)初步鑒定，菌株2 -1為球菌，菌株R - 4為芽孢桿菌，均為革蘭氏陽性菌。經(jīng)單因素實驗和正交試驗，獲得羅漢果的內(nèi)生菌R - 4產(chǎn)酶發(fā)酵的優(yōu)化培養(yǎng)基條件為0.5%酵母粉、1.0%氯化銨、0.05%氯化鈉、2.0%可溶性淀粉，在發(fā)酵溫度為40 ℃條件下、120 r/min搖床發(fā)酵3d，發(fā)酵液中α -淀粉酶的酶活為197.21 U/mL。來自于土壤的菌株2 -1優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件為：1.0%氯化銨、0.5%酵母粉、1.0%可溶性淀粉、0.4%氯化鈉，在40 ℃條件下，120 r/min搖床發(fā)酵3d，其發(fā)酵液中α -淀粉酶的酶活為127.65 U/mL。研究結果初步表明，羅漢果內(nèi)生菌中含有產(chǎn)淀粉酶的菌株，且產(chǎn)酶能力強于來自周圍土壤中的產(chǎn)酶菌株，但該菌株是否有其他作用，是否參與了羅漢果甜甙的代謝等尚需進一步的研究，R - 4內(nèi)生菌也需采用分子生物學手段進一步深入研究，鑒定其為何種細菌。

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(責任編輯：葉紅波)

Screening ofα-Amylase Producing Strains from Endophytic Bacteria inSiraitiagrosvenoriiand Its Surrounding Soil

ZHAO Fengli1,2, WU Ben1, ZHANG Changzhi1, FAN Caiqin1, SONG Yunfei3, YANG Wenguo3, CHEN Jing1

(1.CollegeofLifeScience,GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,China; 2.KeyLaboratoryofEcologyofRareandEndangeredSpeciesandEnvironmentalProtection,MinistryofEducation,Guilin541004,China; 3.GuilinLaynNaturalIngredientsCorp.,Guilin541199,China)

In this study, the screening of α -amylase producing strains from endophytic bacteria inSiraitiagrosvenoriiand surrounding soil were preformed, and the optimum fermentation conditions for α -amylase producing strains were performed. Our results showed that 15 strains were isolated from theSiraitiagrosvenoriand 8 strains from surrounding soil. High amylase producing strains 2 -1 (surrounding soil) and R - 4 (root endophytic bacteria) were isolated. The identification results showed that 2 -1 strain was staphylococcus and R - 4 strain was bacillus, which were gram positive bacteria. The appropriate condition of enzyme production for strains 2 -1 and R - 4 were determined. For strain 2 -1, the appropriate conditions were 1.0% ammonium chloride, 0.5% yeast powder, 1.0% soluble starch, 0.4% sodium chloride, fermentation temperature 40 ℃, and fermentation time 3 days and the enzyme production was 127.65 U/mL under these conditions. For strain R - 4, the appropriate conditions were 0.5% yeast powder, 1.0% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 2.0% soluble starch, fermentation temperature 40 ℃, and fermentation time 3 days, and the enzyme production was 197.21 U/mL under these conditions.

Siraitiagrosvenorii; endophytic bacteria; α -amylase; fermentation condition

10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.009

2095 -6002(2017)03 -0061 -05

趙豐麗，吳奔，張昌志，等. 羅漢果內(nèi)生菌及其周邊土壤中產(chǎn)α -淀粉酶菌株的篩選[J]. 食品科學技術學報，2017,35(3):61-65.

ZHAO Fengli, WU Ben, ZHANG Changzhi, et al. Screening of α -amylase producing strains from endophytic bacteria inSiraitiagrosvenoriiand its surrounding soil[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):61-65.

2016 -06 -29

桂林萊茵生物科技股份有限公司與廣西師范大學合作項目；廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(桂科重14121001 - 4 -3)。

趙豐麗，女，教授，主要從事功能性食品、發(fā)酵食品及生物活性成分等研究與開發(fā)工作。

TS201.3

A