利用12S rRNA基因標(biāo)記鑒定魚翅真?zhèn)?/h1>
2017-08-23 10:06:14黃婭琳
食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào) 2017年3期
黃婭琳
(南京森林警察學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 國(guó)家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心, 江蘇 南京 210023)
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利用12S rRNA基因標(biāo)記鑒定魚翅真?zhèn)?/p>
黃婭琳
(南京森林警察學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 國(guó)家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心, 江蘇 南京 210023)
為檢測(cè)魚翅樣本真?zhèn)渭磅忯~種屬，通過提取送檢魚翅、魚翅羹樣本DNA，擴(kuò)增其線粒體DNA上的用于動(dòng)物種屬鑒定的12S rRNA基因片段，并進(jìn)行DNA測(cè)序和序列分析，測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST搜索，與數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)物種序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，在送檢的23份樣本中，18份魚翅羹樣本、2份粉絲狀魚翅、1份翅狀魚翅中均未成功提取到DNA，未擴(kuò)增出目的基因片段，而從2份魚翅樣本中成功地提取到了基因組總DNA，并成功擴(kuò)增出了12S rRNA基因片段，這2份樣本的12S rRNA基因片段的堿基序列分別與黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)的同源性達(dá)到99%。對(duì)鑒定出含有鯊魚成分的2份樣本進(jìn)行高溫泡發(fā)處理，高溫泡發(fā)實(shí)驗(yàn)表明，1份樣本(22號(hào))有明膠析出。研究證實(shí)，12SrRNA基因序列測(cè)定技術(shù)能準(zhǔn)確、快速鑒定待檢樣本中是否含有鯊魚成分，結(jié)合高溫泡發(fā)時(shí)是否有明膠析出可綜合判定魚翅真?zhèn)巍?/p>
魚翅； 真?zhèn)危?12S rRNA； 基因標(biāo)記； 種屬鑒定
魚翅是由某些種類的鯊魚或鰩魚的胸鰭、背鰭和尾鰭部分經(jīng)過一系列加工而制成細(xì)絲狀軟骨的淡干品[1]。從鯊身體上割下的新鮮魚鰭經(jīng)去砂、去骨、干燥成片狀后稱為明翅，明翅煮后將細(xì)絲狀軟骨(翅筋)抽出，干燥成形后稱為翅餅[2]。近年來，魚翅越來越多地走進(jìn)了尋常百姓的餐桌，成為商業(yè)晚宴、大型聚會(huì)的必點(diǎn)菜肴。同時(shí)，在魚翅高昂價(jià)格的引誘下，各種造假和摻假魚翅應(yīng)運(yùn)而生，極大地?cái)_亂了市場(chǎng)秩序，侵害了消費(fèi)者的合法權(quán)益。目前我國(guó)對(duì)魚翅制品的鑒定還沒有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于魚翅的真假鑒別報(bào)道較少[3-5]，主要靠行業(yè)內(nèi)專家和正規(guī)酒樓的廚師根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)，通過眼看、手摸、口嘗的方法對(duì)魚翅的真假和優(yōu)劣進(jìn)行鑒別。利用DNA條形碼技術(shù)或基因分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)魚翅類食品中鯊魚成分國(guó)內(nèi)外也僅有較少文獻(xiàn)報(bào)道[2,4-11]，目前還沒有利用12S rRNA基因標(biāo)記鑒別魚翅真?zhèn)蔚膱?bào)道，本研究通過提取疑似魚翅樣本DNA，擴(kuò)增其線粒體DNA(mitochondrial DNA；mtDNA)上的12S rRNA基因片段，并對(duì)其進(jìn)行DNA序列分析，以確定魚翅樣本真?zhèn)渭磅忯~種屬，從而破獲一起惡劣的食品造假案。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備
本研究對(duì)浙江省消費(fèi)者權(quán)益保護(hù)委員會(huì)送檢的18份疑似魚翅羹樣本和5份疑似魚翅樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。18份疑似魚翅羹樣本分別編號(hào)1～18號(hào)，5份魚翅樣本分別編號(hào)19～23號(hào)，如圖1。
NanoDrop 2000型超微量蛋白核酸檢測(cè)儀，美國(guó)Thermo公司；Veriti型PCR儀，美國(guó)ABI公司；3130xl型測(cè)序儀，美國(guó)ABI公司；Micro17R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；GeneGenius型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)Syngene公司；電泳儀、電泳槽，美國(guó)Bio -Rad公司。DNA提取試劑盒，日本Takara公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，日本Takara公司；Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver. 3.1型DNA測(cè)序試劑盒，美國(guó)ABI公司。
圖1 送檢的疑似魚翅羹及魚翅樣本Fig.1 Suspected shark fin samples
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 樣本DNA的提取
從疑似魚翅羹中取粉絲狀樣本，用純凈水將其表面的油脂及佐料沖洗干凈，用干凈的吸水紙吸干表面水分后，剪取約30 mg置于1.5 mL EP管中；固狀疑似魚翅樣本剪取約20 mg 置于1.5 mL EP管中，將樣本剪碎。樣本基因組總DNA 均用DNA提取試劑盒(Takara公司)提取，提取方法參照試劑盒說明書。組織消化時(shí)間延長(zhǎng)為10 h。將樣品總DNA置于-20 ℃保存，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。
1.2.2 DNA濃度檢測(cè)及電泳檢測(cè)
吸取2 μL所提取的DNA溶液加到NanoDrop 2000型超微量蛋白核酸檢測(cè)儀的偵測(cè)臺(tái)上，根據(jù)所測(cè)得的OD260值計(jì)算DNA的濃度。對(duì)鑒定出含DNA的樣本進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳凝膠濃度為1.2%。
1.2.3 PCR擴(kuò)增
擴(kuò)增線粒體DNA上12S rRNA基因片段采用通用引物L(fēng)1091和H1478[12]，擴(kuò)增反應(yīng)在Veriti PCR 儀上進(jìn)行。12S rRNA基因片段采用以下反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積為25 μL，其中含2.5 pmol/μL引物各2 μL，2.5 mMdNTPs 2 μL，1.25 U Ex Taq酶0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，25 mM MgCl21.5 μL，10～20 ng/μL模板1～2 μL，其他為滅菌蒸餾水。上述反應(yīng)體系在94 ℃預(yù)變性3 min然后進(jìn)入如下循環(huán)：94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，以上一共38個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)(GENEGENUS)上檢測(cè)、成像。
1.2.4 PCR擴(kuò)增片段測(cè)序
PCR產(chǎn)物用PCR 產(chǎn)物(小量)純化試劑盒純化。以純化產(chǎn)物為模板DNA，用ABI公司測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序PCR擴(kuò)增(操作按試劑盒說明)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺變性后，上ABI公司3130xl測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。
1.2.5 BLAST搜索及序列對(duì)比
將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST搜索，并進(jìn)行同源性分析比對(duì)，以確定鯊魚種屬。
1.2.6 高溫泡發(fā)實(shí)驗(yàn)
一屆屆的學(xué)生與自己所在學(xué)校的校園建筑朝夕相處，難免每個(gè)人都會(huì)在學(xué)校的某個(gè)角落里，有著特別的記憶。一間教室、一間宿舍里都有可能有著一段難忘的回憶，但是這些故事情感與共鳴感的傳播只局限在當(dāng)事人的人際交往圈中，無法達(dá)到多個(gè)人際交往圈的重疊并產(chǎn)生更高程度上的情感共鳴。我們團(tuán)隊(duì)所做的校園漫游社交APP正是為此而生。團(tuán)隊(duì)旨在將這個(gè)APP建立成為一個(gè)情感寄托與聯(lián)系的平臺(tái)，為還在學(xué)校的以及已經(jīng)畢業(yè)的莘莘學(xué)子，創(chuàng)造一個(gè)記錄服務(wù)校園生活，分享交流對(duì)學(xué)校的情感，穩(wěn)固學(xué)生與學(xué)校的關(guān)系，建立牢固關(guān)系紐帶的一個(gè)記錄分享服務(wù)型平臺(tái)。
將含鯊魚成分的疑似魚翅樣本剪取約50 g放置到70 ℃清水中浸泡30 min后，觀察有無黏稠狀明膠溢出。
1.2.7 淀粉檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
將含鯊魚成分的疑似魚翅樣本剪取約50 g放置到70 ℃清水中浸泡30 min后，向浸泡液中滴入10%的碘溶液，觀察是否有藍(lán)色出現(xiàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 電泳檢測(cè)結(jié)果及分析
1～21號(hào)樣本通過超微量蛋白核酸檢測(cè)儀檢測(cè)，未檢測(cè)到DNA，表明其提取的基因組總DNA溶液中不含DNA或DNA含量低。22號(hào)、23號(hào)樣本的基因組總DNA的濃度分別為1 ng/μL和8 ng/μL。
由圖2可知，23號(hào)樣本DNA裂解液中檢測(cè)到基因組總DNA，22號(hào)樣本DNA裂解液通過瓊脂糖凝膠電泳未檢測(cè)到基因組總DNA，推測(cè)是由于22號(hào)樣本DNA含量過低的緣故，未達(dá)到瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)極限的緣故。
以22號(hào)和23號(hào)樣本基因組總DNA為模板，擴(kuò)增線粒體DNA上12S rRNA基因片段，結(jié)果如圖3。
M為DL2000 分子量標(biāo)記; 1列為23號(hào)樣本總DNA；2列為22號(hào)樣本總DNA。圖2 樣本基因組總DNA瓊脂糖電泳Fig.2 Electropherogram of genome total DNA
由圖3可見，檢材通過PCR，得到了清晰的PCR
M列為DL2000分子量標(biāo)記；1列為空白對(duì)照；2列為23號(hào)樣本PCR產(chǎn)物；3列為22號(hào)樣本PCR產(chǎn)物。圖3 12S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.3 Electropherogram of PCR product of 12S rRNA gene
產(chǎn)物(箭頭所示)，空白對(duì)照無擴(kuò)增產(chǎn)物。
將PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)3130xl測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，所得測(cè)序結(jié)果如圖4。
圖4 樣品的mtDNA 12S rRNA基因序列Fig.4 Sequence of mtDNA 12S rRNA
由圖4可知，22號(hào)和23號(hào)樣本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物分別為379 bp和400 bp的基因序列。擴(kuò)增產(chǎn)物序列經(jīng)BLAST搜索、同源性分析，發(fā)現(xiàn)22號(hào)和23號(hào)樣本DNA保守片段序列分別與黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)線粒體DNA 12S rRNA基因序列的部分片段的同源性均高達(dá)99%，比對(duì)結(jié)果如圖5和圖6。
Sbjct為黑邊鰭真鯊(Carcharhinus limbatus)12S rRNA基因部分序列；Query為22號(hào)樣本12S rRNA基因部分序列。圖5 黑邊鰭真鯊(Carcharhinus limbatus)和22號(hào)樣本12S rRNA基因序列比對(duì)Fig.5 Comparison of sample 22 sequence with 12S rRNA gene sequence of Carcharhinus limbatus
Sbjct為斜鋸牙鯊(Rhizoprionodon terraenovae)12S rRNA基因部分序列；Query為23號(hào)樣本12S rRNA基因部分序列。圖6 斜鋸牙鯊(Rhizoprionodon terraenovae)和23號(hào)樣本12S rRNA基因序列比對(duì)(截自NCBI/blast)Fig.6 Comparison of sample 23 sequence with 12S rRNA gene sequence of Rhizoprionodon terraenovae
由圖5和圖6可知，第22、23號(hào)送檢樣本的種屬來源分別被鑒定為黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)。高溫泡發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明22號(hào)樣本經(jīng)70 ℃清水浸泡30分鐘后，有大量黏稠透明狀明膠溢出，表明該樣本含有明膠成分，推測(cè)22號(hào)樣本是用鯊魚肉打成粉和明膠混合后仿制而成的仿翅針。23號(hào)樣本無明膠析出，表明不含明膠成分，向其熱水浸泡液中滴入10%的碘溶液后溶液未變成藍(lán)色，表明其中不含淀粉成分，因此23號(hào)樣本被鑒定為真魚翅。
3 討 論
仿制魚翅通常是以明膠、化學(xué)添加劑(淀粉配以一些色素)等作為主要原料制成，不含有鯊魚成分，其在口感和外觀等方面與天然的魚翅很相似。此外，也有將鯊魚肉料打成粉，并與明膠等混合可做成仿翅針，與真翅針形狀極為相似，價(jià)格卻比真翅針便宜很多[3]?，F(xiàn)在市場(chǎng)上許多地方出售的假魚翅產(chǎn)品制作工藝已經(jīng)相當(dāng)成熟，制作出的假魚翅已經(jīng)與真魚翅在外觀上很相近，無法從外形上辨別真?zhèn)?，故本研究利用DNA檢驗(yàn)技術(shù)，針對(duì)mtDNA上12S rRNA基因片段，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了高純度的目的基因片段。并利用GenBank上豐富的序列資源，通過BLAST搜索、同源性比對(duì)，確定本案送檢的22號(hào)、23號(hào)樣品中分別含有黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)成分。
本研究在基因位點(diǎn)的選擇上，選用了線粒體DNA上的12S rRNA基因位點(diǎn)，由于疑似魚翅檢材常經(jīng)過人工干燥或高溫烹飪，通過細(xì)胞核DNA是無法提取到符合鑒定需求長(zhǎng)度的DNA片段，通常高于200 bp以上的片段就無法擴(kuò)增出來，而線粒體DNA具有環(huán)狀雙鏈的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、在細(xì)胞中拷貝數(shù)多等優(yōu)點(diǎn)，非常適合降解、陳舊檢材的鑒定。此外，線粒體12S rRNA基因的進(jìn)化速率較快，不同物種間序列差異大，有利于設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)物種的高特異性引物，且擴(kuò)增該基因的穩(wěn)定性和可重復(fù)性好。12S rRNA基因是在種內(nèi)個(gè)體間的序列差異很小，而種間的序列差異卻較大的DNA 片段，正是物種鑒別的理想標(biāo)記。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank中有大量的12S rRNA基因片段比對(duì)序列資源，為未知物種的鑒定提供了極大的方便[13-14]。
本實(shí)驗(yàn)所檢的從各大餐館、酒樓購(gòu)買的魚翅羹樣本(1～18號(hào))、粉絲狀魚翅樣本(19～21號(hào))均不含鯊魚成分，為假魚翅樣本；22號(hào)為用鯊魚肉料打成粉，并與明膠等混合可做成的仿翅針，23號(hào)樣本不含明膠和淀粉成分，含有斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)成分，為真魚翅。本研究表明利用12S rRNA基因標(biāo)記技術(shù)結(jié)合高溫泡發(fā)實(shí)驗(yàn)?zāi)軠?zhǔn)確鑒定魚翅真?zhèn)?，為打擊不法商販和保證食品安全提供幫助。
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(責(zé)任編輯：李 寧)
Identification of Shark Fin Using 12S rRNA Gene Marker
HUANG Yalin
(NanjingForestPoliceCollege,Nanjing210023,China;WildlifeMaterialEvidenceAppraisalCenteroftheStateForestryAdministration,Nanjing210023,China)
To detect authenticity and species of 23 suspected shark fin samples. DNAs from either shark fin or shark fin derived soup were extracted, and then 12S rRNA gene of mitochondrial DNA that was special for animal species identification was amplified. PCR product was sequenced and homology comparison was deployed by BLAST search in GenBank database with related species sequences. The results showed that, among a total of 23 suspected shark fin samples, 18 soup -sourced, two vermicelli -like, and a fin -like one were failed to extract DNA or amplify target fragments, while the remaining two samples were successful to extract genome DNA and amplify the corresponding 12S rRNA gene fragments. Sequence analysis indicated nucleotide sequences of the 12S rRNA gene fragment from the two samples matched 99% identity toCarcharhinuslimbatusandRhizoprionodonterraenovae, respectively. For those samples containing shark components, high temperature soaking treatment was carried out. High temperature soaking treatment showed gelatin was precipitated in a sample (22#).These results indicated 12S rRNA gene sequence determination could accurately and quickly identify whether the samples contained shark ingredients. If combined with the high temperature soaking treatment to observe whether there was a gelatin precipitation, we can comprehensively judge the authenticity of shark’s fin.
shark fin; authenticity; 12S rRNA; gene marker; species identification
10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.010
2095 -6002(2017)03 -0066 -05
黃婭琳. 利用12S rRNA基因標(biāo)記鑒定魚翅真?zhèn)蝃J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(3):66-70.
HUANG Yalin. Identification of shark fin using 12S rRNA gene marker[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):66-70.
2016 -11 -17
中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(LGYB201518)。
黃婭琳，女，副教授，博士，主要從事野生動(dòng)物DNA鑒定及相關(guān)遺傳學(xué)方面的研究。
TS254.7
A
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黃婭琳
(南京森林警察學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 國(guó)家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心, 江蘇 南京 210023)
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黃婭琳
(南京森林警察學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 國(guó)家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心, 江蘇 南京 210023)
為檢測(cè)魚翅樣本真?zhèn)渭磅忯~種屬，通過提取送檢魚翅、魚翅羹樣本DNA，擴(kuò)增其線粒體DNA上的用于動(dòng)物種屬鑒定的12S rRNA基因片段，并進(jìn)行DNA測(cè)序和序列分析，測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST搜索，與數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)物種序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，在送檢的23份樣本中，18份魚翅羹樣本、2份粉絲狀魚翅、1份翅狀魚翅中均未成功提取到DNA，未擴(kuò)增出目的基因片段，而從2份魚翅樣本中成功地提取到了基因組總DNA，并成功擴(kuò)增出了12S rRNA基因片段，這2份樣本的12S rRNA基因片段的堿基序列分別與黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)的同源性達(dá)到99%。對(duì)鑒定出含有鯊魚成分的2份樣本進(jìn)行高溫泡發(fā)處理，高溫泡發(fā)實(shí)驗(yàn)表明，1份樣本(22號(hào))有明膠析出。研究證實(shí)，12SrRNA基因序列測(cè)定技術(shù)能準(zhǔn)確、快速鑒定待檢樣本中是否含有鯊魚成分，結(jié)合高溫泡發(fā)時(shí)是否有明膠析出可綜合判定魚翅真?zhèn)巍?/p>
魚翅； 真?zhèn)危?12S rRNA； 基因標(biāo)記； 種屬鑒定
魚翅是由某些種類的鯊魚或鰩魚的胸鰭、背鰭和尾鰭部分經(jīng)過一系列加工而制成細(xì)絲狀軟骨的淡干品[1]。從鯊身體上割下的新鮮魚鰭經(jīng)去砂、去骨、干燥成片狀后稱為明翅，明翅煮后將細(xì)絲狀軟骨(翅筋)抽出，干燥成形后稱為翅餅[2]。近年來，魚翅越來越多地走進(jìn)了尋常百姓的餐桌，成為商業(yè)晚宴、大型聚會(huì)的必點(diǎn)菜肴。同時(shí)，在魚翅高昂價(jià)格的引誘下，各種造假和摻假魚翅應(yīng)運(yùn)而生，極大地?cái)_亂了市場(chǎng)秩序，侵害了消費(fèi)者的合法權(quán)益。目前我國(guó)對(duì)魚翅制品的鑒定還沒有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于魚翅的真假鑒別報(bào)道較少[3-5]，主要靠行業(yè)內(nèi)專家和正規(guī)酒樓的廚師根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)，通過眼看、手摸、口嘗的方法對(duì)魚翅的真假和優(yōu)劣進(jìn)行鑒別。利用DNA條形碼技術(shù)或基因分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)魚翅類食品中鯊魚成分國(guó)內(nèi)外也僅有較少文獻(xiàn)報(bào)道[2,4-11]，目前還沒有利用12S rRNA基因標(biāo)記鑒別魚翅真?zhèn)蔚膱?bào)道，本研究通過提取疑似魚翅樣本DNA，擴(kuò)增其線粒體DNA(mitochondrial DNA；mtDNA)上的12S rRNA基因片段，并對(duì)其進(jìn)行DNA序列分析，以確定魚翅樣本真?zhèn)渭磅忯~種屬，從而破獲一起惡劣的食品造假案。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備
本研究對(duì)浙江省消費(fèi)者權(quán)益保護(hù)委員會(huì)送檢的18份疑似魚翅羹樣本和5份疑似魚翅樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。18份疑似魚翅羹樣本分別編號(hào)1～18號(hào)，5份魚翅樣本分別編號(hào)19～23號(hào)，如圖1。
NanoDrop 2000型超微量蛋白核酸檢測(cè)儀，美國(guó)Thermo公司；Veriti型PCR儀，美國(guó)ABI公司；3130xl型測(cè)序儀，美國(guó)ABI公司；Micro17R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；GeneGenius型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)Syngene公司；電泳儀、電泳槽，美國(guó)Bio -Rad公司。DNA提取試劑盒，日本Takara公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，日本Takara公司；Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver. 3.1型DNA測(cè)序試劑盒，美國(guó)ABI公司。
圖1 送檢的疑似魚翅羹及魚翅樣本Fig.1 Suspected shark fin samples
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 樣本DNA的提取
從疑似魚翅羹中取粉絲狀樣本，用純凈水將其表面的油脂及佐料沖洗干凈，用干凈的吸水紙吸干表面水分后，剪取約30 mg置于1.5 mL EP管中；固狀疑似魚翅樣本剪取約20 mg 置于1.5 mL EP管中，將樣本剪碎。樣本基因組總DNA 均用DNA提取試劑盒(Takara公司)提取，提取方法參照試劑盒說明書。組織消化時(shí)間延長(zhǎng)為10 h。將樣品總DNA置于-20 ℃保存，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。
1.2.2 DNA濃度檢測(cè)及電泳檢測(cè)
吸取2 μL所提取的DNA溶液加到NanoDrop 2000型超微量蛋白核酸檢測(cè)儀的偵測(cè)臺(tái)上，根據(jù)所測(cè)得的OD260值計(jì)算DNA的濃度。對(duì)鑒定出含DNA的樣本進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳凝膠濃度為1.2%。
1.2.3 PCR擴(kuò)增
擴(kuò)增線粒體DNA上12S rRNA基因片段采用通用引物L(fēng)1091和H1478[12]，擴(kuò)增反應(yīng)在Veriti PCR 儀上進(jìn)行。12S rRNA基因片段采用以下反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積為25 μL，其中含2.5 pmol/μL引物各2 μL，2.5 mMdNTPs 2 μL，1.25 U Ex Taq酶0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，25 mM MgCl21.5 μL，10～20 ng/μL模板1～2 μL，其他為滅菌蒸餾水。上述反應(yīng)體系在94 ℃預(yù)變性3 min然后進(jìn)入如下循環(huán)：94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，以上一共38個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)(GENEGENUS)上檢測(cè)、成像。
1.2.4 PCR擴(kuò)增片段測(cè)序
PCR產(chǎn)物用PCR 產(chǎn)物(小量)純化試劑盒純化。以純化產(chǎn)物為模板DNA，用ABI公司測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序PCR擴(kuò)增(操作按試劑盒說明)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺變性后，上ABI公司3130xl測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。
1.2.5 BLAST搜索及序列對(duì)比
將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST搜索，并進(jìn)行同源性分析比對(duì)，以確定鯊魚種屬。
1.2.6 高溫泡發(fā)實(shí)驗(yàn)
一屆屆的學(xué)生與自己所在學(xué)校的校園建筑朝夕相處，難免每個(gè)人都會(huì)在學(xué)校的某個(gè)角落里，有著特別的記憶。一間教室、一間宿舍里都有可能有著一段難忘的回憶，但是這些故事情感與共鳴感的傳播只局限在當(dāng)事人的人際交往圈中，無法達(dá)到多個(gè)人際交往圈的重疊并產(chǎn)生更高程度上的情感共鳴。我們團(tuán)隊(duì)所做的校園漫游社交APP正是為此而生。團(tuán)隊(duì)旨在將這個(gè)APP建立成為一個(gè)情感寄托與聯(lián)系的平臺(tái)，為還在學(xué)校的以及已經(jīng)畢業(yè)的莘莘學(xué)子，創(chuàng)造一個(gè)記錄服務(wù)校園生活，分享交流對(duì)學(xué)校的情感，穩(wěn)固學(xué)生與學(xué)校的關(guān)系，建立牢固關(guān)系紐帶的一個(gè)記錄分享服務(wù)型平臺(tái)。
將含鯊魚成分的疑似魚翅樣本剪取約50 g放置到70 ℃清水中浸泡30 min后，觀察有無黏稠狀明膠溢出。
1.2.7 淀粉檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
將含鯊魚成分的疑似魚翅樣本剪取約50 g放置到70 ℃清水中浸泡30 min后，向浸泡液中滴入10%的碘溶液，觀察是否有藍(lán)色出現(xiàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 電泳檢測(cè)結(jié)果及分析
1～21號(hào)樣本通過超微量蛋白核酸檢測(cè)儀檢測(cè)，未檢測(cè)到DNA，表明其提取的基因組總DNA溶液中不含DNA或DNA含量低。22號(hào)、23號(hào)樣本的基因組總DNA的濃度分別為1 ng/μL和8 ng/μL。
由圖2可知，23號(hào)樣本DNA裂解液中檢測(cè)到基因組總DNA，22號(hào)樣本DNA裂解液通過瓊脂糖凝膠電泳未檢測(cè)到基因組總DNA，推測(cè)是由于22號(hào)樣本DNA含量過低的緣故，未達(dá)到瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)極限的緣故。
以22號(hào)和23號(hào)樣本基因組總DNA為模板，擴(kuò)增線粒體DNA上12S rRNA基因片段，結(jié)果如圖3。
M為DL2000 分子量標(biāo)記; 1列為23號(hào)樣本總DNA；2列為22號(hào)樣本總DNA。圖2 樣本基因組總DNA瓊脂糖電泳Fig.2 Electropherogram of genome total DNA
由圖3可見，檢材通過PCR，得到了清晰的PCR
M列為DL2000分子量標(biāo)記；1列為空白對(duì)照；2列為23號(hào)樣本PCR產(chǎn)物；3列為22號(hào)樣本PCR產(chǎn)物。圖3 12S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.3 Electropherogram of PCR product of 12S rRNA gene
產(chǎn)物(箭頭所示)，空白對(duì)照無擴(kuò)增產(chǎn)物。
將PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)3130xl測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，所得測(cè)序結(jié)果如圖4。
圖4 樣品的mtDNA 12S rRNA基因序列Fig.4 Sequence of mtDNA 12S rRNA
由圖4可知，22號(hào)和23號(hào)樣本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物分別為379 bp和400 bp的基因序列。擴(kuò)增產(chǎn)物序列經(jīng)BLAST搜索、同源性分析，發(fā)現(xiàn)22號(hào)和23號(hào)樣本DNA保守片段序列分別與黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)線粒體DNA 12S rRNA基因序列的部分片段的同源性均高達(dá)99%，比對(duì)結(jié)果如圖5和圖6。
Sbjct為黑邊鰭真鯊(Carcharhinus limbatus)12S rRNA基因部分序列；Query為22號(hào)樣本12S rRNA基因部分序列。圖5 黑邊鰭真鯊(Carcharhinus limbatus)和22號(hào)樣本12S rRNA基因序列比對(duì)Fig.5 Comparison of sample 22 sequence with 12S rRNA gene sequence of Carcharhinus limbatus
Sbjct為斜鋸牙鯊(Rhizoprionodon terraenovae)12S rRNA基因部分序列；Query為23號(hào)樣本12S rRNA基因部分序列。圖6 斜鋸牙鯊(Rhizoprionodon terraenovae)和23號(hào)樣本12S rRNA基因序列比對(duì)(截自NCBI/blast)Fig.6 Comparison of sample 23 sequence with 12S rRNA gene sequence of Rhizoprionodon terraenovae
由圖5和圖6可知，第22、23號(hào)送檢樣本的種屬來源分別被鑒定為黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)。高溫泡發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明22號(hào)樣本經(jīng)70 ℃清水浸泡30分鐘后，有大量黏稠透明狀明膠溢出，表明該樣本含有明膠成分，推測(cè)22號(hào)樣本是用鯊魚肉打成粉和明膠混合后仿制而成的仿翅針。23號(hào)樣本無明膠析出，表明不含明膠成分，向其熱水浸泡液中滴入10%的碘溶液后溶液未變成藍(lán)色，表明其中不含淀粉成分，因此23號(hào)樣本被鑒定為真魚翅。
3 討 論
仿制魚翅通常是以明膠、化學(xué)添加劑(淀粉配以一些色素)等作為主要原料制成，不含有鯊魚成分，其在口感和外觀等方面與天然的魚翅很相似。此外，也有將鯊魚肉料打成粉，并與明膠等混合可做成仿翅針，與真翅針形狀極為相似，價(jià)格卻比真翅針便宜很多[3]?，F(xiàn)在市場(chǎng)上許多地方出售的假魚翅產(chǎn)品制作工藝已經(jīng)相當(dāng)成熟，制作出的假魚翅已經(jīng)與真魚翅在外觀上很相近，無法從外形上辨別真?zhèn)?，故本研究利用DNA檢驗(yàn)技術(shù)，針對(duì)mtDNA上12S rRNA基因片段，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了高純度的目的基因片段。并利用GenBank上豐富的序列資源，通過BLAST搜索、同源性比對(duì)，確定本案送檢的22號(hào)、23號(hào)樣品中分別含有黑邊鰭真鯊(Carcharhinuslimbatus)、斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)成分。
本研究在基因位點(diǎn)的選擇上，選用了線粒體DNA上的12S rRNA基因位點(diǎn)，由于疑似魚翅檢材常經(jīng)過人工干燥或高溫烹飪，通過細(xì)胞核DNA是無法提取到符合鑒定需求長(zhǎng)度的DNA片段，通常高于200 bp以上的片段就無法擴(kuò)增出來，而線粒體DNA具有環(huán)狀雙鏈的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、在細(xì)胞中拷貝數(shù)多等優(yōu)點(diǎn)，非常適合降解、陳舊檢材的鑒定。此外，線粒體12S rRNA基因的進(jìn)化速率較快，不同物種間序列差異大，有利于設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)物種的高特異性引物，且擴(kuò)增該基因的穩(wěn)定性和可重復(fù)性好。12S rRNA基因是在種內(nèi)個(gè)體間的序列差異很小，而種間的序列差異卻較大的DNA 片段，正是物種鑒別的理想標(biāo)記。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank中有大量的12S rRNA基因片段比對(duì)序列資源，為未知物種的鑒定提供了極大的方便[13-14]。
本實(shí)驗(yàn)所檢的從各大餐館、酒樓購(gòu)買的魚翅羹樣本(1～18號(hào))、粉絲狀魚翅樣本(19～21號(hào))均不含鯊魚成分，為假魚翅樣本；22號(hào)為用鯊魚肉料打成粉，并與明膠等混合可做成的仿翅針，23號(hào)樣本不含明膠和淀粉成分，含有斜鋸牙鯊(Rhizoprionodonterraenovae)成分，為真魚翅。本研究表明利用12S rRNA基因標(biāo)記技術(shù)結(jié)合高溫泡發(fā)實(shí)驗(yàn)?zāi)軠?zhǔn)確鑒定魚翅真?zhèn)?，為打擊不法商販和保證食品安全提供幫助。
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(責(zé)任編輯：李 寧)
Identification of Shark Fin Using 12S rRNA Gene Marker
HUANG Yalin
(NanjingForestPoliceCollege,Nanjing210023,China;WildlifeMaterialEvidenceAppraisalCenteroftheStateForestryAdministration,Nanjing210023,China)
To detect authenticity and species of 23 suspected shark fin samples. DNAs from either shark fin or shark fin derived soup were extracted, and then 12S rRNA gene of mitochondrial DNA that was special for animal species identification was amplified. PCR product was sequenced and homology comparison was deployed by BLAST search in GenBank database with related species sequences. The results showed that, among a total of 23 suspected shark fin samples, 18 soup -sourced, two vermicelli -like, and a fin -like one were failed to extract DNA or amplify target fragments, while the remaining two samples were successful to extract genome DNA and amplify the corresponding 12S rRNA gene fragments. Sequence analysis indicated nucleotide sequences of the 12S rRNA gene fragment from the two samples matched 99% identity toCarcharhinuslimbatusandRhizoprionodonterraenovae, respectively. For those samples containing shark components, high temperature soaking treatment was carried out. High temperature soaking treatment showed gelatin was precipitated in a sample (22#).These results indicated 12S rRNA gene sequence determination could accurately and quickly identify whether the samples contained shark ingredients. If combined with the high temperature soaking treatment to observe whether there was a gelatin precipitation, we can comprehensively judge the authenticity of shark’s fin.
shark fin; authenticity; 12S rRNA; gene marker; species identification
10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.010
2095 -6002(2017)03 -0066 -05
黃婭琳. 利用12S rRNA基因標(biāo)記鑒定魚翅真?zhèn)蝃J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(3):66-70.
HUANG Yalin. Identification of shark fin using 12S rRNA gene marker[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):66-70.
2016 -11 -17
中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(LGYB201518)。
黃婭琳，女，副教授，博士，主要從事野生動(dòng)物DNA鑒定及相關(guān)遺傳學(xué)方面的研究。
TS254.7
A
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