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    高靈敏甲胎蛋白夾心免疫傳感器的制備

    2017-08-14 22:18王雪李鵬君邱萍王小磊
    分析化學(xué) 2017年8期
    關(guān)鍵詞:甲胎蛋白

    王雪+李鵬君+邱萍+王小磊

    摘 要 構(gòu)建了新型甲胎蛋白(AFP)夾心免疫傳感器。采用金納米粒子-氧化石墨烯-普魯士藍(lán)納米立方體(AuNP-GO-PBNCs)納米復(fù)合材料標(biāo)記甲胎蛋白(AFP)二抗,將制備的金-聚多巴胺-四氧化三鐵(Au-PDA-Fe3O4)磁性納米復(fù)合物固定在自制的磁性電極表面,通過(guò)吸附作用固定AFP一抗,用牛血清白蛋白(BSA)封閉電極上的非特異性吸附位點(diǎn)。在37℃下與AFP抗原溶液孵育50 min,最后將電極放入AuNP-GO-PBNCs納米復(fù)合材料標(biāo)記的二抗溶液中孵育,基于此建立了采用普魯士藍(lán)(PB)標(biāo)記的的夾心免疫傳感器檢測(cè)AFP的方法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,PB催化H2O2氧化的響應(yīng)電流與AFP的濃度表現(xiàn)出兩段線性關(guān)系,線性范圍分別為0.005~1.000 ng/mL和1~20 ng/mL, 檢出限(LOD, S/N=3)為1.0 pg/mL。本方法具有靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn)。

    關(guān)鍵詞 金納米粒子; 氧化石墨烯; 甲胎蛋白; 普魯士藍(lán); 夾心免疫傳感器

    1 引 言

    甲胎蛋白(AFP)是臨床診斷中常用的特異性的腫瘤標(biāo)志物,對(duì)原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要的臨床意義。目前,檢測(cè)血清中甲胎蛋白主要采用放射免疫法、電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法等[1~5]。放射免疫法檢測(cè)AFP能達(dá)到納克水平,但存在放射性污染; 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)速度快,但檢測(cè)成本比酶聯(lián)免疫法高; 化學(xué)發(fā)光法技術(shù)較為成熟,但是檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng); 酶聯(lián)免疫法(ELISA)具有簡(jiǎn)單、靈敏、特異、快速及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn),在生物工程[6]、臨床診斷[7~9]、藥物及環(huán)境分析[10~12]等方面應(yīng)用廣泛。ELISA法通常采用酶標(biāo)記抗體(或者抗原),標(biāo)記酶通常是分子量小、易制備的辣根過(guò)氧化酶(HRP)[7,12~14]。然而,HRP的本質(zhì)是蛋白質(zhì),使用過(guò)程中存在易失活的問(wèn)題。

    為了克服HRP等標(biāo)記酶易失活的缺點(diǎn),很多具有優(yōu)良類過(guò)氧化酶催化活性的納米材料被應(yīng)用于ELISA檢測(cè)方法中[8~10],其中普魯士藍(lán)(PB)具有獨(dú)特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具備穩(wěn)定性好且制備成本低的優(yōu)點(diǎn)。另外,它還具有優(yōu)良的電化學(xué)可逆性,作為電子轉(zhuǎn)移媒介體,對(duì)過(guò)氧化氫表現(xiàn)出良好的電催化能力[15]。使用PB代替常規(guī)酶蛋白標(biāo)記抗體或抗原,可以克服現(xiàn)有酶標(biāo)記方法操作繁瑣、成本高、酶容易失活等缺陷。石墨烯具有導(dǎo)電性強(qiáng)、比表面積大、成本低等優(yōu)點(diǎn)[16~19]。將石墨烯做為PB的載體,可大大提高PB的負(fù)載量; 此外,它可以增加普魯士藍(lán)的穩(wěn)定性[20]。Fe3O4磁性納米材料具有良好的超順磁性、低毒性和生物兼容性,在生物催化、生物標(biāo)記等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[21~24]。磁性納米材料具有大的表面Gibbs自由能,可以降低體系的能量,化學(xué)穩(wěn)定性高。

    本研究制備了氧化石墨烯/普魯士藍(lán)(GO-PBNCs)復(fù)合物,用聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)功能化的帶正電的GO-PBNCs吸附帶負(fù)電的金納米粒子(AuNPs),制得AuNP-GO-PBNCs納米復(fù)合材料,用此納米復(fù)合材料標(biāo)記AFP二抗(Ab2)。另外合成了磁性Fe3O4立方體,基于多巴胺(DA)與HAuCl4·4H2O反應(yīng)可生成聚多巴胺(PDA) 及金納米粒子,采用原位化學(xué)氧化聚合的方法制得Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合物。利用磁性將Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合物固定在自制的磁性電極表面后[25],吸附固定anti-AFP,制備檢測(cè)AFP的磁性傳感電極。將此傳感電極與含有AFP抗原的樣品孵育; 再將已結(jié)合AFP抗原的電極與AuNP-GO-PBNCs納米復(fù)合材料標(biāo)記的二抗孵育,測(cè)定電極的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。制備的以普魯士藍(lán)為標(biāo)記物的夾心免疫傳感器具有靈敏度高、檢出限低和穩(wěn)定性好的特性,在生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷等方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    Quanta 200掃描電子顯微鏡(SEM,,美國(guó)FEI公司); UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司); X-射線衍射儀 (XRD, 英國(guó)Bede公司); Autolab PGSTAT30/FRA2 電化學(xué)工作站(瑞士Metrohm公司)。采用三電極工作系統(tǒng),修飾的磁性玻碳電極(MGCE)作為工作電極,飽和甘汞電極(SCE) 作為參比電極,鉑絲電極作為對(duì)電極(CE)。

    甲胎蛋白(AFP)、anti-AFP(博賽生物有限公司); 天然石墨片(99.8%,325目)、多巴胺(DA,99%)(Alfa Aesar公司); 氯金酸(HAuCl4·4H2O,99.8% )、牛血清白蛋白(BSA,≥98%) (Sigma公司)。以0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 5.91)為支持電解質(zhì)溶液。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,使用前未經(jīng)進(jìn)一步處理。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(≥18 MΩ cm)。

    2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合材料的制備

    根據(jù)文獻(xiàn)[26]制備磁性Fe3O4納米立方體。將Fe3O4納米立方體加入到1.0 mL PBS緩沖溶液中,濃度為0.5 mg/mL,在4℃劇烈攪拌條件下,加入500 μL 60 mmol/L (過(guò)量)多巴胺,再逐滴加入300 μL 2%(m/V) HAuCl4溶液,繼續(xù)攪拌30 min,得到Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合材料。

    2.2.2 Ab2-AuNP-GO-PBNCs生物復(fù)合材料的制備 采用Hummers方法合成氧化石墨烯(GO) [27,28]。在超聲條件下,用水將GO稀釋成1 mg/mL的懸浮液。取5 mL加入圓底燒瓶中,再加入0.2 mL 5 mmol/L FeCl3-K3[Fe(CN)6](pH 1.6),置于30℃水浴中攪拌反應(yīng)2 h,溶液顏色由黃棕色變?yōu)樯钏{(lán)綠色,即得GO-PBNCs復(fù)合物。離心,用水清洗沉淀,再離心,至上清液為無(wú)色。如圖 1A 所示,在超聲條件下,將制得的GO-PBNCs復(fù)合材料加入到含0.625 mol/L KCl和1.25 mg/mL PDDA溶液中,繼續(xù)超聲處理3 h,離心清洗后,得到PDDA@GO-PB NCs復(fù)合材料,然后將其分散到5 mL 水中。根據(jù)文獻(xiàn)[29]方法制得AuNPs,在超聲條件下向10 mL AuNPs溶液中加入0.5 mL制得的PDDA@GO-PB NCs復(fù)合材料,放置過(guò)夜,次日離心,清洗后,將其分散在1 mL PBS緩沖溶液中,加入150 μL 2.0 μg/mL Ab2,在4℃下反應(yīng)12 h后,離心,用100 μL 1%(w/w) BSA封閉,得到Ab2-AuNP-GO-PBNCs復(fù)合材料。離心,沉淀分散在1 mL PBS溶液中,待用。

    2.2.3 制備修飾電極及檢測(cè)AFP 依據(jù)文獻(xiàn)[30]制備磁性玻碳電極(MGCE)。將10 mg石墨粉和1.2 mL石蠟油混合均勻,調(diào)成碳糊,然后將適量碳糊填入長(zhǎng)50 mm、直徑3 mm聚四氟乙烯管中,將銅絲插在聚四氟乙烯管的一端,將一個(gè)厚2 mm、直徑3 mm的圓形磁鐵(其表面可產(chǎn)生0.2 T的非均勻磁場(chǎng))放在距離管口約2 mm處的另一端,再在管口處放進(jìn)一個(gè)厚2 mm、直徑3 mm的玻碳,將磁鐵與玻碳緊緊連在一起,并將玻碳的邊沿用膠密封起來(lái),即得到磁性玻碳電極。

    將制備好的MGCE依次用1.0、0.3 和0.05 μm的Al2O3在麂皮上拋光至鏡面后,再依次用超純水、無(wú)水乙醇、0.1 mol/L HNO3、超純水超聲清洗,氮?dú)獯蹈?。吸? μL Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合材料懸浮液,小心滴涂在MGCE表面,在磁場(chǎng)的作用下,電極表面緊緊固定一層Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合材料,室溫下自然干燥,制得Au-PDA-Fe3O4修飾的MGCE。將已修飾好的MGCE浸入AFP一抗溶液中,在4℃條件下過(guò)夜。在室溫下,將電極浸入1% BSA溶液中約1 h,封閉電極上的非特異性吸附位點(diǎn),即制得免疫傳感器。將制備好的傳感器分別浸入到不同濃度的AFP溶液中孵育50 min,吸取10 μL Ab2-AuNP-GO-PBNCs溶液,小心滴涂到修飾好的電極上,放置約1 h后,再用PBS緩沖液漂洗。將修飾好的電極浸入在含有1 mmol/L H2O2的PBS溶液(pH 5.91)中,采用差分脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行檢測(cè),免疫傳感器的制備以及檢測(cè)過(guò)程如圖1B所示。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 GO-PBNCs與AuNP-GO-PBNCs復(fù)合材料的表征

    由GO-PBNCs的掃描電鏡圖(圖2A)可見(jiàn),大小均一的PBNCs附著在片狀的石墨烯表面; 用帶正電的PDDA功能化并吸附帶負(fù)電的AuNPs,其表面附著了一層均勻的Au NPs(圖2B)。UV-vis表征結(jié)果如圖2C所示,曲線a是GO的吸收光譜, 230 nm處的吸收對(duì)應(yīng)C=C雙鍵的π-π*躍遷[29]; 曲線b是GO-PBNCs復(fù)合物的吸收光譜,由于催化還原Fe3+,GO表面的電子密度發(fā)生了轉(zhuǎn)移,所以在230 nm處沒(méi)有明顯的吸收。而由于PB中的Fe2+與Fe3+的電荷轉(zhuǎn)移[28],GO-PBNCs復(fù)合物約在740 nm處出現(xiàn)了一個(gè)寬峰,說(shuō)明在GO上成功生成PB[31]。曲線c在530 nm處有一吸收峰,為AuNPs的特征峰[32],這是由于用PDDA功能化后的GO-PBNCs復(fù)合物帶正電,并吸附了帶負(fù)電的AuNPs后,這進(jìn)一步證實(shí)已成功合成AuNP-GO-PBNCs復(fù)合材料,上述結(jié)果與電鏡表征結(jié)果相一致。

    3.2 Fe3O4與Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合材料的表征

    掃描電子顯微鏡(SEM)表征結(jié)果(圖3A)顯示,制備的Fe3O4的平均粒徑為30 nm,顆粒大小均勻。圖3B是Au-PDA-Fe3O4復(fù)合納米粒子的SEM圖像,未觀察到Fe3O4立方體粒子,這可能是由于利用多巴胺原位合成金納米粒子時(shí), Fe3O4納米立方體被包裹在內(nèi)部。圖3C是Fe3O4納米立方體和Au-PDA-Fe3O4的UV-Vis圖譜,F(xiàn)e3O4納米立方體沒(méi)有明顯的紫外吸收(曲線a); 曲線b是PDA的紫外吸收?qǐng)D譜,在280 nm出現(xiàn)了多巴胺的特征吸收[33]; 曲線c在530 nm處出現(xiàn)了金納米顆粒的特征吸收峰,表明在Fe3O4納米立方體表面確實(shí)形成了金納米層[34],與電鏡的表征結(jié)果(圖3B)一致。

    圖4為Fe3O4納米立方體和Au-PDA-Fe3O4的XRD圖譜。在圖4a上可見(jiàn)2θ=30.2°(220)、35.5°(311)、43.2°(400)、53.6°(422)、57.08°(511)和62.9°(440)等處的衍射峰,與ASTM標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)卡片中Fe3O4圖相吻合,表明合成的物質(zhì)是立方尖晶石結(jié)構(gòu)的Fe3O4[35]。圖4b顯示,Au-PDA-Fe3O4復(fù)合物產(chǎn)物在2θ=38.1°、44.4°、64.6°和77.6°等處出現(xiàn)了清晰的特征衍射峰,分別對(duì)應(yīng)于Au (111)、(200)、(220)和(311)晶面,表明產(chǎn)物表面已經(jīng)覆蓋了一層金納米粒子[36]。另外,因?yàn)锳u是重金屬元素,且前文提到Fe3O4的外表面覆蓋了一層金,而Fe3O4的衍射峰相對(duì)Au的衍射峰太弱,因此很難觀測(cè)到。插圖是在外磁場(chǎng)條件下拍攝的,F(xiàn)e3O4懸浮液呈黑色,且均勻分散,若將一塊磁鐵放置在該懸浮液的一側(cè),施加磁場(chǎng),所有的Fe3O4立即聚沉,上清液則澄清透明。以上結(jié)果充分表明,F(xiàn)e3O4納米立方體具有良好的超順磁性,在外加磁場(chǎng)的作用下,可以將其固定在磁性玻碳電極(MGCE)表面[37,38]。

    3.3 修飾電極的電化學(xué)行為

    圖5A是在含有探針?lè)肿覽Fe(CN)6]3/4 (5.0 mmol/L)的電解質(zhì)溶液中,不同的修飾電極的交流阻抗復(fù)平面圖。曲線a為裸電極阻抗圖,在所有頻率范圍內(nèi)幾乎呈一條直線,表明探針?lè)肿臃浅H菀椎竭_(dá)MGCE電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng),這一電化學(xué)過(guò)程是受擴(kuò)散控制的。當(dāng)在MGCE電極表面固定Fe3O4-PDA-Au時(shí), Fe3O4-PDA-Au阻礙了探針?lè)肿酉螂姌O表面的擴(kuò)散,曲線在高頻區(qū)出現(xiàn)一個(gè)顯著的半圓,半圓直徑對(duì)應(yīng)于電極的電子傳遞阻抗(Rct),約145 Ω(曲線b)。Fe3O4-PDA-Au修飾電極吸附anti-AFP后(曲線c), Rct增大,表明anti-AFP已成功吸附在電極MGCE/Fe3O4-PDA-Au上。用BSA封閉MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP 上的非特異性吸附位點(diǎn)即得MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA (曲線d),再與AFP孵育發(fā)生免疫反應(yīng)后得到MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA /AFP (曲線e),Rct逐漸增大,這證明AFP與anti-AFP發(fā)生了免疫反應(yīng)后,成功組裝在A修飾電極表面上,也證明了Fe3O4-PDA-Au可以保持anti-AFP的生物活性。然而,當(dāng)MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA /AFP進(jìn)一步與GO-PB-Au NPs-Ab2孵育后(曲線f),Rct相對(duì)發(fā)生免疫反應(yīng)后減小,這是由于GO和Au NPs具有很好的導(dǎo)電性,從而使得探針?lè)肿幽軌蜉^容易的到達(dá)電極表面。

    電壓在0.2~0.5 V范圍內(nèi),掃描速度為50 mV/s,對(duì)不同修飾電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(圖5B)。PDA-Au/anti-AFP/BSA/AFP修飾電極未出現(xiàn)明顯的循環(huán)伏安峰,當(dāng)電極修飾Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA/AFP后,背景電流顯著增大,說(shuō)明Fe3O4具有很強(qiáng)的導(dǎo)電性,起到增加電流的響應(yīng)信號(hào)的作用; 當(dāng)進(jìn)一步孵育GO-PB-Au NPs-Ab2后,出現(xiàn)了一對(duì)對(duì)稱的氧化還原峰,這是因?yàn)镻B是很好的氧化還原活性分子,當(dāng)在支持電解質(zhì)溶液中加入1 mmol/L H2O2后,還原峰電流明顯增大。因此,PB不僅起到了電子介體的作用,而且可作為一種“人工過(guò)氧化酶”,起到了電催化的作用。

    3.4 孵化時(shí)間和溫度的影響

    對(duì)免疫孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),響應(yīng)電流也隨之增大,當(dāng)孵育時(shí)間超過(guò)50 min后,響應(yīng)電流信號(hào)基本保持不變,這表明當(dāng)孵育時(shí)間大于50 min時(shí),電極上結(jié)合的AFP達(dá)到飽和,因此選擇50 min為最佳孵育時(shí)間。

    溫度也是影響免疫反應(yīng)和抗原抗體穩(wěn)定性的重要因素。在15~50℃范圍內(nèi),免疫傳感器的電流響應(yīng)信號(hào)隨著溫度的升高而先增大后降低,在37℃時(shí)達(dá)到最大,這是因?yàn)闇囟鹊纳哂欣谔岣呖乖c抗體的反應(yīng)。而溫度過(guò)高時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致抗原與抗體的蛋白分子變性,結(jié)合活性降低,使得組裝上的GO-PB-AuNPs-Ab2減少,從而相應(yīng)的PB及催化H2O2的響應(yīng)電流減小。因此選擇37℃為最佳測(cè)定溫度。

    3.5 免疫傳感器的安培響應(yīng)

    在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,采用DPV檢測(cè)不同濃度AFP的結(jié)果如圖6所示。在不同濃度的AFP存在下,傳感器的電流響應(yīng)信號(hào)表現(xiàn)出兩段線性關(guān)系,線性范圍分別為 0.005~1.000 ng/mL和1~20 ng/mL,檢出限為1.0 pg/mL(S/N=3)。本方法與文獻(xiàn)報(bào)道方法的分析性能的比較見(jiàn)表1。

    3.6 免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

    用同一根免疫電極對(duì)5 ng/mL AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行重復(fù)測(cè)定6次,測(cè)量電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的RSD為2.7%。取6支同樣條件下制備的的免疫電極,對(duì)5 ng/mL AFP樣品進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定結(jié)果的RSD為4.3%,表明此傳感器具有良好的重現(xiàn)性。將制備好的免疫傳感器在4℃下放置30天后重新檢測(cè),測(cè)得的電流值是初始電流響應(yīng)的93%,表明此傳感器具有良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

    3.7 免疫傳感器的選擇性

    為了進(jìn)一步研究傳感器測(cè)定AFP的選擇性,在最佳條件下,測(cè)定了免疫傳感器對(duì)5 ng/mL AFP及其它干擾物包括癌胚抗原(CEA,5 ng/mL)、牛血清白蛋白(BSA,5 ng/mL)、乙肝表面抗原(HBsAg, 5 ng/mL)的響應(yīng),結(jié)果如圖7所示,免疫傳感器對(duì)AFP的響應(yīng)遠(yuǎn)大于其它干擾物,表明制備的免疫傳感器的抗干擾能力強(qiáng),選擇性好。

    4 結(jié) 論

    以MGCE作為電極,基于AuNP-GO-PBNCs復(fù)合材料成功構(gòu)建了一種新型的甲胎蛋白夾心免疫傳感器,實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFP的靈敏檢測(cè)。此傳感器靈敏度高,穩(wěn)定性好,線性范圍寬且成本低。所制備的AuNP-GO-PBNCs復(fù)合材料具有良好的導(dǎo)電性和大的比表面積,又可以作為電子介體催化過(guò)氧化氫,起到放大信號(hào)的作用。此免疫傳感器制作簡(jiǎn)單,使用方便,成本低,在生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷、健康檢測(cè)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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