• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于石英毛細(xì)管載體的血清甲胎蛋白灰度分析免疫檢測法

    2017-02-06 21:20:31沈海瀅王曉倩王云云屈鋒
    分析化學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:甲胎蛋白

    沈海瀅+王曉倩+王云云+屈鋒

    摘 要 以熔融石英毛細(xì)管為免疫分析載體材料, 以腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)為模型蛋白, 將AFP捕獲抗體固定于毛細(xì)管, AFP和AFP的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體分別注入毛細(xì)管進(jìn)行孵育, 形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。注入化學(xué)發(fā)光底物液后, HRP催化底物液發(fā)光, 產(chǎn)生的光信號通過成像儀轉(zhuǎn)化為圖片。對圖片進(jìn)行灰度值分析, 建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析檢測法。當(dāng)捕獲抗體稀釋倍數(shù)為100, 酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為200, 化學(xué)發(fā)光曝光時(shí)間為20 s時(shí), 本方法可在3.1~50 ng/mL濃度范圍實(shí)現(xiàn)甲胎蛋白測定, 檢出限為2.7 ng/mL。對20例人血清臨床實(shí)際樣本進(jìn)行檢測, 結(jié)果令人滿意, 加標(biāo)回收率在96.0%~106.7%之間。本方法樣本消耗少、材料簡單、檢測成本低、不依賴大型儀器、 適用性廣, 具有較好的臨床檢驗(yàn)應(yīng)用前景。

    關(guān)鍵詞 石英毛細(xì)管; 甲胎蛋白; 免疫分析; 灰度分析

    1 引 言

    隨著我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的快速發(fā)展和人們對健康保健的日益重視, 社會(huì)對實(shí)用性的檢測技術(shù)需求越來越多, 體外診斷的新方法、新技術(shù)已成為生物分析檢測的熱點(diǎn)和重點(diǎn)研發(fā)方向。目前, 低成本、操作簡便、小型化的體外診斷方法和裝備的研究正受到科研機(jī)構(gòu)和醫(yī)療檢測市場的廣泛關(guān)注。

    現(xiàn)有的體外診斷產(chǎn)品中, 免疫檢測類產(chǎn)品占比很大, 主要采用酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法以及膠體金免疫層析法[1~3]。前兩者以微孔板為檢測載體, 技術(shù)較成熟, 但檢測時(shí)間較長, 一般需要2~3 h; 電化學(xué)發(fā)光法主要基于磁珠捕獲抗原進(jìn)行檢測, 檢測速度快, 一般可在30 min內(nèi)完成, 但檢測成本較高, 約為酶聯(lián)免疫吸附法的3~4倍; 放射性免疫檢測靈敏度高, 但對操作環(huán)境及操作人員要求很高; 膠體金免疫層析檢測速度快, 可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測, 但難以實(shí)現(xiàn)定量分析。近年來, 一些學(xué)者報(bào)道了基于納米材料及微流控技術(shù)的新型體外免疫診斷方法, 但納米材料的制備較難控制其穩(wěn)定性, 真正實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的并不多見[4,5]。本課題組多年從事毛細(xì)管電泳生物醫(yī)藥分析研究, 所用的分離載體是熔融石英毛細(xì)管, 其性質(zhì)穩(wěn)定, 透光性好, 表面易進(jìn)行物理、化學(xué)修飾, 加工工藝成熟, 成本低廉[6~10]。本實(shí)驗(yàn)將熔融石英毛細(xì)管用于免疫檢測的載體材料, 研究基于灰度值分析的血清中甲胎蛋白的免疫檢測方法, 目的是實(shí)現(xiàn)基于石英毛細(xì)管材料和灰度分析的定量免疫檢測。傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測器大多采用光電倍增管, 檢測區(qū)域有限, 分析速度慢, 而以電感耦合器件(CCD)為代表的圖像傳感器則可以提供更加廣泛的檢測區(qū)域, 具有光電轉(zhuǎn)換效率高、動(dòng)態(tài)線性范圍寬、多通道同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn), 成為未來生物傳感器的一個(gè)發(fā)展方向[11,12]。實(shí)驗(yàn)中使用的便攜式化學(xué)發(fā)光成像儀采用制冷CCD, 靈敏度高, 體積小, 僅有0.006 m3, 能夠高效捕獲化學(xué)發(fā)光信號, 形成圖片。灰度是指黑白圖像中點(diǎn)的顏色深度, 灰度分析法具有結(jié)果直觀, 分析快速等優(yōu)點(diǎn), 在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、圖像識別領(lǐng)域有廣泛的用途[13], 很多體外診斷試劑的檢測應(yīng)用也采用灰度值分析方法[14]。

    本研究以熔融石英毛細(xì)管為載體, 建立了基于灰度分析的免疫檢測方法。以腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)為模型蛋白, 通過雙抗體夾心方式進(jìn)行檢測, 與抗體偶聯(lián)的辣根過氧化物酶(HRP)催化化學(xué)發(fā)光底物液發(fā)光, 產(chǎn)生的光信號通過成像儀轉(zhuǎn)化為圖片[12,15,16], 進(jìn)行灰度值分析。研究結(jié)果表明, 毛細(xì)管免疫檢測和灰度分析結(jié)合, 實(shí)際使用的樣本量僅為0.8 μL, 而ELISA檢測一般需要50 μL, 因此本方法大幅降低了樣本使用量。檢測過程中僅需石英毛細(xì)管、醫(yī)用注射器等常用耗材, 操作簡單, 不依賴大型儀器。所建方法具有普適性, 可用于基于化學(xué)發(fā)光免疫分析的生物標(biāo)志物的快速檢測。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑:

    便攜式化學(xué)發(fā)光成像儀(國家納米科學(xué)中心研制); 熔融石英毛細(xì)管(北京華陽利民儀器有限公司); 醫(yī)用注射器(北京科龍生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司); 表面活化劑(美國Anteo Technologies公司); 磷酸鹽緩沖液(PBS)和小牛血清白蛋白(BSA)(德國Merck公司); AFP捕獲抗體、AFP的HRP酶標(biāo)抗體及AFP標(biāo)準(zhǔn)液(北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司); 癌胚抗原(CEA)標(biāo)準(zhǔn)液、前列腺特異性抗原(PSA)標(biāo)準(zhǔn)液、糖類抗原125(CA125)標(biāo)準(zhǔn)液及糖類抗原199(CA199)標(biāo)準(zhǔn)液(北京沫之東生物技術(shù)有限公司); 化學(xué)發(fā)光底物液(美國Millipore公司); 實(shí)驗(yàn)用水由Millipore純水儀制備。

    2.2 分析方法

    2.2.1 實(shí)驗(yàn)操作步驟 實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示:(1)活化毛細(xì)管 將毛細(xì)管裁剪為10 cm長, 使用醫(yī)用注射器將表面活化劑注入毛細(xì)管, 室溫靜置30 min, 對毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行活化后, 用水沖洗。(2)固定捕獲抗體及封閉 將AFP的捕獲抗體按照一定比例用PBS稀釋, 將稀釋液注入毛細(xì)管內(nèi)部, 室溫靜置1 h后再用PBS清洗, 將含5% BSA的PBS溶液注入毛細(xì)管中, 室溫靜置30 min進(jìn)行封閉。(3)注入待測蛋白 將待測蛋白AFP溶液注入到毛細(xì)管, 室溫孵育30 min后用PBS清洗。(4)注入酶標(biāo)抗體及化學(xué)發(fā)光底物液 將稀釋為一定濃度的HRP酶標(biāo)抗體注入毛細(xì)管, 室溫孵育30 min, PBS沖洗后注入化學(xué)發(fā)光底物液。

    2.2.2 成像分析 將化學(xué)發(fā)光信號轉(zhuǎn)化為圖片形式, 進(jìn)行成像灰度分析。毛細(xì)管置于成像儀中, 選擇一定的曝光時(shí)間, 檢測化學(xué)發(fā)光信號。毛細(xì)管中的化學(xué)發(fā)光底物在酶標(biāo)抗體上HRP酶的催化作用下產(chǎn)生的光信號轉(zhuǎn)化為圖片。圖片上的灰度值表示待測蛋白AFP抗原的濃度。通過ImageJ軟件分析圖片, Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 毛細(xì)管內(nèi)徑對檢測的影響

    市售毛細(xì)管有多種內(nèi)徑, 考察了不同內(nèi)徑毛細(xì)管對檢測的影響。毛細(xì)管內(nèi)徑不同, 可提供抗體結(jié)合的位點(diǎn)面積不同。內(nèi)徑較小的毛細(xì)管, 可節(jié)省樣品, 但內(nèi)壁表面積較小, 可吸附的捕獲抗體的量較小, 因而后續(xù)可結(jié)合的抗原以及酶標(biāo)抗體也較少, 故化學(xué)發(fā)光信號較弱, 灰度低, 不利于靈敏檢測。較大內(nèi)徑的毛細(xì)管所提供的內(nèi)壁表面積大, 可吸附的捕獲抗體量增加, 可結(jié)合的抗原及酶標(biāo)抗體也增加, 化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)??疾炝?0, 75, 100, 150和200 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管, 分別檢測相同濃度的AFP, 比較其灰度強(qiáng)度。結(jié)果表明, 灰度強(qiáng)度所指示的化學(xué)發(fā)光信號與AFP濃度呈正相關(guān)(圖2和圖3)。灰度照片和灰度強(qiáng)度均顯示毛細(xì)管內(nèi)徑對AFP檢測有明顯影響。使用50 μm毛細(xì)管, 灰度強(qiáng)度較弱; 內(nèi)徑增加到75 μm, 灰度強(qiáng)度增大; 使用100 μm內(nèi)徑毛細(xì)管, 灰度較強(qiáng)且均勻; 當(dāng)內(nèi)徑大于100 μm時(shí), 信號強(qiáng)度降低, 且在橫截面方向上信號分布不均。理論上, 大內(nèi)徑的毛細(xì)管可提供的內(nèi)壁表面積大, 可吸附的捕獲抗體量多, 可結(jié)合的抗原及酶標(biāo)抗體也多, 可使信號線性增強(qiáng), 直至趨于飽和。然而由圖2可見, 150 μm內(nèi)徑時(shí)信號不均。 可能是由于與拍攝方向相切的內(nèi)壁上下沿區(qū)域光程較長, 出現(xiàn)內(nèi)壁上下沿信號較強(qiáng), 中部信號偏弱的現(xiàn)象?;叶刃盘柌痪鶆虿焕跍?zhǔn)確分析, 且增加了各種試劑和樣品用量。因此, 實(shí)驗(yàn)選擇內(nèi)徑100 μm的毛細(xì)管。

    3.2 免疫分析的條件優(yōu)化

    3.2.1 捕獲抗體濃度 捕獲抗體在毛細(xì)管內(nèi)的固定效果很大程度上決定了檢測的靈敏度。通常捕獲抗體在毛細(xì)管內(nèi)壁的密度越高, 檢測靈敏度越高, 但過高濃度的捕獲抗體, 會(huì)造成過飽和, 浪費(fèi)抗體試劑。本實(shí)驗(yàn)中, 固定AFP濃度和酶標(biāo)抗體濃度, 對捕獲抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化, 將所購的捕獲抗體稀釋, 稀釋倍數(shù)為25, 50, 100, 150, 200, 250和300倍, 比較檢測的灰度值。當(dāng)捕獲抗體的稀釋倍數(shù)為150, 200, 250和300倍時(shí), 隨稀釋倍數(shù)增大, 溶液濃度降低, 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號逐漸減小, 說明溶液中的捕獲抗體濃度偏低, 固定到毛細(xì)管內(nèi)壁的捕獲抗體量較少, 不能充分結(jié)合抗原, 故化學(xué)發(fā)光值隨稀釋倍數(shù)增大而降低, 灰度值減?。?當(dāng)稀釋倍數(shù)為50和25倍時(shí), 捕獲抗體的濃度因稀釋比例小而保持較高的水平, 但其化學(xué)發(fā)光信號卻與捕獲抗體稀釋100倍時(shí)相當(dāng), 并未增強(qiáng), 說明當(dāng)捕獲抗體稀釋倍數(shù)為100時(shí), 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號趨于飽和, 增加濃度不再使抗體在毛細(xì)管內(nèi)壁的分布密度增加, 且當(dāng)稀釋倍數(shù)為100時(shí), 結(jié)合到毛細(xì)管內(nèi)壁上的捕獲抗體能夠完全結(jié)合抗原。因此, 選擇稀釋100倍為捕獲抗體最佳的稀釋比例(圖4)。

    3.2.2 酶標(biāo)抗體溶度

    酶標(biāo)抗體的濃度也直接影響檢測結(jié)果。如果酶標(biāo)抗體濃度偏低, 不能與抗原充分結(jié)合, 就會(huì)造成實(shí)際檢測信號值偏低。如果酶標(biāo)抗體濃度偏高, 雖然反應(yīng)充分, 但是可能浪費(fèi)試劑。實(shí)驗(yàn)中, 固定捕獲抗體稀釋倍數(shù)和AFP抗原濃度, 對檢測抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化。將所購的酶標(biāo)抗體稀釋, 稀釋倍數(shù)為100, 150, 200, 250, 300和350倍, 比較不同稀釋濃度的灰度值。結(jié)果表明, 酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為250, 300, 350倍時(shí), 隨稀釋比例增大, 酶標(biāo)抗體濃度降低, 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號逐漸減小, 說明酶標(biāo)抗體濃度偏低, 反應(yīng)不充分; 稀釋倍數(shù)為150和100倍時(shí), 酶標(biāo)抗體濃度隨稀釋比例減小而增大, 但灰度值與稀釋倍數(shù)200時(shí)相比未見增加。說明稀釋倍數(shù)為200時(shí), 灰度值趨于飽和, 抗原抗體結(jié)合較為充分。因此, 酶標(biāo)抗體最佳的稀釋倍數(shù)為200倍。

    3.2.3 孵育時(shí)間

    孵育時(shí)間是免疫檢測的重要參數(shù)。如孵育時(shí)間過短, 反應(yīng)進(jìn)行不充分, 影響檢測的靈敏度。若孵育時(shí)間過長, 則耗時(shí)過長。本實(shí)驗(yàn)對孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。室溫下, 將AFP抗原及AFP酶標(biāo)抗體的孵育時(shí)間分別設(shè)定為5, 15, 30, 60和90 min, 比較灰度值變化。結(jié)果表明, 孵育15 min 的灰度值即化學(xué)發(fā)光信號比孵育5 min時(shí)明顯升高, 說明5和15 min的孵育時(shí)間偏短, 反應(yīng)尚不充分; 孵育時(shí)間設(shè)為30, 60和90 min時(shí), 灰度值沒有增加。說明孵育時(shí)間為30 min時(shí), 灰度值趨于飽和, 免疫反應(yīng)較為充分。因此, 選擇最佳孵育時(shí)間30 min(圖5)。

    3.2.4 曝光時(shí)間優(yōu)化 曝光時(shí)間是化學(xué)發(fā)光免疫檢測的重要參數(shù)。曝光時(shí)間過長, 會(huì)造成高濃度AFP檢測信號過飽和; 曝光時(shí)間過短, 會(huì)造成低濃度AFP檢測信號微弱, 都不利于圖像分析, 因此有必要對曝光時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。固定捕獲抗體及酶標(biāo)抗體濃度, 對高濃度(100 ng/mL)和低濃度(3 ng/mL)的AFP分別進(jìn)行檢測, 曝光時(shí)間為5, 10, 15, 20 和25 s, 選擇同時(shí)滿足高濃度和低濃度AFP抗原檢測的合適曝光時(shí)間。當(dāng)曝光時(shí)間為15 s時(shí), 3 ng/mL AFP抗原灰度值較弱, 無法進(jìn)行圖像分析, 增加曝光時(shí)間, 灰度值增加。當(dāng)曝光時(shí)間為25 s時(shí), 100 ng/mL AFP抗原灰度值出現(xiàn)過飽和, 不利于分析。因此, 20 s為最佳曝光時(shí)間, 能夠滿足檢測需求。

    3.3 灰度分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    選擇3.1~50 ng/mL濃度范圍的AFP樣品溶液, 測定其灰度值。 灰度值Y與AFP濃度X的關(guān)系為:

    Y=

    42.9328+53.8242log(X1.5625 ng/mL)2

    式中, X的單位為ng/mL。Y與X二者呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(圖6), R=0.992。稀釋AFP樣品, 通過灰度分析, 測定方法的檢出限為2.7 ng/mL。

    在目前的臨床檢驗(yàn)中, 只有當(dāng)AFP濃度超過20 ng/mL時(shí), 該結(jié)果才具有一定的臨床診斷意義[17,18]。本方法對AFP的檢測范圍在3.1~50 ng/mL之間, 為進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    3.4 檢測特異性

    特異性是評價(jià)免疫檢測的重要指標(biāo)之一, 通常用交叉反應(yīng)率表示。實(shí)驗(yàn)中, 分別在血清加入中可能存在的干擾物CEA、 PSA、 CA125和CA199, 在最佳條件下測定。結(jié)果表明, 交叉反應(yīng)率均小于0.5%, 說明上述潛在的干擾組分對檢測結(jié)果影響小, 方法的檢測特異性好[19], 抗干擾能力強(qiáng)。

    3.5 檢測準(zhǔn)確性

    評估體外診斷試劑準(zhǔn)確性的方法主要有方法學(xué)比對和回收實(shí)驗(yàn)兩種。方法學(xué)比對是將兩種不同的檢測體系所得結(jié)果進(jìn)行比較, 在臨床化學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道中較為常見[20~22]。將本方法與目前大型醫(yī)院廣泛使用的Roche電化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行方法學(xué)比對。實(shí)際臨床樣本來源于解放軍總醫(yī)院, 使用采血管收集人全血, 在室溫中沉降30 min后, 3000 r/min離心5 min, 收集上層血清, 4℃儲存?zhèn)溆谩+@取的20例血清樣本分別采用兩種方法進(jìn)行分析檢測, 結(jié)果見圖7。兩種方法的線性回歸方程為y=0.148+11095x, R=0.980, 說明兩種方法的相關(guān)性良好, 本方法具有較高準(zhǔn)確性, 能夠滿足臨床檢測要求。通過回收實(shí)驗(yàn)評價(jià)本方法的準(zhǔn)確性。選用3份人血清, 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測定其AFP濃度, 然后分別向血清中加入AFP標(biāo)準(zhǔn)液, 再次測定其AFP濃度。重復(fù)5次, 計(jì)算得回收率在96.0%~106.7%之間(表1), 說明本檢測方法的準(zhǔn)確性較好[20]。

    4 結(jié) 論

    以熔融石英毛細(xì)管為免疫分析載體材料, 通過化學(xué)發(fā)光成像和灰度分析, 建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析檢測方法。本方法可在3.1~50 ng/mL 濃度范圍實(shí)現(xiàn)甲胎蛋白檢測, 覆蓋了臨床應(yīng)用的關(guān)鍵濃度, 為本方法的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?;诿?xì)管為載體的灰度分析免疫檢測方法的樣本消耗少、載體材料簡單、檢測成本低廉, 且不依賴大型儀器, 適用化學(xué)發(fā)光免疫分析, 具有普適性和較好的臨床檢驗(yàn)應(yīng)用前景。

    References

    1 Castiello F R, Heileman K, Tabrizian M. Lab Chip, 2016, 16(3): 409-431

    2 Nahavandi S, Baratchi S, Soffe R, Tang S Y, Nahavandi S, Mitchellc A, Khoshmanesh K. Lab Chip, 2014, 14(9): 1496-1514

    3 ZHANG Jun.Rui, CHEN Jian, LIU Zhong.Ming. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38(8): 1219-1226

    張軍瑞, 陳 健, 劉仲明. 分析化學(xué), 2010, 38(8): 1219-1226

    4 Chin C D, Linder V, Sia S K. Lab Chip, 2012, 12(12): 2118-2134

    5 Jung W, Han J, Choi J W, Ahn C H. Microelectron. Eng., 2015, 132: 46-57

    6 Meng C, Zhao X, Qu F, Mei F, Gu L. J.Chromatogr. A, 2014, 1358: 269-276

    7 Hernández.Borges J, Neusü C, Cifuentes A, Pelzing M. Electrophoresis, 2004, 25(14): 2257-2281

    8 Simpson S L, Quirino J P, Terabe S. J. Chromatogr. A, 2008, 1184(1.2): 504-541

    9 Breadmore M C. Electrophoresis, 2007, 28(1.2): 254-281

    10 Vandaveer W R, Pasas.Farmer S A, Fischer D J, Frankenfeld C N, Lunteet S M. Electrophoresis, 2004, 25(21.22): 3528-3549

    11 Zong C, Wu J, Wang C, Ju H, Yan F. Anal. Chem., 2012, 84(5): 2410-2415

    12 Liu A, Zhao F, Zhao Y, Shangguan L, Liu S. Biosens.Bioelectron., 2016, 81: 97-102

    13 Macphee D J. J. Pharmacol Toxicol Methods, 2010, 61(2): 171-177

    14 CHEN Li, PENG Jian.Xiong, ZHOU Xi.Guo. China Medical Herald, 2006, 29(3): 29-31

    陳 莉, 彭劍雄, 周細(xì)國. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2006, 29(3): 29-31

    15 Fan F, Shen H, Zhang G, Jiang X, Kang X. Clin. Chim. Acta, 2014, 431: 113-117

    16 WANG Chen, WU Jie, ZONG Chen, XU Jie, JU Huang.Xian. Chinese J. Anal. Chem., 2012, 40(1): 3-10

    汪 晨, 吳 潔, 宗 晨, 徐 潔, 鞠熀先. 分析化學(xué), 2012, 40(1): 3-10

    17 Sell S, Nichols M, Becker F F, Leffert H L. Cancer Res., 1974, 34(4): 865-871

    18 XU Jian.Ye, LIN Ding, LI Wei.Dao, WU Li.Xiang, LIU Yu, YI Ling, HUANG Xue.Mei, RAN Chong.Xin. Chinese Journal of Evidence.Based Medicine, 2009, 9(05): 525-530

    徐建業(yè), 林 丁, 李偉道, 吳立翔, 劉 預(yù), 易 玲, 黃學(xué)梅, 冉崇新. 中國循證醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 9(05): 525-530

    19 XU Wei.Wen. Journal of Molecular Diagnosis and Therapy, 2010, 2(2): 140-144

    徐偉文. 分子診斷與治療雜志, 2010, 2(2): 140-144

    20 Kuhn E, Addona T, Keshishian H, Burgess M, Mani D R, Lee R T, Sabatine M S, Gerszten R E,Carr S A. Clin. Chem., 2009, 55(6): 1108-1117

    21 Waldmuller S, Muller M, Rackebrandt K, Binner P, Poths S, Bonin M, Scheffold T. Clin.Chem., 2008, 54(4): 682-687

    22 Blackmore S, Pfeiffer C M, Lee A, Fazili Z, Hamilton M S. Clin.Chem., 2011, 57(7): 986-994

    Abstract A fused quartz capillary was taken as the carrier for the immunoassay of the tumor marker alpha fetal protein (AFP) as a model protein. The capture antibody of AFP was immobilized in capillary. Based on a sandwich immunoassay format, the antigen and corresponding horseradish peroxidase (HRP) labeled antibodies were introduced into the capillary for online incubation. After the injection of the chemiluminescence substrate, the chemiluminescence signals were captured by the CCD camera and changed into figures. The results could be read by gray level analysis of the figures. When the capture antibody was diluted 100 times, the enzyme labeled antibody was diluted 200 times, and the exposure time was 20 s, the detection range of AFP was 3.1-50 ng/mL and the critical concentrations of 20 ng/mL clinical applications were covered. The limit of detection was 2.7 ng/mL. Twenty clinical samples were tested with fine accuracy. The recoveries of the spiked samples were between 96.0% and 106.7%. In the assay, the sample consumption was low and the experimental material was simple and cheap. The method does not require large instruments, and is appropriate for clinical application

    Keywords Quartz capillary; Alpha fetal protein; Immunoassay; Gray level analysis

    猜你喜歡
    甲胎蛋白
    醫(yī)生,我甲胎蛋白升高,是不是得肝癌了?
    肝博士(2024年5期)2024-01-01 00:00:00
    甲胎蛋白升高,就一定得肝癌了嗎
    血清甲胎蛋白在原發(fā)性肝癌檢驗(yàn)中的臨床探討
    甲胎蛋白異質(zhì)體比率與異常凝血酶原在原發(fā)性肝癌診斷中的應(yīng)用分析
    甲胎蛋白:您了解多少?
    乙肝康復(fù)莫忽視甲胎蛋白檢測
    益壽寶典(2017年24期)2017-09-15 12:47:39
    乙肝康復(fù) 莫忽視甲胎蛋白檢測
    乙肝患者要定期監(jiān)測甲胎蛋白
    保健與生活(2017年5期)2017-04-14 07:45:58
    乙肝康復(fù) 莫忽視甲胎蛋白檢測
    你真的了解甲胎蛋白嗎
    肝博士(2015年3期)2015-09-25 09:19:44
    1000部很黄的大片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 99re6热这里在线精品视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 免费av中文字幕在线| www.自偷自拍.com| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日韩精品有码人妻一区| 99香蕉大伊视频| 青春草国产在线视频| 精品福利永久在线观看| 久久久久网色| 51午夜福利影视在线观看| 美国免费a级毛片| 国产精品.久久久| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| kizo精华| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久鲁丝午夜福利片| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久99热这里只频精品6学生| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产成人一区二区在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| 狂野欧美激情性bbbbbb| 男女免费视频国产| 一级黄片播放器| 99精品久久久久人妻精品| 韩国精品一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 精品一区二区三卡| 欧美中文综合在线视频| 尾随美女入室| 黄色毛片三级朝国网站| 久久久久精品性色| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产 一区精品| 成人黄色视频免费在线看| 午夜激情久久久久久久| 精品第一国产精品| 超碰成人久久| 欧美 日韩 精品 国产| 天天影视国产精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 男女下面插进去视频免费观看| 国产一区二区在线观看av| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久影院123| 精品少妇内射三级| 少妇 在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 秋霞伦理黄片| 亚洲中文av在线| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品无大码| svipshipincom国产片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 老司机在亚洲福利影院| 麻豆乱淫一区二区| 男女午夜视频在线观看| 免费看不卡的av| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩制服骚丝袜av| 国产99久久九九免费精品| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲av在线观看美女高潮| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 最近中文字幕2019免费版| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲美女视频黄频| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久婷婷青草| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 中国三级夫妇交换| 99久久综合免费| 国产精品免费视频内射| 91成人精品电影| 看十八女毛片水多多多| 18在线观看网站| 中国三级夫妇交换| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 嫩草影视91久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 丝袜喷水一区| 在线天堂最新版资源| 午夜老司机福利片| 少妇精品久久久久久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产成人免费观看mmmm| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲精品国产av成人精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美日本中文国产一区发布| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一级毛片电影观看| 午夜91福利影院| 亚洲av综合色区一区| 国产淫语在线视频| 久久久久久久久久久免费av| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一级毛片 在线播放| av天堂久久9| 在线观看国产h片| av.在线天堂| 国产黄色免费在线视频| 高清av免费在线| 99久国产av精品国产电影| 欧美成人精品欧美一级黄| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲欧美清纯卡通| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美日韩综合久久久久久| 尾随美女入室| av在线app专区| 十八禁网站网址无遮挡| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲av男天堂| av在线播放精品| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 韩国高清视频一区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 五月天丁香电影| 国产精品久久久久久精品古装| 无遮挡黄片免费观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 最新的欧美精品一区二区| 少妇人妻久久综合中文| xxxhd国产人妻xxx| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 超色免费av| 免费不卡黄色视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| a 毛片基地| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲一码二码三码区别大吗| xxx大片免费视频| 国产成人a∨麻豆精品| 无限看片的www在线观看| 国产精品久久久久成人av| 嫩草影视91久久| 免费在线观看完整版高清| 精品国产露脸久久av麻豆| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 国产在线免费精品| 国产精品.久久久| 久久精品亚洲av国产电影网| 51午夜福利影视在线观看| 一区二区三区精品91| 亚洲国产av影院在线观看| 视频区图区小说| 欧美另类一区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 另类精品久久| 久久久久精品性色| 美女视频免费永久观看网站| 久久久国产一区二区| 一区二区三区乱码不卡18| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 午夜福利乱码中文字幕| 久久女婷五月综合色啪小说| 哪个播放器可以免费观看大片| www.熟女人妻精品国产| 久久久久精品性色| 日本欧美视频一区| 在线天堂最新版资源| 日韩一本色道免费dvd| 哪个播放器可以免费观看大片| 嫩草影院入口| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久热这里只有精品99| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久精品人人爽人人爽视色| 日本午夜av视频| 一级片免费观看大全| 又大又黄又爽视频免费| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 国产av一区二区精品久久| 一级,二级,三级黄色视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 曰老女人黄片| 国产不卡av网站在线观看| 免费观看av网站的网址| 波多野结衣一区麻豆| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产深夜福利视频在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产色婷婷99| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| www.精华液| 美女国产高潮福利片在线看| 精品国产一区二区三区四区第35| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲精品日本国产第一区| 日韩电影二区| 男的添女的下面高潮视频| 国产亚洲欧美精品永久| 9热在线视频观看99| 亚洲av综合色区一区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 美女大奶头黄色视频| 看免费成人av毛片| 99久久人妻综合| 日本欧美视频一区| 成人免费观看视频高清| 99久久精品国产亚洲精品| 色播在线永久视频| 高清在线视频一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| av网站在线播放免费| 免费黄色在线免费观看| 在线精品无人区一区二区三| 美女主播在线视频| √禁漫天堂资源中文www| 曰老女人黄片| 久久久久久久国产电影| 91成人精品电影| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久精品94久久精品| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 纯流量卡能插随身wifi吗| 美女中出高潮动态图| 国产精品二区激情视频| 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 国产精品国产三级专区第一集| svipshipincom国产片| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久久久网色| 午夜91福利影院| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲免费av在线视频| 香蕉国产在线看| 老鸭窝网址在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 99re6热这里在线精品视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲图色成人| 亚洲成人一二三区av| 水蜜桃什么品种好| 美国免费a级毛片| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美另类一区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美最新免费一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 美国免费a级毛片| 国产在线一区二区三区精| 欧美 日韩 精品 国产| 最近的中文字幕免费完整| 中文字幕精品免费在线观看视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 男女国产视频网站| 在线观看三级黄色| 亚洲免费av在线视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 香蕉丝袜av| 国产精品.久久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 人妻 亚洲 视频| 亚洲伊人色综图| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品一二三区在线看| 国产片特级美女逼逼视频| 久久精品国产综合久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久影院123| 伦理电影免费视频| 日韩av免费高清视频| 中国三级夫妇交换| 日韩制服骚丝袜av| 日韩精品有码人妻一区| 日本午夜av视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 最新的欧美精品一区二区| 日韩一本色道免费dvd| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲欧美一区二区三区黑人| www.av在线官网国产| 国产 一区精品| 热re99久久国产66热| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美另类一区| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品免费大片| xxx大片免费视频| 久久亚洲国产成人精品v| 国产午夜精品一二区理论片| avwww免费| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美97在线视频| 国产日韩欧美在线精品| 国产日韩欧美在线精品| 国产日韩欧美在线精品| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产xxxxx性猛交| 精品视频人人做人人爽| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一区福利在线观看| 久久久精品免费免费高清| 欧美黑人精品巨大| av视频免费观看在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 国产不卡av网站在线观看| 国产毛片在线视频| 成年人免费黄色播放视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产精品.久久久| 99精国产麻豆久久婷婷| av.在线天堂| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲精品aⅴ在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲国产精品999| 欧美日本中文国产一区发布| 午夜福利免费观看在线| 国产熟女欧美一区二区| 国产成人精品久久二区二区91 | 99九九在线精品视频| 考比视频在线观看| 一级片免费观看大全| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品久久久久成人av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲av电影在线进入| 亚洲美女视频黄频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| tube8黄色片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产一区二区激情短视频 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 中文字幕最新亚洲高清| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一级a爱视频在线免费观看| 老汉色∧v一级毛片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产成人精品无人区| 亚洲av福利一区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 搡老岳熟女国产| 国产免费福利视频在线观看| 在线观看三级黄色| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 少妇精品久久久久久久| 深夜精品福利| 欧美xxⅹ黑人| 婷婷色综合大香蕉| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲 欧美一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 久久精品久久久久久久性| 在线观看人妻少妇| 亚洲国产精品999| 香蕉丝袜av| 日本av免费视频播放| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲综合精品二区| 麻豆乱淫一区二区| 一个人免费看片子| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品欧美亚洲77777| 精品少妇内射三级| 秋霞在线观看毛片| 91成人精品电影| 电影成人av| 亚洲精品av麻豆狂野| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品视频人人做人人爽| 成人亚洲精品一区在线观看| 又大又爽又粗| 亚洲精品久久午夜乱码| 蜜桃在线观看..| 免费人妻精品一区二区三区视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲精品在线美女| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费av中文字幕在线| 国产成人系列免费观看| 波多野结衣一区麻豆| 欧美日韩精品网址| 亚洲一码二码三码区别大吗| 色播在线永久视频| 看免费成人av毛片| 欧美久久黑人一区二区| 青春草视频在线免费观看| 国产成人免费观看mmmm| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产一区二区三区av在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 男女下面插进去视频免费观看| 丰满少妇做爰视频| 午夜福利在线免费观看网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久久精品免费免费高清| 国产亚洲欧美精品永久| 国产野战对白在线观看| 精品久久久久久电影网| 九九爱精品视频在线观看| 视频区图区小说| 老司机靠b影院| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久av网站| 国产人伦9x9x在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 午夜日韩欧美国产| 免费看av在线观看网站| 免费看不卡的av| 亚洲精品aⅴ在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 黄色 视频免费看| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲av日韩在线播放| 操美女的视频在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 飞空精品影院首页| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产黄频视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 久久久久国产精品人妻一区二区| 美女中出高潮动态图| 国产福利在线免费观看视频| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美乱码精品一区二区三区| 日日啪夜夜爽| 国产av精品麻豆| 桃花免费在线播放| 丰满少妇做爰视频| 涩涩av久久男人的天堂| 黑丝袜美女国产一区| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产乱人偷精品视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 免费黄网站久久成人精品| 女人久久www免费人成看片| 少妇人妻 视频| 精品国产国语对白av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 丝袜美腿诱惑在线| 日日撸夜夜添| 日本欧美国产在线视频| 精品一区二区三卡| a级毛片在线看网站| av天堂久久9| 蜜桃国产av成人99| 大香蕉久久网| 亚洲国产av新网站| 无限看片的www在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 成年美女黄网站色视频大全免费| 成人三级做爰电影| 亚洲五月色婷婷综合| 考比视频在线观看| 久久性视频一级片| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲国产精品国产精品| 制服丝袜香蕉在线| 国产激情久久老熟女| 国产乱来视频区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 极品人妻少妇av视频| av不卡在线播放| 另类亚洲欧美激情| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av免费观看日本| 最近手机中文字幕大全| 久久婷婷青草| 国产黄频视频在线观看| 国产99久久九九免费精品| 国产乱人偷精品视频| 在线看a的网站| 中文字幕最新亚洲高清| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一二三四在线观看免费中文在| 另类亚洲欧美激情| 69精品国产乱码久久久| 久久精品国产综合久久久| 一区福利在线观看| 一区在线观看完整版| 亚洲精品国产av成人精品| av视频免费观看在线观看| 国产精品无大码| 午夜福利影视在线免费观看| 赤兔流量卡办理| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久久精品性色| 国产探花极品一区二区| 七月丁香在线播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 在线天堂中文资源库| 成年女人毛片免费观看观看9 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 一级片免费观看大全| 麻豆乱淫一区二区| 日韩一本色道免费dvd| 9热在线视频观看99| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久国产亚洲av麻豆专区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 多毛熟女@视频| 青春草视频在线免费观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产成人系列免费观看| 亚洲天堂av无毛| www日本在线高清视频| 看免费成人av毛片| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲av在线观看美女高潮| 婷婷色麻豆天堂久久| 最近手机中文字幕大全| 91精品三级在线观看| 亚洲综合色网址| 18禁动态无遮挡网站| 电影成人av| 一本久久精品| 亚洲,欧美,日韩| 一级片'在线观看视频| www.自偷自拍.com| 又大又爽又粗| 老司机深夜福利视频在线观看 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| a 毛片基地| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲精品日本国产第一区| 男的添女的下面高潮视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 日韩一本色道免费dvd| 水蜜桃什么品种好| 母亲3免费完整高清在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 丝袜美腿诱惑在线| 一级毛片我不卡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 黄色视频在线播放观看不卡| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品久久久久久精品电影小说| 永久免费av网站大全| 亚洲五月色婷婷综合| 看非洲黑人一级黄片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲伊人久久精品综合| 中文字幕亚洲精品专区| 街头女战士在线观看网站| 一级a爱视频在线免费观看| 久久人妻熟女aⅴ| av国产久精品久网站免费入址| 捣出白浆h1v1| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美黑人精品巨大| 亚洲国产欧美在线一区| 十八禁高潮呻吟视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 热re99久久精品国产66热6| 1024视频免费在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 丰满少妇做爰视频| 久久久国产精品麻豆| 免费观看性生交大片5| 国产毛片在线视频| 成人影院久久| 国产精品久久久人人做人人爽|