狗棗獼猴桃離體培養(yǎng)和快速繁殖研究

呂海燕 趙婷婷 鐘彩虹

摘要[目的]研究狗棗獼猴桃離體培養(yǎng)和快速繁殖技術。[方法]以狗棗獼猴桃幼嫩帶芽莖段、幼嫩葉片及葉柄作為外植體，研究其組織培養(yǎng)整個過程，建立快速高效的狗棗獼猴桃快繁體系。[結果]器官發(fā)生途徑最適宜的外植體為幼嫩葉片。

篩選出最適宜腋芽一步成苗的培養(yǎng)基配方為MS+1.25 mg/L 6-BA+0.250 mg/L NAA，腋芽萌發(fā)率達92.90%，通過對無菌苗進行生根誘導試驗，篩選出最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS + 0.2 mg/L NAA，生根率100%，平均根數(shù)12.5條。[結論]該研究為狗棗獼猴桃產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及優(yōu)良種質資源的保存工作提供了理論和技術支撐。

關鍵詞狗棗；離體培養(yǎng)；快速繁殖

中圖分類號S663.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）17-0116-03

Abstract[Objective]To study culturing in vitro and rapid regeneration of Actinidia kolomikta.[Method]A stable and efficient in vitro rapid propagation system of A. kolomikta was established by using the stem segments with axillary buds，petioles and leaves as explants.[Result] Leaves were the best explants for callus induction of A. kolomikta.The best onestep culturing medium for stem segments with axillary buds was MS+1.25 mg/L 6BA + 0.250 mg/L NAA，the axillary bud germination rate was 92.90%.The adventitious shoots were cultured in the same medium， then transferred to the MS supplemented with 0.2 mg/L NAA. The rate of adventitious root regeneration and the average number of roots were 100% and 12.5， respectively.[Conclusion]The research provided theoretical and technical support for the conservation and industrialization of A.kolomikta excellent germplasm resources.

Key wordsActinidia kolomikta；Culture in vitro ；Rapid regeneration

基金項目2016年湖北省技術創(chuàng)新專項（重大項目）（2016ABA109）；中國科學院科技服務網(wǎng)絡計劃（KFJ-EW-STS-076）；國家自然科學基金青年基金項目（31101520）。

作者簡介呂海燕（1983—），女，湖北武漢人，工程師，碩士，從事獼猴桃組織培養(yǎng)技術研究。*通訊作者，研究員，博士，從事獼猴桃育種、種質資源及種植技術等研究。

收稿日期2017-04-21

狗棗獼猴桃（Actinidia kolomikta）屬獼猴桃科獼猴桃屬小型落葉藤本，果實可食用、釀酒及入藥，維生素C含量高，是很好的藥食同源植物[1]。

國內(nèi)狗棗獼猴桃主要分布在東北3?。ê０?00～800 m）、四川（海拔1 600～2 900 m）山地混交林或雜木林中開曠地[2]。因其獨特的生態(tài)習性，在華中地區(qū)的引種栽培中，常規(guī)育種繁殖方法如高接、扦插、播種繁殖成活率較低，植株生長勢弱，結果少，而利用組織培養(yǎng)離體保存該種質資源意義重大。筆者對狗棗獼猴桃的組織培養(yǎng)進行研究，探討其離體培養(yǎng)保存方法和快速繁育技術，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及優(yōu)良種質資源的保存工作提供理論和技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

2015年3—11月、2016年3月，以國家獼猴桃種質資源圃（中國科學院武漢植物園內(nèi)）保存的狗棗獼猴桃為試材，取帶腋芽莖段、幼嫩葉片、葉柄，自來水沖洗1 h，在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡45 s，0.1%升汞中浸泡10 min，無菌水沖洗4 ～ 5次，于無菌濾紙上晾干待用。

1.2方法

1.2.1不同外植體離體再生試驗。

消毒好的外植體，帶腋芽莖段每含1 ～ 2個腋芽切成1段，葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小，葉柄切成0.5 cm長小段，接種于含不同濃度6-BA、ZT、NAA的MS培養(yǎng)基中，6-BA質量濃度為2000、1000、0 mg/L，NAA質量濃度為0.100、0.200、0.400 mg/L，ZT質量濃度為0、1.000、2.000 mg/L，采用L9（4）3正交表進行試驗設計，共計9個處理，每個處理15個外植體，各3次重復，接種后置于光培養(yǎng)室光下培養(yǎng)8～14 d調(diào)查腋芽及愈傷萌發(fā)率。

1.2.2不同采樣時間狗棗腋芽離體萌發(fā)試驗。

于2015年3月、5月、6月、11月分4次對狗棗嫩枝采樣，進行帶腋芽莖段的萌發(fā)誘導試驗，材料消毒方法同“1.1”，所用培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.000 mg/L+NAA 0.200 mg/L，每個月份分3次取樣作為3個重復，每個重復30個外植體，21 d后統(tǒng)計腋芽萌發(fā)率。

1.2.3不同濃度激素配比誘導狗棗一步成苗。

于2016年3月采狗棗幼嫩莖段，外植體消毒處理后，接入含不同濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，6-BA質量濃度0.750、1000、1250、1.500 mg/L，NAA質量濃度為0.125、0.250、0500、1.000 mg/L。隨機處理組合，共16個處理，各3次重復，每個重復15個外植體，28 d后觀察統(tǒng)計再生率。無菌苗于最佳誘導培養(yǎng)基上繼代，統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.4不定芽的生根。

將生長狀態(tài)良好的狗棗無菌苗切成含2 ～ 3片葉片的小段，形態(tài)學下端朝下分別接種到附加有不同質量濃度NAA（0、0.200、0.500、1.000 mg/L）的1/2MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，每處理重復3次，每個重復15個節(jié)段，培養(yǎng)21 d后，統(tǒng)計生根率和生根數(shù)量。

該試驗光培養(yǎng)條件為12h/d光照，光照強度2 500 lx，溫度（25±2）℃，MS基本培養(yǎng)基添加蔗糖30 g/L、瓊脂8 g/L，pH 6.0。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)分析軟件處理數(shù)據(jù)，進行方差分析。

愈傷再生率=再生愈傷葉片數(shù)（葉柄數(shù)）/接種外植體總數(shù)×100%

腋芽萌發(fā)率=萌發(fā)外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

生根率=生根芽數(shù)/接種芽數(shù)量×100%

2結果分析

2.1不同處理對外植體萌發(fā)的影響

外植體接種7 d后，帶腋芽莖段在附加1.000 mg/L 6-BA和0.200 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中即可萌發(fā)腋芽，且萌發(fā)率顯著高于其他處理（圖1）。葉片、葉柄均有不同程度的愈傷組織再生，但愈傷分化緩慢，葉片再生的愈傷組織有少量不定芽再生，但多發(fā)育為白化苗（圖2）。方差分析結果表明，試驗中的4個因素各水平之間差異顯著，結合萌發(fā)率的直觀分析和正交設計的優(yōu)選原則，可得出因素6-BA中2.000 mg/L水平，ZT中2.000 mg/L水平，NAA中0.400 mg/L的水平，外植體選擇帶腋芽莖段時效果最好。即最佳組合為選擇帶腋芽莖段為外植體，添加2.000 mg/L 6-BA、2.000 mg/L ZT和0.400 mg/L NAA的培養(yǎng)基最適合狗棗的離體萌發(fā)（表1）。

2.2不同采樣時間對腋芽萌發(fā)的影響

由表2可知，3月份為外植體采樣的最佳時間，此時外植體生長狀態(tài)良好，再生能力強，不易褐化。隨著時間往后推移，外植體再生能力降低，且很容易褐化死亡。

2.3不同濃度的6-BA和NAA組合對狗棗一步成苗的影響

根據(jù)“2.1”的試驗結果，對帶腋芽莖段進行一步成苗誘導試驗。結果分析表明，低濃度的6-BA培養(yǎng)基誘導下外植體形成少量愈傷，但愈傷組織灰白色，易碎，不易分化，隨著6-BA濃度的增加，外植體愈傷化愈加嚴重（圖3），嚴重滯緩了莖段上腋芽的萌發(fā)影響了一步成苗的效率。由表3可知，當6-BA濃度為1.250 mg/L，NAA濃度為0.250 mg/L時，接種7 d即可見腋芽萌發(fā)，且迅速抽長，生長健壯。將萌發(fā)的腋芽切下置于相同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，無菌苗生長迅速，增殖快，通過莖段擴繁，30 d的增殖系數(shù)可達4～5。確定MS+6-BA 1.250 mg/L+NAA 0.250 mg/L為狗棗一步成苗最佳培養(yǎng)基配方。

2.4不同濃度的NAA對不定芽生根的影響

狗棗獼猴桃易生根，即使在不添加任何激素的1/2MS上也能生根（圖4），但耗時長，21 d左右才出現(xiàn)可見根（表4），隨著NAA濃度的增加，植株基部愈傷化（圖5），影響生根進程，當NAA濃度為0.200 mg/L時，生根數(shù)量最多，每棵植株可再生出12.5條根，生根快，且基部無愈傷組織（圖6）。

3討論

獼猴桃離體再生可供選擇的外植體很多，大量研究證實

獼猴桃莖段、葉片、葉柄、花瓣、花粉、胚乳等均可作為有效外植體進行再生誘導試驗[3-7]，該試驗著眼于狗棗獼猴桃一步成苗快繁技術的研究，采用帶腋芽莖段作為外植體，減少再生分化的細胞再生過程，能極大地加快產(chǎn)業(yè)化育種進程。

培養(yǎng)基中激素的種類和比例是獼猴桃組織培養(yǎng)研究成功的關鍵[8-10]。很多學者指出，ZT對獼猴桃愈傷組織和不定芽的分化有很好的誘導效果[5，11]，該試驗中6-BA和NAA適宜濃度組合對狗棗離體快繁的效果不亞于ZT組合，從實際生產(chǎn)成本來講，6-BA對ZT的取代，很大程度上降低了產(chǎn)業(yè)化種苗的生產(chǎn)成本。

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