小黃花石斛的無(wú)菌播種與快速繁殖

李宏楊+劉揚(yáng)+陳冠銘+楊志娟

摘 要 為保護(hù)與利用小黃花石斛野生資源，采用種子無(wú)菌播種、試驗(yàn)不同培養(yǎng)基、不同激素配比以及添加天然有機(jī)復(fù)合物等方法，探究小黃花石斛的組培快繁技術(shù)。研究結(jié)果表明：小黃花石斛種子在1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后形成原球莖團(tuán)，萌發(fā)率超過(guò)80%，再培養(yǎng)30 d后出芽整齊；單芽轉(zhuǎn)接到MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+土豆粉100 g/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d后形成叢生芽，增殖系數(shù)達(dá)到8.58；幼苗轉(zhuǎn)接到MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+香蕉粉100 g/L+CA 1.0 g/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)80 d后可形成完整植株，小苗移栽60 d后，成活率達(dá)到71.45%。

關(guān)鍵詞 小黃花石斛 ；無(wú)菌播種 ；組織培養(yǎng) ；快速繁殖

中圖分類號(hào) S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.05.005

Aseptic Seeding and Rapid Propagation of Dendrobium jenkinsii

LI Hongyang LIU Yang CHEN Guanming YANG Zhijuan

（Sanya Science &Technology Academy of Crop Winter Multiplication， Sanya， Hainan 572000）

Abstract In order to protect and utilize the wild plant resources of Dendrobium jenkinsii， the techniques of tissue culture and rapid propagation of D. jenkinsii were explored by using aseptic seed sowing， different media， different hormone ratio and natural organic compound. The results showed that the seeds of D. jenkinsii formed protocorms 10 days after cultured in 1/2MS medium with a germination rate of more than 80% and were all germinated after another 30 days. Each single bud was transferred to a culture medium containing MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+potato powder 100 g/L and produced clusters 60 days after cultured， and the multiplication coefficient was upto 8.58. The plantlets derived from the clusters were transferred to a medium containing MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+banana powder 100 g/L+activated carbon 1.0 g/L and formed strong rooted plants 80 d after cultured. The rooted plants had a survival rate of 71.45% 60 days after transplanted.

Keywords Dendrobium jenkinsii ； aseptic seeding； tissue culture ； rapid propagation

小黃花石斛（Dendrobium jenkinsii）與聚石斛十分相似，植物體各部分較小，莖長(zhǎng)1～2.5 cm，具4個(gè)棱，葉橢圓形，總狀花序，具1～3朵黃花。小黃花石斛常生于海拔700～1 300 m的疏林中，鱗片狀附生于樹(shù)干或石頭上，分布于錫金、不丹、印度東北部、緬甸、泰國(guó)、老撾等地及我國(guó)云南南部[1]?！吨袊?guó)植物志》上將小黃花石斛和鼓槌石斛、密花石斛、聚石斛、具槽石斛、球花石斛聚為一組，而現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究結(jié)果與形態(tài)分類不一致。武榮花[2]采用石斛葉綠體DNA trnL-trnF間隔區(qū)序列比較和采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)的部分石斛屬植物資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，小黃花石斛自成一組，與翅梗石斛親緣關(guān)系較近。金劍峰等[3]對(duì)24種石斛屬植物的rDNA ITS序列進(jìn)行克隆分析，小黃花石斛和景洪石斛、劍葉石斛、球花石斛、短棒石斛聚為一組。小黃花石斛屬于矮小型原生種，花色奪目，形態(tài)高雅，是熱帶石斛蘭矮化育種的優(yōu)良親本，可通過(guò)屬內(nèi)雜交或參考親緣關(guān)系分類培育新品種，但有關(guān)研究報(bào)道很少，至今未見(jiàn)品種登錄（RHS）。小黃花石斛自然結(jié)實(shí)率高，但和其它蘭科植物一樣，種子萌發(fā)率極低，主要靠無(wú)性繁殖連片生長(zhǎng)。近年來(lái)，小黃花石斛野生資源受人類掠奪性盜采，公開(kāi)售賣，已瀕臨滅絕。因此，有必要研究小黃花石斛的離體快繁育苗技術(shù)，為其資源保存與開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

小黃花石斛（Dendrobium jenkinsii Lindl.）為云南野生種，保存于三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院石斛資源圃，人工異花授粉后其蒴果在140 d左右開(kāi)始變黃成熟，采摘備用。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

將小黃花石斛蒴果經(jīng)自來(lái)水洗凈，用75%酒精浸泡消毒20 s，0.1%升汞溶液消毒15 min，無(wú)菌水沖洗6次。風(fēng)干水分，切開(kāi)蒴果，將種子均勻散落到培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

種子萌發(fā)培養(yǎng)基：（1） MS；（2） 1/2 MS（大量元素減半）；（3） 1/2 MS+土豆粉80 g/L。叢生芽增殖培養(yǎng)基：（4） MS+KT 0.5～1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+土豆粉100 g/L。壯苗生根培養(yǎng)基：（5） MS+NAA 0.5 mg/L+CA（活性炭）1.0 g/L；（6） MS+NAA 0.5 mg/L+土豆粉100 g/L+CA 1.0 g/L；（7） MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+土豆粉100 g/L+CA 1.0 g/L；（8） MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+香蕉粉100 g/L+CA 1.0 g/L。以上培養(yǎng)基均添加蔗糖25 g/L，卡拉膠7 g/L，pH調(diào)為 5.8，培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間每天12 h。

1.2.3 種子萌發(fā)培養(yǎng)

將種子播種到培養(yǎng)基（1）～（4）上，每個(gè)培養(yǎng)基接種10瓶，每天觀察種子萌發(fā)情況，記錄初始萌發(fā)時(shí)間（原球莖開(kāi)始出現(xiàn)的時(shí)間），觀察記錄萌發(fā)率。

1.2.4 叢生芽增殖培養(yǎng)

待原球莖出芽后，切取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的單芽轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基（5）上，每個(gè)處理接種15瓶，每瓶接種5個(gè)。持續(xù)觀察叢生芽生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)增殖率，每瓶叢生芽增殖系數(shù)=出芽數(shù)/5。

1.2.5 壯苗與生根培養(yǎng)

選取0.5 cm左右的單芽（幼苗），轉(zhuǎn)接到壯苗與生根培養(yǎng)基（6）～（8）上，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶轉(zhuǎn)接6株。轉(zhuǎn)接后持續(xù)觀察小苗的生長(zhǎng)發(fā)育狀況，80 d后抽樣統(tǒng)計(jì)小苗的莖長(zhǎng)、莖粗、根數(shù)、根長(zhǎng)、葉片等指標(biāo)。

1.2.6 煉苗移栽

將培養(yǎng)瓶放置于蘭花設(shè)施大棚內(nèi)，1周后取出生根苗，洗凈培養(yǎng)基，用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡10 min，取出晾干。挑選大小基本一致的小苗種植于水苔基質(zhì)中，并噴灑1 000倍的多菌靈消毒液，置于陰涼通風(fēng)處培養(yǎng)，保持基質(zhì)濕度，60 d后統(tǒng)計(jì)小苗的存活率。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)的影響

小黃花石斛種子在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)很少且時(shí)間長(zhǎng)，30 d后基本褐化死亡。在1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)時(shí)間最快，萌發(fā)率最高，原球莖長(zhǎng)勢(shì)好，培養(yǎng)7 d即有種子由黃轉(zhuǎn)綠，20 d后大多數(shù)原球莖變綠出芽，40 d后可轉(zhuǎn)接增殖培養(yǎng)。在添加了土豆粉的1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率也較高，但萌發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)，原球莖生長(zhǎng)慢且弱小，不利于增殖培養(yǎng)。

2.2 不同激素濃度配比對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

將單芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，30 d后即形成明顯的叢生芽，可切分叢芽增殖。結(jié)果見(jiàn)表2，以MS為基本培養(yǎng)基，如不添加NAA，嫩芽大部分死亡。在添加了NAA 0.2 mg/L的前提下，隨著細(xì)胞分裂素KT濃度的增加，小芽的增殖系數(shù)增加，但KT的濃度提高到1.5 mg/L時(shí)增殖系數(shù)不再增加。KT 0.5 mg/L與NAA組合中，NAA起主導(dǎo)作用，增殖的叢生芽表現(xiàn)為根多芽小，芽細(xì)長(zhǎng)，葉小；KT 1.5 mg/L與NAA組合中，KT則抑制了小芽的生長(zhǎng)，增殖的叢生芽較矮小、生長(zhǎng)緩慢。KT 1.0 mg/L與NAA組合的增殖系數(shù)達(dá)到8.58，叢生芽的單芽較為粗壯，且有根發(fā)生，有利于繼代培養(yǎng)或生根壯苗培養(yǎng)。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)壯苗與生根培養(yǎng)的影響

叢生芽經(jīng)分化生長(zhǎng)培養(yǎng)即可單苗轉(zhuǎn)接進(jìn)行壯苗與生根培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，研究了生長(zhǎng)素和天然有機(jī)復(fù)合物對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響，并統(tǒng)計(jì)了幼苗移栽成活率（表3）。第4種培養(yǎng)基中添加了NAA、低濃度的IBA和香蕉粉汁，培養(yǎng)效果最好，幼苗生根數(shù)最多，移栽成活率達(dá)到71.45%，根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)和莖粗均表現(xiàn)優(yōu)異。研究發(fā)現(xiàn)，所有幼苗均在莖的頂端著生2個(gè)葉片，而且不同培養(yǎng)基對(duì)幼苗莖長(zhǎng)的影響不大；幼苗雖然植株矮小，生長(zhǎng)慢，但根系發(fā)達(dá)，生根多，根系長(zhǎng)，一般成苗時(shí)已布滿整個(gè)培養(yǎng)基，這是由小黃花石斛的遺傳特性決定的。

3 討論

培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分（大量元素和微量元素）是植物生長(zhǎng)必須的，而植物不同發(fā)育階段對(duì)元素的種類和需求量各不相同。1/2 MS培養(yǎng)基可使小黃花石斛種子提早萌發(fā)并提高萌發(fā)率，可見(jiàn)較低的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分更適合石斛種子初期的生長(zhǎng)發(fā)育，同樣的研究結(jié)果出現(xiàn)在石斛屬其它植物的組織培養(yǎng)中，如金釵石斛[4]、鐵皮石斛[5]。

激素對(duì)植物組培快繁起著至關(guān)重要的作用，組織培養(yǎng)中的技術(shù)難點(diǎn)之一就是控制各種激素在培養(yǎng)基中的濃度?？刂扑砑拥募?xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的濃度，可以控制芽或根的分化，細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的比值大時(shí)有利于芽的形成，比值小時(shí)則有利于生根[6]。本研究結(jié)果也證實(shí)了上述觀點(diǎn)，增殖培養(yǎng)中NAA 0.2 mg/L濃度保持不變，KT濃度在0.5 mg/L時(shí)芽少根多，NAA濃度在1.0 mg/L時(shí)顯著提高了增殖率，達(dá)到最大的8.58倍，而KT濃度提高到1.5 mg/L時(shí)則抑制芽的生長(zhǎng)。在壯苗與生根培養(yǎng)時(shí)，向NAA 0.5 mg/L +土豆粉100 g/L培養(yǎng)基中添加低濃度的IBA 0.05 mg/L，幼苗的莖粗即顯著增大，移栽成活率大幅提高，說(shuō)明2種生長(zhǎng)素配合使用比單一激素效果要好。

在蘭科植物的組織培養(yǎng)時(shí)，常用到椰乳、香蕉粉、土豆粉等天然有機(jī)復(fù)合物，其主要作用可能是為植物生長(zhǎng)提供某些生理活性物質(zhì)或補(bǔ)充某些未知的微量成分，而在不同培養(yǎng)階段，則表現(xiàn)為促進(jìn)或抑制生長(zhǎng)效果[7-11]。試驗(yàn)研究表明，土豆粉明顯抑制了種子萌發(fā)生長(zhǎng)，種子萌發(fā)變慢且發(fā)芽較少，這可能是土豆粉中含有的植物激素、酶、無(wú)機(jī)鹽等某種成分干擾了其正常發(fā)育過(guò)程。土豆粉對(duì)根系誘導(dǎo)與壯苗沒(méi)有明顯的促進(jìn)效果，香蕉粉比土豆粉更好誘導(dǎo)生根，幼苗健壯，利于移栽成活，移栽成活率達(dá)到71.45%。有研究表明，香蕉粉提取物可促進(jìn)植株根系發(fā)達(dá)，促進(jìn)莖葉生長(zhǎng)；能促進(jìn)試管苗酶的活性，有效增強(qiáng)幼苗的抗逆性；還對(duì)維持培養(yǎng)基的pH值有緩沖作用[12]。本研究初步建立了小黃花石斛組培快繁技術(shù)，但該物種株小苗弱，組培苗移栽成活率偏低，叢生芽增殖、分化及生根壯苗階段，還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究以小黃花石斛的種子為外植體，種子萌發(fā)誘導(dǎo)、叢生芽增殖、壯苗與生根培養(yǎng)， 形成完整植株，經(jīng)煉苗移栽后，得到表型一致的健壯種苗。本技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、污染率低、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于種質(zhì)資源保存、遺傳育種及規(guī)?；绲?。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志（第19卷）[M]. 北京：科學(xué)出版社，1999：79.

[2] 武榮花.我國(guó)石斛屬植物種質(zhì)資源及其親緣關(guān)系研究[D]. 北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，2007.

[3] 金劍峰，朱思眉，蔣 明，等.石斛屬植物rDNA ITS序列的克隆與分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，26（3）：685-692.

[4] 唐金剛，盧文蕓，乙 引，等.藥用金釵石斛快速繁殖的研究[J]. 貴州科學(xué)，2007，25（1）：59-62.

[5] 羅吉鳳，程治英，龍春林.鐵皮石斛快速繁殖和離體種質(zhì)保存的研究[J]. 廣西植物，2006，26（1）：69-73.

[6] 洪森榮，肖波，江 靜. KT和NAA對(duì)鐵皮石斛帶芽莖段生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（1）：55-56.

[7] 朱 橋. 血葉蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（6）：805-809.

[8] 黎建玲，黃肇宇，詹源慶，等.金釵石斛試管苗生根研究[J].廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，22（2）：87-89.

[9] 杜 剛，來(lái)天超，楊海英.兜唇石斛的組織培養(yǎng)研究[J].北方園藝，2012（8）：140-141.

[10] 陳春滿，何蜜麗，蔣雄輝，等.不同基本培養(yǎng)基及有機(jī)添加物對(duì)3個(gè)朵麗蝶蘭品種組培苗生長(zhǎng)的影響[J].亞熱帶植物科學(xué)，2008，37（4）：32-34.

[11] 宋智琴，楊平飛，羅 鳴，等.不同添加物對(duì)白及組培壯苗培養(yǎng)的影響[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016，44（3）：138-140.

[12] 李 亮，張冬敏，雷華輝，等.植物組織培養(yǎng)中有機(jī)添加物應(yīng)用研究[J].寧夏農(nóng)林科技，2012，53（2）：28-30，34.