苗藥大果木姜子總黃酮與糖類成分含量測定

劉剛 劉育辰 康雪佳

摘要[目的]建立測定大果木姜子中總黃酮、總糖、還原糖、多糖含量的方法。[方法]以蘆丁和葡萄糖為對照品，采用紫外分光光度計測定大果木姜子中總黃酮、總糖、還原糖、多糖的含量并進行方法學(xué)考察。[結(jié)果]大果木姜子中總黃酮含量為（8.02±0.19）mg/g，總糖含量為（35.26±0.96）%，還原糖含量為（4.78±0.95）%，多糖含量為（30.53±0.69）%。[結(jié)論]該方法快速、簡便、準確，可以用于大果木姜子中總黃酮、總糖、還原糖、多糖的含量測定。

關(guān)鍵詞 大果木姜子；總黃酮；總糖；還原糖；多糖；紫外分光光度法

中圖分類號 S789.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）03-0141-04

Abstract[Objective] To establish the method for determination of total flavonoids， total sugar， reducing sugar， and polysaccharide in Cinnamomum migao. [Method] Using rutin and glucose as control products， the contents of total flavonoids， total sugar， reducing sugar and polysaccharide in C. migao were detected by UV spectrophotometer， and experiments were conducted to investigate whether the method is feasible. [Result] The contents of total flavonoids， total sugar， reducing sugar， polysaccharide in C. migao were （8.02±0.19）mg/g， （35.26± 0.96）%， （4.78±0.95）%， （30.53±0.69）%， respectively.[Conclusion] The method is rapid， simple， accurate， which is able to accomplish the content determination of total flavonoids， total sugar， reducing sugar， polysaccharide in C. migao.

Key words Cinnamomum migao；Total flavonoids；Total sugar；Reducing sugar；Polysaccharide；UV

苗藥大果木姜子為樟科植物米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）的干燥成熟果實[1]，味苦、辛，性溫，能夠散寒祛濕、行氣止痛，臨床用于治療胸腹疼痛、胸悶腹脹、哮喘等[2]。大果木姜子已被收錄《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》（2003年版）[3]，是一些治療心絞痛、冠心病、胃脘疼痛等苗藥制劑的主要原料，如金喉健噴霧劑等。黃酮類化合物屬于植物的次級代謝產(chǎn)物[4]，是廣泛存在于植物界的一類天然產(chǎn)物，同時也是許多中草藥的有效成分，具有很高的藥用價值。中藥多糖是一種天然的大分子，來源廣泛且沒有毒性，具有多種藥理活性，尤其是對免疫系統(tǒng)有重要的調(diào)節(jié)作用[5]。目前對于大果木姜子化學(xué)成分的研究主要集中于揮發(fā)油[6-8]，而對大果木姜子的糖類以及黃酮類成分的研究很少。筆者以蘆丁和葡萄糖為對照品，采用紫外分光光度計測定大果木姜子中總黃酮、總糖、還原糖、多糖的含量并進行方法學(xué)考察，建立測定大果木姜子中總黃酮與糖類成分含量的方法，為進一步完善其質(zhì)量標準和產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對象。大果木姜子產(chǎn)于貴州省羅甸縣，由貴州宏宇藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)鑒定為樟科植物米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）的干燥成熟果實。

1.1.2

主要儀器。HH-W600恒溫水箱（江蘇金壇市億通電子有限公司）；科導(dǎo)SK1200H臺式超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；SHB-III循環(huán)水時多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；100 g多功能粉碎機（上海北申科技有限公司）；紫外分光光度計（澳大利亞照生公司）。

1.1.3

主要試劑。對照品蘆?。兌取?8%，貴州迪大生物科技有限公司，批號0219-201409）；無水葡萄糖（貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，批號0209-201402）；甲醇[分析純，重慶川東化工（集團）有限公司]；乙醇[分析純，重慶川東化工（集團）有限公司]；石油醚（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；硝酸鋁（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鎂粉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；鹽酸（重慶川東化工有限公司）；亞硝酸鈉（重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（重慶川東化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大果木姜子中總黃酮的含量測定。

1.2.1.1

對照品溶液的制備。精密稱取蘆丁對照品，加甲醇制成0.2 mg/mL的溶液，即對照品溶液。

1.2.1.2

供試品溶液的制備。取大果木姜子粉末0.5 g，置于索氏提取器中，用石油醚脫脂處理，脫脂后的粉末置于100 mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇45 mL，加熱回流40 min，放冷，濾過，重復(fù)1次，合并濾液，定容至100 mL容量瓶，即得。

1.2.1.3

標準曲線的繪制。精密量取蘆丁對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別置于25 mL具塞試管，各加80%乙醇補足至5 mL，加入5%亞硝酸鈉0.5 mL，靜置6 min，加入10%硝酸鋁0.5 mL，靜置6 min，再加入1 mol/L NaOH 4 mL，靜置15 min，此時溶液呈橙紅色，以1號管為空白對照，于最大吸收波長（500 nm）處測吸光度，以蘆丁對照品溶液的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程。

1.2.1.4

樣品測定。取不同來源的大果木姜子樣品，按“1.2.1.2”方法制備樣品溶液，按“1.2.1.3”方法顯色并測定顯色后吸光度，計算樣品中總黃酮含量。

1.2.2

大果木姜子中總糖和還原糖的含量測定。

1.2.2.1

對照品溶液的制備。精密稱取葡萄糖對照品25 mg，加蒸餾水制成1 mg/mL的溶液，即對照品溶液。

1.2.2.2

總糖供試品溶液的制備。精密稱取樣品0.4 g，放入具塞錐形瓶中，加水30 mL，6 mol/L HCl 20 mL，于沸水浴中加熱水解40 min，取1滴水解液于白瓷板上，以碘-碘化鉀試劑檢查，水解液不呈藍色為水解完全，冷卻后加1滴酚酞指示劑以6 mol/L NaOH中和。靜置，過濾，并濾至100 mL容量瓶中，殘渣以水沖洗，然后定容至刻度，混勻，備用。

1.2.2.3

還原糖供試品溶液的制備。精密稱取樣品0.4 g于50 mL錐形瓶中，加少量水調(diào)成糊狀，再加20 mL水，置80 ℃水浴中加熱40 min，然后過濾于25 mL容量瓶中，以水沖洗殘渣，定容至刻度。

1.2.2.4

3，5-二硝基水楊酸（DNS）的配制。取1.0 g DNS溶于20 mL 1 mol/L NaOH溶液中，加50 mL水，再加入30 g酒石酸鉀鈉，溶解后加水稀釋定容至100 mL。

1.2.2.5

標準曲線的繪制。精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖50 mg于50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，混勻，配制成1 mg/mL的標準溶液。取7支試管（分別編號為1～7），按表1加試劑將各管混合均勻，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即在冷水中冷卻，再向各管加入蒸餾水至10 mL，混勻，先使用空白對照除去溶劑的影響，然后再測定葡萄糖溶液的最大吸收波長。于分光光度計483 nm處測定吸光度，并以葡萄糖濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程。

1.2.2.6 樣品測定。取不同來源大果木姜子樣品，按“1.2.2.2”和“1.2.2.3”制備供試品溶液，按“1.2.2.5”方法顯色并測定顯色后吸光度，計算樣品中總糖和還原糖含量。

1.2.3 大果木姜子中多糖的含量測定。

1.2.3.1

對照品溶液的制備。精密稱取葡萄糖對照品 25 mg，加蒸餾水制成1 mg/mL的溶液，即對照品溶液。

1.2.3.2

可溶性多糖供試品溶液的制備。精密稱取大果木姜子粉末（恒重）1.000 g，置100 mL具塞三角瓶中，每個樣品稱取2份（2次平行），加入80%乙醇45 mL回流提取，除去黃酮及皂苷、單糖等雜質(zhì)，再加水45 mL，浸泡30 min，超聲30 min，靜置過濾，再加入80%乙醇沉淀。重提1次（保存濾渣），2次濾液置100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。再精密吸取1 mL定容至10 mL，即得。

1.2.3.3

粗多糖供試品溶液的提取。將提取后的濾渣蒸干，加2%HCl 45 mL，置沸水浴中提取l h，充分放冷，濾過后濾液置于100 mL容量瓶中，濾渣重復(fù)提取1次，濾過，洗滌濾紙，合并濾液及洗滌液加入到容量瓶中，最后用2%HCl定容至刻度，再精密吸取1 mL定容至10 mL，即得。

1.2.3.4

蒽酮-濃H2SO4的配制。取98% H2SO4 6 mL稀釋至100 mL，精密稱取蒽酮0.1000 g，放入100 mL容量瓶中，逐漸加入上述配制的H2SO4溶液至刻度并搖勻，冷卻至室溫，備用。

1.2.3.5

標準曲線的繪制。將葡萄糖置于60 ℃下烘1 h，再逐漸升溫至105 ℃干燥至恒重。精密稱取5 mg置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至刻度。取5支試管，按表2加試劑。加入顯色劑后，于沸水浴中加熱10 min，冷卻1 h至室溫，于625 nm處測定吸光度，并以葡萄糖濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程。

1.2.3.6 樣品的測定。取不同來源大果木姜子樣品，按“1.2.3.2”和“1.2.3.3”制備供試品溶液，按“1.2.3.5”方法顯色并測定顯色后吸光度，計算樣品中多糖含量。根據(jù)下列公式計算多糖含量：多糖含量（%）=可溶性多糖含量（%）+粗多糖含量（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大果木姜子中總黃酮含量測定的方法學(xué)考察

2.1.1 標準曲線的建立。按照“1.2.1.3”操作，得出回歸方程為A=10.559C-0.007 9（r=0.999 1），蘆丁濃度在0.009 6～0.067 0 mg/mL的線性關(guān)系良好，根據(jù)吸光度來計算其含量是可靠的。

2.1.2

精密度試驗。精密吸取蘆丁對照品溶液1.0 mL于容量瓶中，按“1.2.1.3”方法顯色定容后測定，重復(fù)6次，RSD為0.82%，表明精密度良好。

2.1.3

重復(fù)性試驗。精密稱取同一樣品6份，每份0.5 g，按照“1.2.1.3”方法顯色定容后測定，測得樣品中總黃酮的平均含量為35.85 mg/g，RSD為2.99%，表明重復(fù)性良好。

2.1.4

穩(wěn)定性試驗。精密吸取大果木姜子樣品溶液1.0 mL，按照“1.2.1.3”方法顯色后放置0、20、40、60、80 min測定吸光度，結(jié)果表明，供試品溶液顯色后80 min內(nèi)基本穩(wěn)定，吸光度的RSD為1.90%，說明樣品在80 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5

回收率試驗。精密稱定已知含量的大果木姜子粉末6份，每份約0.25 g，置圓底燒瓶中，加入蘆丁對照品溶液適量。按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，按照“1.2.1.3”方法顯色并測定顯色后吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），大果木姜子黃酮的含量平均加樣回收率為98.09%，RSD為2.40%，表明該方法可行。

2.2 大果木姜子中總糖和還原糖含量測定的方法學(xué)考察

2.2.1

標準曲線的建立。按照“1.2.2.5”操作，得出回歸方程為A=6.091 8C-0.011 4（r=0.999 4），葡萄糖濃度在0.020 6～0.123 7 mg/mL的線性關(guān)系良好，根據(jù)吸光度來計算其含量是可靠的。

2.2.2

精密度試驗。精密吸取葡萄糖對照品溶液1.0 mL于容量瓶中，按照“1.2.2.5”方法顯色定容后測定，重復(fù)6次，RSD為0.21%，表明精密度良好。

2.2.3

重復(fù)性試驗。精密稱取同一樣品6份，每份0.4 g，按照“1.2.2.5”方法顯色定容后測定，測得樣品中總糖的平均含量為36.13%，RSD為2.30%；還原糖的平均含量為5.92%，RSD為2.30%，表明重復(fù)性良好。

2.2.4

穩(wěn)定性試驗。精密吸取總糖、還原糖供試品溶液1 mL于具塞試管中，按照“1.2.2.5”方法顯色后放置0、20、40、60、80、100 min測定吸光度，結(jié)果表明，供試品溶液顯色后100 min內(nèi)基本穩(wěn)定，總糖、還原糖的吸光度的RSD分別為2.50%、2.70%，說明樣品在100 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5

回收率試驗。精密稱取已知含量的大果木姜子樣品6份，每份0.2 g，分別精密加入一定量的葡萄糖對照品，按“1.2.2.2”和“1.2.2.3”方法制備供試品溶液，在483 nm處測定吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4～5），大果木姜子中總糖、還原糖的含量平均加樣回收率分別為98.65%、98.68%，RSD均為2.80%，表明該方法可行。

2.3 大果木姜子中多糖含量測定的方法學(xué)考察

2.3.1

標準曲線的建立。按照“1.2.3.5”操作，得出回歸方程為A=12.265C-0.010 1（r=0.999 2），葡萄糖濃度在0.008 0～0.056 1 mg/mL的線性關(guān)系良好，根據(jù)吸光度來計算其含量是可靠的。

2.3.2

精密度試驗。精確吸取葡萄糖對照品溶液1 mL，按照“1.2.3.5”方法顯色定容后測定，測定吸光度值，RSD為0.26%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3

重復(fù)性試驗。精密稱取同一樣品6份，每份1.0 g，按照“1.2.3.5”方法顯色定容后測定，測得樣品中多糖的平均含量為16.20%，RSD為2.53%，表明重復(fù)性良好。

2.3.4

穩(wěn)定性試驗。精確稱取樣品分別按“1.2.3.2”和“1.2.3.3”制備供試品溶液，按照“1.2.3.5”方法顯色后放置0、10、20、30、40、50、60 min測定吸光度，多糖吸光度的RSD為2.05%，表明供試品溶液顯色后60 min內(nèi)基本穩(wěn)定，說明樣品在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5

回收率試驗。精密稱定已知含量的大果木姜子粉末6份，每份0.5 g，置圓底燒瓶中，加入葡萄糖對照品溶液適量。按“1.2.3.2”和“1.2.3.3”制備供試品溶液，按照“1.2.3.5”方法顯色并依法測定顯色后吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表6），多糖平均加樣回收率為97.84%，RSD為2.02%，表明該方法可行。

2.4 樣品中黃酮類成分和糖類成分的含量

從表7可看出，大果木姜子中總黃酮、總糖、還原糖、多糖含量分別為（8.02±0.19）mg/g、（35.26±0.96）%、（4.78±0.95）%、（30.53±0.69）%。

3 小結(jié)

借鑒前人的方法，以蘆丁和葡萄糖為對照品，采用紫外分光光度計測定大果木姜子中總黃酮、總糖、還原糖、多糖的含量，比較樣品前處理方法和對照品，繪制標準曲線，并進行方法學(xué)考察，建立測定大果木姜子中總黃酮與糖類成分含量的方法。結(jié)果表明，大果木姜子中總黃酮含量為（8.02±0.19）mg/g，總糖含量為（35.26±0.96）%，還原糖含量為（4.78±0.95）%，多糖含量為（30.53±0.69）%。該方法快速、簡便、準確，可以用于大果木姜子中總黃酮與糖類成分含量的測定，為大果木姜子黃酮和糖類的分析檢測及開發(fā)利用提供依據(jù)，也為完善大果木姜子的質(zhì)量標準提供借鑒。

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