超聲波輔助提取藜麥多糖及其抑菌性與抗氧化性

徐瀾+郭晨晨+趙慧

摘要：為明確不同產(chǎn)地（山西省偏關(guān)縣、靜樂縣）藜麥種子的多糖提取率及其抑菌性、抗氧化性之間的差異，以蒸餾水為提取劑采用超聲波法輔助提取藜麥多糖，濾紙片法測定抑菌活性；采用消除DPPH自由基法測定水提多糖的抗氧化活性，并用維生素C作陽性對照。結(jié)果表明：藜麥種子在料液比為1 g ∶[KG-*3]10 mL時多糖提取率最高，且偏關(guān)縣藜麥的多糖提取率（2 094.5 μg/g）顯著高于靜樂縣藜麥的多糖提取率（1 781.5 μg/g）。藜麥多糖對DPPH自由基有清除能力，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)增大趨勢。藜麥多糖對大腸桿菌有較強抑菌效果，但對金黃色葡萄球菌抑菌性較弱。

關(guān)鍵詞：藜麥；多糖；紙片擴散法；抑菌性；抗氧化性

中圖分類號： R282.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0143-03[HS）][HT9.SS]

藜麥（Chenopodium quinoa Willd）是一年生的藜科雙子葉草本作物，原產(chǎn)于南美洲安迪斯山區(qū)。藜麥中含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白，且含量與肉類含量相當(dāng)，含有全部8種人體必需氨基酸[1]。除此之外，藜麥中含有豐富的淀粉、脂肪、礦物質(zhì)元素、維生素等。因此，藜麥被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，簡稱FAO）認為是唯一一種單體植物就能滿足人體基本營養(yǎng)需求的全類谷物[2]。藜麥有均衡營養(yǎng)、修復(fù)體質(zhì)、增強機體功能、調(diào)節(jié)免疫和內(nèi)分系統(tǒng)的作用，而且具有預(yù)防疾病、抗癌、抗衰老及抗氧化的功效，因此藜麥是減肥美容、減少人類慢性病的“功能食品”的優(yōu)秀代表。

作為生命四大基本物質(zhì)之一的高分子聚合物多糖，由醛基和酮基通過苷鍵連接，是動物、植物、微生物細胞的重要組成成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)、降血糖和抗病毒等重要功能[3]，因此，從很多動植物中都可以提取到多糖，近幾年關(guān)于多糖的提取及其作用的報道也越來越多。目前為止，已有研究者利用不同方法對紅豆、木瓜、銀杏葉、枸杞、黃芪等提取了多糖，并研究它們的抑菌性及抗氧化性[4-8]。結(jié)果表明，紅豆多糖和木瓜多糖有抗氧化活性，枸杞多糖、黃芪多糖和水溶性大豆多糖有抑菌效果。藜麥中含有的多糖、多酚、黃酮等活性物質(zhì)，具有很好的體外抗氧化活性和抑菌性。目前關(guān)于藜麥多糖提取方面的研究極少，未見關(guān)于藜麥多糖的抗氧化性及抑菌性的相關(guān)研究報道。

超聲波輔助提取固體樣品，利用超聲波作用液體時產(chǎn)生的空化作用和機械振動作用，使溶液內(nèi)產(chǎn)生氣泡，增長并爆破壓縮，導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)破裂[8]。它是物理粉碎過程，伴隨產(chǎn)生熱效應(yīng)和乳化作用，提高固體中多糖的提取率，具有節(jié)能、提取率高、節(jié)省提取時間的優(yōu)點；但如果溫度過高，滲出的雜質(zhì)也會增多，因此溫度不宜過高[9]。目前關(guān)于超聲輔助提取技術(shù)已成功應(yīng)用于提取木瓜多糖、銀杏葉多糖等，但超聲輔助提取藜麥多糖的研究較少見。本試驗采用超聲波輔助提取藜麥多糖，研究其抗氧化性和抑菌性，對于藜麥在功能食品、化妝品、醫(yī)藥、生物農(nóng)藥研發(fā)中的應(yīng)用提供參考，并為藜麥天然抗氧化劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與主要儀器

市售2個產(chǎn)地的藜麥種子（山西省忻州市偏關(guān)縣、靜樂縣）；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）：由西安沃爾森生物技術(shù)有限公司提供；試驗用水為蒸餾水。供試菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，均由忻州師范學(xué)院生物系微生物實驗室提供。UV-2102C型紫外可見分光光度計，由上海儀電分析儀器有限公司提供；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋，由上海云泰儀器儀表有限公司提供；Supcre系列菌落計數(shù)/篩選/抑菌圈測量聯(lián)用儀，由杭州迅數(shù)科技有限公司提供。

1.2試驗方法

1.2.1藜麥多糖的制備

原材料預(yù)處理：分別挑選市售偏關(guān)縣和靜樂縣2地藜麥中顆粒飽滿的種子，置于50 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過40目篩，密封備用。脫脂[5]：分別稱取偏關(guān)縣和靜樂縣的藜麥粉各5份，每份0.2 g，置于離心管中。向其中各加入2 mL石油醚，靜置過夜，4 000 r/min離心 10 min，棄去上清液。除單糖和低聚糖：向已經(jīng)脫脂的藜麥中加入2 mL 95%乙醇，靜置過夜，4 000 r/min離心10 min，棄去上清夜。將沉淀放在烘箱中，50 ℃烘干。

1.2.2多糖的提取

根據(jù)試驗設(shè)計，采用超聲波輔助提取藜麥多糖。按照1 ∶[KG-*3]5、1 ∶[KG-*3]10、1 ∶[KG-*3]15、1 ∶[KG-*3]20、1 ∶[KG-*3]25等5個不同的料液比（g ∶[KG-*3]mL），向各離心管中加入蒸餾水。在超聲功率 320 W、溫度50 ℃的條件下浸提40 min，提取藜麥多糖。浸提結(jié)束后4 000 r/min離心10 min，倒出濾液至另一離心管中，舍棄沉淀。向離心管中加入4倍體積的的95%乙醇，放置4 ℃冰箱中醇沉24 h，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀。沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，真空干燥，得到粗多糖。

1.2.3脫蛋白

粗多糖用5 mL蒸餾水溶解，向其中加入Sevage試劑1.2 mL[Sevage試劑：取100 mL三氯甲烷，向其中加入20 mL正丁醇，混勻，放入棕色瓶，備用。（Sevage法除蛋白：V多糖溶液 ∶[KG-*3]V氯仿 ∶[KG-*3]V正丁醇=25 ∶[KG-*3]5 ∶[KG-*3]1）][10]，混合物用微型漩渦混合儀劇烈振蕩20 min，4 000 r/min離心10 min。小心取出上層多糖溶液，棄去下層有機相和中間蛋白沉淀。

1.2.4醇沉

按照參考文獻[4]的方法進行醇沉，得到精制多糖。將提取的多糖用2 mL蒸餾水溶解得多糖溶液，放置于冰箱中冷藏備用。

1.2.5試驗設(shè)計

根據(jù)不同料液比提取的藜麥多糖質(zhì)量濃度結(jié)果，采用多糖提取率最高的料液比，按照上述方法，分別提取2 g偏關(guān)縣和靜樂縣藜麥多糖。并用20 mL蒸餾水溶解，制成多糖溶液，放置于冰箱中冷藏備用。

1.2.6標準曲線的制備精確稱取105 ℃干燥至質(zhì)量不變的葡萄糖對照品10 mg，加入蒸餾水定容至100 mL，得到 0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。分別吸取此溶液0、0.1、02、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL帶塞試管中，蒸餾水定容至1 mL，加入5 mL現(xiàn)配的蒽酮-硫酸試劑，充分搖勻，蓋塞，在沸水浴中15 min，取出后立即用冷水冷卻至室溫。用0號管調(diào)零，在620 nm波長下分別測得D620 nm。以D620 nm為縱坐標，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.7藜麥多糖抗氧化作用測定方法

DPPH溶液的配制[6]：準確稱取50 mg DPPH，用無水乙醇定容到100 mL，使DPPH的終濃度為0.5 mg/mL。取10 mL 0.5 mg/mL的 DPPH 溶液，用無水乙醇定容到100 mL，使DPPH的終濃度為0.05 mg/mL。將配好的DPPH溶液置于棕色瓶中，放置冰箱中，待用。

采用維生素C作陽性對照，將配制好的0.01 mg/mL的維生素C標準液置于棕色瓶中，放置冰箱中待用。

抗氧化能力的測定：分別吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 維生素C標準液，用蒸餾水定容到2 mL，加入濃度為0.05 mg/mL的DPPH 2 mL，充分混勻，放置到黑暗的地方，靜置30 min左右，測定其在517 nm的吸光度D1。同時測定 2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水混勻靜置30 min后的吸光度D0；以及在2 mL蒸餾水中加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL維生素C標準液，用蒸餾水定容至4 mL充分振蕩搖勻后的吸光度D2。以濃度確定的維生素C標準液的體積數(shù)為橫坐標，以DPPH·的清除率為縱坐標作圖。

DPPH·的消除率計算公式為：

[JZ]Y=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

采用上述方法[4]對偏關(guān)縣和靜樂縣的藜麥多糖提取液進行抗氧化能力的測定。

1.2.8藜麥多糖的抑菌作用

供試菌種的活化[11]：連續(xù)3次將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進行培養(yǎng)基斜面活化，采用試管牛肉膏蛋白胨固體作為培養(yǎng)基，第3次的菌體備用。菌懸液的制備[12]：用無菌接種環(huán)挑取少量活化的供試菌于無菌生理水中，用移液槍輕輕吹打使菌體分散，稀釋搖勻，用顯微鏡直接計數(shù)法計數(shù)，制成106～107 CFU/mL的菌懸液，待用。圓濾紙片的準備：用打孔器將濾紙裁制成直徑大小為6 mm的圓濾紙片，121 ℃高溫蒸汽滅菌30 min、干燥 30 min。

測定藜麥多糖提取液的抑菌性：在無菌操作臺中，將經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)10～15 mL，室溫下凝固，記號筆標記相應(yīng)的菌體及不同產(chǎn)地的藜麥多糖。夾取經(jīng)高溫蒸汽滅菌的圓濾紙片浸泡于藜麥多糖溶液中20 min，備用。用移液槍吸取 200 μL 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液至相應(yīng)平板上，用無菌涂布器涂布均勻。采用濾紙片擴散法，用無菌鑷子夾取含多糖溶液濾片平放于平板表面，每個板放置5個濾紙片，均勻分散在平板上。將各平板倒置在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，觀察其生長情況，用Supcre系列菌落計數(shù)/篩選/抑菌圈測量聯(lián)用儀記錄各平板抑菌圈直徑，求平均值。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用料液比為1 g ∶[KG-*3]10 mL時的藜麥多糖提取率，應(yīng)用Excel 2003對藜麥多糖提取率作圖，DPS 7.05統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1多糖質(zhì)量濃度的測定

2.1.1標準曲線的繪制

取7支具塞試管，按濃度梯度配制葡萄糖溶液，以D620 nm值為縱坐標，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。用最小二乘法得線性回歸方程：y=0.006 69x+0.029 2，r2=0.991 09。根據(jù)方程，可計算樣品中多糖質(zhì)量濃度（圖1）。

2.1.2樣品中多糖提取率的測定

由圖2、圖3可知，超聲波輔助提取藜麥多糖，在超聲波功率為320 W、溫度為50 ℃、提取時間為40 min的條件下，在料液比接近1 g ∶[KG-*3]10 mL時，偏關(guān)縣和靜樂縣的藜麥多糖提取率均為最高，且偏關(guān)縣的藜麥多糖提取率顯著高于靜樂的多糖提取率（表1）。因此，在相同提取條件下，本試驗選取1 g ∶[KG-*3]10 mL的料液比提取偏關(guān)縣和靜樂縣的藜麥各 2 g，得到精制多糖溶液。

2.2抗氧化作用的測定

2.2.1維生素C對DPPH·的清除能力由圖4可知，隨著維生素C標準液的體積的增加（0～2 mL），即隨著維生素C濃度的增加，維生素C標準液對DPPH·的清除率亦增強，且維生素C對DPPH·的清除作用較明顯。表明抗氧化劑維生素C作為陽性對照有良好的清除能力，即有良好的抗氧化性。

2.2.2樣品對DPPH·的清除能力由圖4、圖5、圖6可知，藜麥多糖和維生素C對DPPH·的清除率趨勢相同，清除率隨維生素C標準液、藜麥多糖提取液樣品體積的增加而增強。偏關(guān)縣、靜樂縣的藜麥多糖對DPPH·的清除率都隨著多糖溶液體積（0～2 mL）的增加而增強，對DPPH·清除率的趨勢基本相同。但由于偏關(guān)縣的藜麥多糖提取率（2 094.5 μg/g）高于靜樂縣的藜麥多糖提取率（1 781.5 μg/g），因此同體積多糖提取液相比較，偏關(guān)縣藜麥多糖對DPPH·的清除率高于靜樂縣藜麥多糖。

2.3抑菌作用的測定

由表2可知，偏關(guān)縣的藜麥多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌現(xiàn)象，但對大腸桿菌的抑菌作用較強，對金黃色葡萄球菌抑菌作用較弱。靜樂縣藜麥多糖對大腸桿菌有抑菌現(xiàn)象，但對金黃色葡萄球菌無抑菌現(xiàn)象。[FL）]

3結(jié)論與討論

本研究表明，偏關(guān)縣、靜樂縣2地藜麥多糖的提取率分別為 2 094.5、1 781.5 μg/g，均遠低于文獻[3]中0.16 g/g的藜麥多糖提取率。分析原因，首先是提取獲得的目標多糖不同，袁俊杰等提取的是粗制多糖[3]，而本試驗為逐級除雜后中提取的精制多糖；其次是前人以預(yù)處理后的藜麥質(zhì)量作為分母，計算多糖提取率，而本試驗以處理之前的藜麥質(zhì)量計算多糖提取率；此外，不同試驗設(shè)備以及操作過程中損失程度不同；除品種自身差異外，以上因素是造成藜麥多糖提取率差異較大的原因。研究表明，藜麥種子多糖得率在品種間存在明顯差異[3]，這與本試驗中不同產(chǎn)地的藜麥種子多糖提取率存在差異結(jié)果一致，可見藜麥多糖含量不僅與品種遺傳有關(guān)，也與生態(tài)環(huán)境、栽培條件有關(guān)。

不同產(chǎn)地的藜麥多糖均具有一定抗氧化能力，這與前人有關(guān)紅豆多糖、木瓜多糖等的研究結(jié)果一致。本試驗中偏關(guān)縣的藜麥多糖提取率大于靜樂縣藜麥多糖提取率，2地藜麥多糖對DPPH·的清除能力表現(xiàn)為相同趨勢，[JP2]即偏關(guān)縣的藜麥多糖清除DPPH·的能力較強，表現(xiàn)出的抗氧化能力也較強。藜麥多糖和維生素C對DPPH·的清除率趨勢相同。藜麥多糖具有抑菌作用，與文獻[11]結(jié)果基本一致。偏關(guān)縣產(chǎn)地的藜麥多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌現(xiàn)象，但靜樂縣產(chǎn)地的藜麥多糖僅對大腸桿菌有抑菌現(xiàn)象，對金黃色葡萄球菌無抑菌現(xiàn)象。這可能與靜樂縣產(chǎn)地的藜麥多糖提取率低于偏關(guān)縣產(chǎn)地的藜麥多糖提取率有關(guān)。有關(guān)不同產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境、栽培條件對藜麥種子營養(yǎng)成分及其抑菌性、抗氧化性的具體影響，有待進一步進行更加精確、系統(tǒng)的對比研究。[JP]

藜麥種子在料液比為1 g ∶[KG-*3]10 mL時多糖提取率最高，且偏關(guān)縣藜麥的多糖提取率（2 094.5 μg/g）顯著高于靜樂縣藜麥的多糖提取率（1 781.5 μg/g）。藜麥多糖對DPPH自由基有清除能力，且清除率隨著多糖體積的增加而呈現(xiàn)增大趨勢。藜麥多糖對大腸桿菌有較強抑菌效果，但對金黃色葡萄球菌抑菌性較弱。

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