茶樹等木本植物炭疽菌種群遺傳分化研究

劉威 尹鵬 王子浩 葉乃興

摘要：從福建省不同地區(qū)茶樹及其他木本植物上分離獲得38株炭疽病菌，采用rDNA-ITS序列分析方法對供試菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和種群分化研究。結(jié)果表明，炭疽菌不同種群遺傳多樣性豐富且存在遺傳差異，供試不同寄主來源炭疽病病菌在rDNA-ITS基因序列上存在一定的特異性，但不明顯。供試炭疽病病菌存在一定的寄主?；?，不具有地理來源特異性。序列比較結(jié)果顯示，菌株間的ITS序列同源性較高，但仍存在多種不同類型的堿基變異，包括堿基的缺失、突變、插入等。

關(guān)鍵詞：茶樹；木本植物；炭疽病菌；遺傳多樣性；ITS序列分析

中圖分類號： S435.711文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0042-03[HS）][HT9.SS]

炭疽病是刺盤孢屬真菌（Colletotrichum Corda）侵染植物引起的病害，種類繁多，寄主范圍廣泛，有記錄的寄主植物種類至少有176屬190種，包括果樹、林木、蔬菜、牧草、花卉等[1]，且不同種類的炭疽菌生物學(xué)、生理學(xué)特性多存在差異。炭疽病病菌侵染茶樹，引起茶樹感染炭疽病，該病的發(fā)生可影響茶樹的生長，降低茶葉的產(chǎn)量與品質(zhì)[2]。炭疽病病菌種間、種內(nèi)存在較多變異，甚至不同寄主之間也會存在一定的遺傳多樣性，這些遺傳變化影響炭疽病病菌的侵染特性、寄主選擇性、致病力、生物學(xué)特性，及對茶樹炭疽病的防治效果。為深入了解炭疽病病菌的遺傳多樣性特征，rDNA-ITS序列分析、限制性片段長度多態(tài)性分析等多種分子標(biāo)記技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用[3-4]。

絕大多數(shù)真菌rDNA-ITS區(qū)域基因序列具有廣泛的多態(tài)性，多數(shù)表現(xiàn)為種內(nèi)基因序列相對一致，而種間差異明顯的特點(diǎn)[5]。鑒于rDNA-ITS序列片段長度小且易于分析的特點(diǎn)，可以從其序列差異中得到足夠的信息用于種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育分析，現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用在真菌性病害的分類鑒定和病害診斷中[6-8]。本研究通過分析從福建省不同地區(qū)寄主為茶樹或其他木本植物上分離獲得的炭疽菌rDNA-ITS區(qū)域序列異同，探討福建省不同寄主來源炭疽病病菌以及不同地區(qū)茶樹炭疽菌的遺傳多樣性，將對今后炭疽病的防治工作提供參考。

1材料與方法

1.1供試菌株[HT]

從福建省茶樹上采集炭疽病病菌標(biāo)本，經(jīng)單孢分離獲得25株病原菌菌株，寄主為非茶樹木本植物的13株炭疽病菌菌株由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供，組成供試38株不同采集地區(qū)、不同寄主植物的炭疽病病菌標(biāo)本，菌株編號、種名、寄主植物、拉丁學(xué)名、采集地、GenBank登錄號等信息如表1所示。38株菌株均用馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）平板培養(yǎng)基保存于4～8 ℃冰箱中備用。

用真菌rDNA-ITS通用引物[JP3]ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[JP]對供試38株菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。試驗(yàn)PCR反應(yīng)的體系及其組成成分：5 ng模板DNA、1 μL上游引物、1 μL下游引物、5 μL PCR緩沖液、0.5 μL DNA聚合酶、4 μL dNTPs。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 52 s、56 ℃ 55 s、72 ℃ 60 s，共循環(huán)30次；71.5 ℃延伸11 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，用微量移液器吸取4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測其含量，切取電泳條帶經(jīng)純化后送上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2茶樹等炭疽菌遺傳多樣性分析

將供試38株炭疽病菌菌株的ITS基因序列用MEGA 6.0軟件的鄰結(jié)法（Neighbor-Joining，簡稱NJ）構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，以自展法對其進(jìn)行檢測，循環(huán)1 000次。采用軟件DNAMAN 6.0計(jì)算各菌株變異位點(diǎn)和堿基含量，并選用Kimura 2-parameter計(jì)算菌株間的遺傳距離。對供試的38株植物炭疽病病菌rDNA-ITS基因序列進(jìn)行遺傳多樣性檢測分析，比較茶樹炭疽菌與其他木本植物炭疽菌的序列差異。

2結(jié)果分析

2.1rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用通用引物ITS1、ITS4對38株供試炭疽菌菌株的 rDNA-ITS 區(qū)域擴(kuò)增，均能擴(kuò)增獲得1條特異性條帶，序列大小約為580 bp。擴(kuò)增的部分結(jié)果如圖1所示。

2.2遺傳多樣性分析

由圖2可知，在遺傳距離約為0.02處，38株炭疽病病菌菌株的進(jìn)化樹可分為3個(gè)類群，分別是Q1、Q2、Q3，其自檢支持率分別為98%、99%、99%；其中Q1群中包含的菌株最多，[FL）]

共26株，超過菌株總數(shù)的68%，其中有19個(gè)茶樹炭疽菌，7個(gè)其他木本植物炭疽菌。把Q1群可以再分為3個(gè)小群，分別為F1、F2、F3，F(xiàn)1、F2中菌株的寄主全為茶樹，F(xiàn)3中菌株的寄主則全為其他木本植物；Q2群中3個(gè)菌株也可以分為2類，其中AMX、RFS為一類，寄主為茶樹，YW寄主為魚尾葵，是非茶木本植物；Q3也可以再分為3個(gè)分支，分別為F4、F5、F6，F(xiàn)6中菌株的寄主全部為茶樹，F(xiàn)4、F5中菌株的寄主全部為非茶樹木本植物。從整個(gè)聚類樹來看，HQ與F1較近，且Q1、Q2、Q3中菌株寄主既有茶樹又有非茶木本植物，這說明供試炭疽菌存在一定的寄主?；?，但不具有嚴(yán)格的寄主?；浴Ｔ贔1群中，菌株RTG與其余菌株存在較大的遺傳差異；在F2群中，ZRG與其余菌株存在較大的遺傳差異。

2.3供試植物炭疽菌rDNA-ITS序列差異比較

38株炭疽病病菌菌株的T、A、C、G堿基出現(xiàn)的平均概率分別為23.6%、23.4%、27.5%、25.5%，寄主為茶樹的炭疽菌T、A、C、G堿基出現(xiàn)的平均概率分別為23.8%、23.5%、27.1%、25.6%，其他木本植物T、A、C、G堿基出現(xiàn)的平均概率分別為23.1%、23.3%、28.2%、25.4%，由此可以看出，寄主為茶樹與其他木本植物炭疽菌的各堿基出概率差別不明顯。各菌株rDNA基因存在一些堿基差異，以T堿基為例，出現(xiàn)的概率為21.9%～25.2%，茶樹與其他木本植物病原菌沒有明顯差異。25株寄主為茶樹的菌株基因序列長度為507～527 bp，其他木本植物基因序列長度為506～526 bp，兩者差別[CM（25]不大。供試菌株rDNA-ITS序列長度多樣性不豐富。采[CM）]

用MEGA 5.1計(jì)算38株炭疽病病菌菌株之間的遺傳距離，發(fā)現(xiàn)全部菌株的平均遺傳距離約為0.046，說明各菌株間的遺傳距離較小，其中最大遺傳距離為0.119，最小遺傳距離為0。

多基因序列比對的部分結(jié)果如圖3所示，堿基的變異多出現(xiàn)在ITS1區(qū)，炭疽菌種間與種內(nèi)均存在豐富的遺傳多樣性，比較38株供試菌株ITS序列，發(fā)現(xiàn)侵染茶樹的炭疽病病菌在第5 bp基因位點(diǎn)上均比侵染其他木本植物的炭疽病病菌多1個(gè)A堿基（圖3中箭頭所指位置），這可能與病原菌與寄主長期互作有關(guān)系。

3結(jié)論與討論

研究表明，以基因序列為基礎(chǔ)的核酸分析技術(shù)來評價(jià)物種之間的親緣關(guān)系是可行的，rDNA基因區(qū)域中18S與28S區(qū)域相對保守，屬內(nèi)差別不大，可用于屬的分類鑒定，ITS區(qū)域序列多樣性豐富，被普遍應(yīng)用于真菌種的鑒定中[10]。

本研究通過擴(kuò)增供試38株炭疽病病菌的rDNA-ITS序列，并對其基因序列進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)供試菌株之間存在豐富的堿基序列差異，序列比較結(jié)果表明，菌株間的ITS序列同源性較高，但仍存在多種不同類型的堿基及序列變異，包括堿基的缺失、突變、插入等，這與ITS區(qū)段為非結(jié)構(gòu)基因、進(jìn)化速度比結(jié)構(gòu)基因快有關(guān)[11]。與其他木本植物炭疽菌相比，茶樹炭疽菌在5 bp基因位點(diǎn)上存在特異的堿基A，這一堿基變異可能與炭疽病病菌適應(yīng)寄主茶樹有關(guān)，還需擴(kuò)大供試其他木本植物范圍進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步研究該變異與病原菌侵染性的關(guān)系。ITS序列的變異雖不一定是造成炭疽菌能侵染茶樹的原因，但這些變異可能使病原菌更易侵染茶樹或者在茶樹體內(nèi)更好地生長。此外，還需對與病原菌侵染寄主直接相關(guān)的基因進(jìn)行研究，以便更好地了解炭疽病病菌侵染茶樹的內(nèi)在機(jī)制。

遺傳多樣性檢測分析結(jié)果表明，供試茶樹炭疽菌rDNA-ITS[CM（21*3]基因序列與其他植物炭疽菌存在一定的特異性，[CM）]

但特異性不明顯。同一采集地區(qū)的供試菌株在聚類圖上沒有相似性，說明供試菌株在福建省內(nèi)沒有地理來源特異性。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉詩胤，邱海萍，姜華，等. 浙江地區(qū)不同寄主來源的炭疽菌ITS序列PCR-RFLP多態(tài)性分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（1）：61-65.

[2]譚濟(jì)才. 茶樹病蟲防治學(xué)[M]. 2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：10-18.

[3]Hyde K D，Cai L，Ehc M K，et al. Colletotrichum：a catalogue of confusion[J]. Fungal Diversity，2009，39（2）：1-17.

[4]Karén O，Hogberg N，Dahlberg A，et al. Inter-and intraspecific variation in the ITS region of rDNA of ectomycorrhizal fungi in Fennoscandia as detected by endonuclease analysis[J]. New Phytologist，1997，136（2）：313-325.

[5]陳劍山，鄭服叢. ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（13）：3785-3786，3792.

[6]牛憲立，姬可平，吳群，等. rDNA ITS區(qū)序列分子標(biāo)記技術(shù)在植物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 生物信息學(xué)，2009，7（4）：268-271.

[7]白樹猛，田黎. ITS序列分析在真菌分類鑒定和分子檢測中的應(yīng)用[J]. 畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（1）：52-53，189.

[8]Chen J，Xu L L，Liu B，et al. Taxonomy of Dactylella complex and Vermispora. I. Generic concepts based on morphology and ITS sequences data[J]. Fungal Diversity，2007，26（1）：73-83.

[9]Guerber J C，Liu B，Correll J C，et al. Characterization of diversity in Colletotrichum acutatum sensu lato by sequence analysis of two gene introns，mtDNA and intron RFLPs，and mating compatibility[J]. Mycologia，2003，95（5）：872-895.[ZK）]

[10]楊臘英，黃華平，唐復(fù)潤，等. 香蕉炭疽菌rDNA ITS區(qū)的分子鑒定與檢測[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2006，36（3）：219-225.

[11]Xu P F，Han Y P，Wu J J，et al. Phylogenetic analysis of the sequences of rDNA internal transcribed spacer （ITS） of Phytophthora sojae[J].