資源植物玉葉金花果實多糖的提取工藝研究

趙玉立+程鑫+潘絨+黃京京+李發(fā)壯+胡曉倩

摘 要：采用醇沉水提法從資源植物玉葉金花果實中提取粗多糖，通過乙醚脫脂、Savage法脫蛋白得到精多糖。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗，探討pH值、浸提時間、料液比、乙醇醇析體積倍數(shù)對玉葉金花果實中精多糖提取率的影響。結(jié)果表明，玉葉金花果實中精多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶15（g·mL-1），浸提時間3 h，pH值6，乙醇醇析體積倍數(shù)1∶4。在此提取工藝條件下，提取率為2.71%；通過驗證此最佳提取工藝穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：資源植物；玉葉金花；多糖；單因素試驗；正交試驗

中圖分類號：Q946.3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.08.004

Abstract： The crude polysaccharide in the resource plant of Mussaenda esquirolli Lévl. fruit was extracted by alcohol-water extraction， and then the refined polysaccharide were got using degreasing of ether and eluting protein of Sevage reagent. Comparison of single-factor test and then using orthogonal test of L9 （34）， 4 factors such as pH， extraction time， liquid ratio， times the size of ethanol alcohol -precipitated to the refined polysaccharide extraction were studied with the extract yield for the evaluation. The results showed that the best conditions for extraction were extracting liquid than 1∶15（g·mL-1）， extraction time 3 h， pH 6， 4 times the size of ethanol alcohol-precipitated. Under this extraction process conditions， extract yield was 2.71%， the optimum extraction process was stable and feasible.

Key words： resource plant； Mussaenda esquirolli Lévl.； polysaccharide； single-factor test； orthogonal test

玉葉金花（Mussaenda esquirolli Lévl.），又名白紙扇、野白紙扇、白葉子、涼藤子、大涼藤、小涼藤，屬茜草科（Rubiaceae）玉葉金花屬（MussaendaLinn）[1]。玉葉金花的花期在每年的 4—8月，可長達 100 d以上。開花時，葉狀雪白的萼片及金黃色的花冠顯現(xiàn)在樹冠上，顏色鮮艷而奇美；玉葉金花枝條細軟，既可作造型盆景，也可作建筑的垂直綠化，極具觀賞價值。玉葉金花的莖、葉、根、藤均可入藥，味甘、淡、涼，具有清熱解暑、涼血解毒的功效[2-4]。由玉葉金花制成的保健茶，短期飲用具有潤腸舒胃、提高免疫力、預(yù)防流感等功效，長期飲用可以保持身體健康，促進微循環(huán)。另外，玉葉金花在綠化環(huán)境、凈化空氣、涵養(yǎng)水源、保持水土、改善生態(tài)環(huán)境等方面極具生態(tài)價值。因此，玉葉金花是具有觀賞、藥用、保健和生態(tài)等多種價值的資源植物。

多糖是由超過10 個以上、通常由幾百甚至幾千個單糖分子聚合而成的一類化合物，由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成，糖苷鍵分為α型和β型2 種。近年來，由于植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等多種生物活性，且具有毒副作用小、不易造成殘留等優(yōu)點[5-6]，對植物多糖的研究呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢。但目前，對植物多糖的研究多集中在藥理作用等方面，而對植物多糖進一步的分離純化、結(jié)構(gòu)測定、結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系及在食品、農(nóng)業(yè)、工業(yè)方面的開發(fā)應(yīng)用等研究較少。

有研究表明，玉葉金花葉、莖主要含有豆甾醇、β-谷甾醇、三萜酸類阿江酸、蘇索酸、咖啡酸、對-羥基桂皮酸、阿魏酸、山梔子苷甲酯等活性成分[7]，但對玉葉金花的活性成分多糖研究甚少，尤其是對玉葉金花果實中多糖的提取及功能的研究還未見報道。

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗，優(yōu)化玉葉金花果實多糖的提取工藝，旨在為資源植物玉葉金花的深入綜合開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料 玉葉金花果實采自黃山市屯溪區(qū)黃山學(xué)院南校區(qū)，由黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院張慧沖副教授鑒定。

1.1.2 試劑及儀器設(shè)備 95%乙醇、無水乙醇、無水乙醚、三氯甲烷、正丁醇、葡萄糖、濃硫酸、蒽酮、氫氧化鈉、鹽酸等，均為國產(chǎn)分析純。

HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），TDL-5臺式低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司），SHZ-IIID循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠），BCD-171D容聲電冰箱（廣東科龍電器股份有限公司），YP3001N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），PL203電子精密天平（梅特勒-托利儀器上海有限公司），DGX-9073B-2電熱鼓風干燥箱（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司），UV754紫外可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 玉葉金花果實中粗多糖的提取 玉葉金花干果實磨粉，過0.04 mm篩備用。準確稱取10.0 g玉葉金花干果實粉末，用蒸餾水浸提后用2層紗布過濾，離心取上清液，重復(fù)浸提2次，合并濾液；減壓濃縮至 20 mL，然后加入一定量的95%乙醇進行醇析沉淀，4 ℃靜置24 h，4 000 r·min-1離心 10 min 收集沉淀；用20 mL無水乙醇洗沉淀，靜置30 min后，離心棄上清液，重復(fù)洗2次，4 000 r·min-1 離心 10 min 收集沉淀，烘干稱質(zhì)量，即為粗多糖的含量[8-11]。

1.2.2 玉葉金花果實中粗多糖的精制 取醇析后得到的多糖沉淀物脫脂：用無水乙醇洗沉淀2次，再用無水乙醚洗3次。取20 mL蒸餾水溶解脫脂后的粗多糖，加入20 mL Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），振蕩15 min，3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液重復(fù)多次去游離蛋白，至分離液面交界處無白色混合物，加95%乙醇醇析上清液，4 ℃靜置24 h，4 000 r·min-1離心 10 min 收集沉淀，50 ℃烘干至恒質(zhì)量后，稱量精多糖含量[8-11]。

1.2.3 蒽酮-硫酸比色法測定玉葉金花果實中精多糖含量 （1）葡萄糖標準曲線的繪制。準確稱取干燥恒質(zhì)量的無水葡萄糖標準品100.00 mg，加入蒸餾水將其溶解，定容在 100 mL 的容量瓶中，配成 1.00 mg·mL-1的葡糖糖對照品溶液；分別準確移取葡萄糖標準溶液 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，

3.0，3.5 mL，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻得系列0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 mg·mL-1標準溶液[12]。

（2）蒽酮試劑的配制。準確稱取蒽酮0.100 g至小燒杯中，緩慢加入50 mL濃硫酸，邊加邊攪拌至黃色透明液體，用棕色試劑瓶裝好，置冰箱內(nèi)避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用[13]。

（3）玉葉金花果實中精多糖溶液的配制。準確稱取50 ℃烘干至恒質(zhì)量的玉葉金花果實中精多糖提取物100.00 mg，用蒸餾水溶解定容在100 mL容量瓶中，準確移取2.5 mL至25 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，用配制好的精多糖溶液測定其吸光度值，再計算出玉葉金花果實中精多糖的含量。

（4）玉葉金花果實中精多糖含量的測定。準確移取葡萄糖標準溶液和玉葉金花果實中精多糖溶液各1 mL至具塞試管中，另準確移取1 mL蒸餾水作為空白對照，沿各試管壁緩慢加入5 mL預(yù)冷的蒽酮試劑，蓋緊塞子，振蕩搖勻，沸水浴中加熱10 min，取出，冷水流中冷卻20 min，620 nm下測定吸光度值（A）[14]。以吸光度（A）對葡萄糖濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程Y=6.135 7X-0.030 7及 R2值（R2= 0.998 2） （圖1）。

按1.2.1方法提取玉葉金花果實中精多糖，配制玉葉金花果實中精多糖溶液。按標準曲線測定方法測定玉葉金花果實中精多糖的含量，并根據(jù)以下公式計算玉葉金花果實中精多糖的含量[15]。玉葉金花果實中精多糖含量W= C1/C0×100%。

玉葉金花果實中精多糖吸光度A=0.144，將其代入回歸方程Y=6.135 7X-0.030 7，得玉葉金花果實中精多糖濃度C1；配制的玉葉金花果實中精多糖濃度C0=0.1mg·mL-1，代入公式計算，得玉葉金花果實中精多糖含量W=28.5%。

玉葉金花精多糖提取率=X×V/M×100%。式中，X為樣液的濃度（g·mL-1），V為樣液的體積（mL），M 為玉葉金花質(zhì)量（g）。

1.2.4 玉葉金花多糖提取工藝的優(yōu)化

（1）單因素試驗。取玉葉金花粉末 10.00 g，按 1.2.1的方法，研究料液比、浸提時間、乙醇醇析的體積、pH值4 個因素對玉葉金花果實中精多糖提取率的影響。

（2）正交試驗。以單因素試驗為基礎(chǔ)，選擇料液比、浸提時間、乙醇醇析的體積、pH值 4 個因素，以多糖提取率為指標，采用 L9（34）正交試驗進行設(shè)計，其因素與水平如表 1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉葉金花果實中精多糖提取率的單因素試驗

2.1.1 料液比對玉葉金花果實中精多糖提取率的影響 取玉葉金花果實粉末 10.00 g，分別按1∶5，

1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g·mL-1）的料液比溶于水，90 ℃恒溫水浴 2 h，抽濾，濾液在1.2.1，1.2.2，

1.2.3條件下純化，并測定玉葉金花果實中精多糖提取率（圖2）。

由圖 2可知，在一定范圍內(nèi)，隨著浸提液體積的增加，玉葉金花果實精多糖提取率逐漸增加；當料液比為 1∶15（g·mL-1）時，玉葉金花果實精多糖提取率最高，再進一步增大浸提液體積至 1∶25（g·mL-1），玉葉金花果實精多糖提取率基本維持恒定。

2.1.2 pH值對玉葉金花果實中精多糖提取率的影響 取玉葉金花果實粉末 10.00 g，按1∶15（g·mL-1）的料液比溶于蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值分別為3，4，5，6，7， 90 ℃恒溫水浴 2 h，抽濾。濾液在1.2.1，1.2.2，1.2.3條件下純化，并測定玉葉金花果實中精多糖提取率（圖 3）。

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著pH值增加，玉葉金花果實中精多糖提取率也增加；當pH值為5時，提取率最高；之后再增加pH值，提取率反而下降。

2.1.3 乙醇醇析的體積對玉葉金花果實中精多糖提取率的影響 取玉葉金花果實粉末 10.00 g，按1∶15（g·mL-1）的料液比溶于蒸餾水，90 ℃恒溫水浴2 h，抽濾，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的濃縮液，分別按1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5（濃縮液∶乙醇體積）比例醇析，4 ℃醇析24 h，在1.2.1，1.2.2，1.2.3條件下純化，并測定玉葉金花果實中精多糖提取率（圖4）。

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇醇析的體積成倍增加，玉葉金花多糖的提取率增加，在1∶3的體積比時提取率達最大，之后乙醇醇析體積再增加對精多糖提取率基本沒有大的影響。

2.1.4 浸提時間對玉葉金花果實中精多糖提取率的影響 取玉葉金花果實粉末 10.00 g，按 1∶15（g·mL-1）的料液比溶于蒸餾水，90 ℃恒溫水浴分別1，2，3，4，5 h，抽濾，濾液在1.2.1，1.2.2，1.2.3條件下純化，并測定玉葉金花果實中精多糖提取率，其結(jié)果如圖 5所示。

由圖5可知，浸提時間在1～3 h，玉葉金花果實中精多糖提取率隨著浸提時間的延長而增加，在3 h時提取率達到最大；之后浸提時間再增加，提取率基本維持恒定。為了減少能耗，浸提時間控制在3 h。

2.2 玉葉金花果實中精多糖提取的正交試驗結(jié)果與方差分析

F檢驗結(jié)果表明，pH值對試驗結(jié)果有顯著影響；而其他各因素對綜合評價值的影響不顯著，故不必再進行各因素水平間的多重比較。此時，可直觀地從表2中選擇提取率最大的組合 A3B3C2D3為最優(yōu)組合，即pH值6、浸提時間3 h，料液比1∶15（g·mL-1），乙醇醇析體積倍數(shù)1∶4。

2.3 驗證正交試驗結(jié)果

由正交試驗優(yōu)選得最優(yōu)提取工藝為：料液比1∶15、浸提時間3 h，pH值6、乙醇醇析體積倍數(shù)1∶4。由此進行3個平行驗證試驗，其他步驟同1.2.1，結(jié)果如表4所示，在料液比1∶15、浸提時間3 h、pH值6、乙醇醇析體積倍數(shù)為1∶4的條件下，玉葉金花果實的精多糖平均提取率為2.71%。

3 結(jié)論與討論

本試驗采取醇沉水提法提取玉葉金花果實中精多糖的研究工藝，利用了多糖是強極性分子、具有溶于水而不溶于有機溶劑的特點，同時探討了pH值、浸提時間、料液比、乙醇醇析體積倍數(shù)4個因素對玉葉金花果實精多糖提取率的影響。單因素試驗中pH值對玉葉金花果實精多糖提取率的影響是最大的，其次是浸提時間和料液比，乙醇醇析體積倍數(shù)是影響最小的因素。正交試驗結(jié)果也從理論上支持了上述論斷。最終優(yōu)化后的最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶15（g·mL-1），浸提時間3 h，pH值6，乙醇醇析體積倍數(shù)1∶4，在此條件下，玉葉金花果實中精多糖的提取率為2.71%，多糖含量為28.50%。

新采摘的玉葉金花果實，凝膠黏性大，會導(dǎo)致研磨破碎不完全，使多糖提取率降低，本試驗將玉葉金花果實烘干再復(fù)水提取則解決了這個問題。除蛋白步驟，本試驗采用搖床搖動，使 Sevage 試劑與多糖提取液充分接觸，除蛋白效果更好。在調(diào)節(jié)pH值時應(yīng)注意一定要邊攪拌邊緩慢調(diào)節(jié)，避免出現(xiàn)浸提液酸堿不均勻，防止突然過酸或過堿對試驗結(jié)果造成影響。浸提時間一定要精確控制，以免出現(xiàn)浸提時間過長或過短對試驗結(jié)果造成影響。在進行料液比設(shè)置時，應(yīng)先將所需蒸餾水準確量取好再進行浸提，不能直接加入蒸餾水避免水量過多。在進行乙醇醇析時，應(yīng)盡量保證將所有試驗組同時放入4 ℃冰箱中，以減少室溫對醇析效果的影響。

具觀賞、藥用、保健和生態(tài)等多種功能的資源植物玉葉金花，育種和栽培容易完成，但目前對玉葉金花的臨床研究和制劑開發(fā)應(yīng)用研究仍較缺乏，將來可以考慮對未被利用的組織“果實”加強開發(fā)利用。本研究不僅可為玉葉金花多糖提取提供最佳工藝，同時也可為多糖的后續(xù)應(yīng)用研究開發(fā)提供理論支撐，提高玉葉金花植株深加工的經(jīng)濟價值和綜合開發(fā)價值。

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