賴氨酸二肽對奶牛乳腺mTOR信號通路元件基因表達的影響

周苗苗，崔景香

(山東濰坊科技學(xué)院 動物科學(xué)研究所，山東壽光 262700)

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賴氨酸二肽對奶牛乳腺mTOR信號通路元件基因表達的影響

周苗苗，崔景香

(山東濰坊科技學(xué)院 動物科學(xué)研究所，山東壽光 262700)

為研究賴氨酸二肽對奶牛乳腺組織中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的影響，在體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織培養(yǎng)液中分別添加賴氨酸-賴氨酸、賴氨酸-亮氨酸和賴氨酸-組氨酸二肽，等量取代培養(yǎng)液中φ=5%、5%和15%的游離賴氨酸(賴氨酸總質(zhì)量濃度為210 mg/L)；在此基礎(chǔ)上，在賴氨酸組和賴氨酸-賴氨酸二肽5%取代組分別添加終濃度為0和100 nmol/L的mTOR抑制劑雷帕霉素。試驗結(jié)束后收集乳腺組織用于αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1的基因表達檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與游離氨基酸相比，添加3種賴氨酸二肽顯著增加αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因的表達；添加雷帕霉素抑制上述基因的表達，賴氨酸-賴氨酸二肽可以降低雷帕霉素的抑制作用。結(jié)果表明，除作為合成底物外，賴氨酸二肽還可能通過調(diào)控mTOR信號通路促進乳蛋白的合成。

賴氨酸二肽；αs1酪蛋白；mTOR；奶牛乳腺組織

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路能感受來自營養(yǎng)素、胰島素和生長因子、能量及壓力信號控制細胞生長[1]。mTOR作為真核生物細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)的組成部分發(fā)揮著顯著而廣泛的作用。氨基酸是奶牛乳蛋白合成的前體物質(zhì)。除作為營養(yǎng)元素外，氨基酸也可作為信號分子通過mTOR信號通路來調(diào)節(jié)mRNA的翻譯起始，進而調(diào)控乳蛋白的合成[2-3]。已有研究[4-5]表明，除氨基酸外，奶牛乳腺組織也攝取血液循環(huán)中的小肽(2～3個氨基酸組成)用于合成乳蛋白。為探討小肽除作為乳蛋白合成前體物質(zhì)之外的其他可能作用，本試驗研究賴氨酸(lysine, Lys)二肽對體外培養(yǎng)奶牛乳腺組織的乳蛋白合成和mTOR信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 奶牛乳腺組織的制備和體外培養(yǎng)

采集3頭泌乳中后期的中國荷斯坦奶牛乳腺組織，清洗并剪碎至1 mm3大小，種植于6孔細胞板孔(Corning, USA)，于37 ℃,φ=5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)組織塊穩(wěn)定貼壁后，每孔添加2 mL培養(yǎng)液[6]。培養(yǎng)液組成為：基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)-F12 (Gibco, USA)、10 g/L谷氨酰胺、100 000 IU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、5 mg/L 胰島素、500 μg/L催乳素、1 mg/L氫化可的松和φ=10%的胎牛血清(fetal calf serum, FCS，杭州四季青生物工程材料有限公司)。

1.2 試驗設(shè)計

去除乳腺組織培養(yǎng)液中的胎牛血清，分別添加氨基酸、苯丙氨酸(phenylalanine, Phe) 117 mg/L、蘇氨酸(threonine, Thr) 135 mg/L、蛋氨酸(methionine, Met) 60 mg/L、Lys 210 mg/L、亮氨酸(leucine, Leu) 214 mg/L、異亮氨酸(isoleucine, Ile) 120 mg/L、纈氨酸(valine, Val) 154 mg/L、組氨酸(histidine, His) 45 mg/L。然后按如下方案進行試驗設(shè)計。

1.2.1 Lys二肽等量替代游離Lys 分別以Lys總量(210 mg/L)φ=5%的Lys-Leu、φ=5%的Lys-Lys以及φ=15%的Lys-His替代乳腺組織培養(yǎng)液中等量的Lys(表1)。為保持各氨基酸總質(zhì)量濃度(肽結(jié)合氨基酸+游離氨基酸)不變，相應(yīng)調(diào)整各處理組Lys、His和Leu的添加量。培養(yǎng)48 h后，分別收集乳腺組織用于總RNA提取。每個處理重復(fù)3次。

表1 Lys二肽等量替代游離LysTable 1 Equivalent replacement of free lysine by lysine dipeptide

1.2.2 不同劑量雷帕霉素的添加 在游離Lys組和Lys-Lysφ=5%等量替代組培養(yǎng)液中分別添加雷帕霉素(Sigma, USA)，使其終濃度分別為0和100 nmol/L(表2)，乳腺組織培養(yǎng)48 h后，分別收集用于總RNA提取。每個處理重復(fù)3次。

表2 不同劑量雷帕霉素的添加Table 2 Addition of different dose of rapamycin

1.3 基因mRNA豐度檢測

用Trizol (Invitrogen, USA)提取組織中的總RNA。以紫外吸光法檢測RNA純度(OD260nm/OD280nm>1.80)。抽提的RNA溶解后立即用于第一鏈cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄在0.2 mL PCR管中進行，反應(yīng)體系為10 μL：2 μL PrimeScriptTMBuffer (5×)、0.5 μL PrimeScriptTMRT、0.5 μL Oligo (dT) primer (25 μmol/L)、0.5 μL Random 6 mer (50 μmol/L; Takara, 大連)和6.5 μL RNA (500 ng)；反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min。然后于85 ℃孵育5 s終止反應(yīng)。合成的cDNA貯存于-20 ℃，備用。

用實時熒光定量PCR方法檢測αs1酪蛋白、mTOR、真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1 (eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1， 4E-BP1)、S6激酶1 (S6 kinase 1， S6K1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA豐度。所用引物信息見表3。PCR反應(yīng)在96孔板中進行，20 μL反應(yīng)體系包括：SYBR○RPremix ExTaqTM(2×) 10.0 μL [Takara, 寶生物工程(大連)有限公司]、PCR正向引物(10 μmol/L) 0.4 μL、PCR反向引物(10 μmol/L) 0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.4 μL (Takara, 寶生物工程(大連)有限公司)、純水6.8 μL和cDNA 2 μL。用純水替代cDNA模板作為陰性對照。ABI 7500實時定量序列檢測軟件(Applied Biosystems, USA)自動讀取Ct值。所有被測基因的擴增效率均在100%～105%。采用2-△△Ct方法計算每個目的基因 mRNA的相對表達量。

表3 實時熒光定量引物信息Table 3 Primer information used in real-time PCR

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用Excel軟件處理，用SAS軟件PROC-GLM程序統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 賴氨酸二肽對αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因表達的影響

在培養(yǎng)液中添加賴氨酸二肽可以影響奶牛乳腺組織中αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1的基因表達(圖1)。同游離Lys組相比，Lys-Leu、Lys-Lys和Lys-His二肽組αs1酪蛋白、mTOR和 4E-BP1的mRNA表達均顯著提高(P<0.05)；Lys-Lys和Lys-His的添加促進 S6K1的基因表達(P<0.05)。

2.2 雷帕霉素對αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因表達的影響

添加mTOR抑制劑雷帕霉素能顯著抑制游離Lys組奶牛乳腺組織αs1酪蛋白基因的表達(P<0.05，圖2)。與不添加雷帕霉素的Lys-Lys組相比，雷帕霉素(終濃度100 nmol/L)降低Lys-Lys組奶牛乳腺組織αs1酪蛋白mRNA的表達豐度，但差異不顯著(圖2)。不添加和添加終濃度為100 nmol/L的雷帕霉素時，Lys-Lys組奶牛乳腺組織αs1酪蛋白mRNA表達豐度均高于Lys組(P<0.05，圖2)。

圖中柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同 Bars with different lowercase letters are statistically different (P<0.05),the same below
圖1 不同賴氨酸二肽處理的基因表達
Fig.1 Gene expression under different peptide-bound Lys

圖2 不同濃度雷帕霉素處理的αs1酪蛋白基因表達Fig.2 αs1 casein gene expression under different concentration of rapamycin

添加雷帕霉素能顯著抑制游離Lys組和Lys-Lys組奶牛乳腺組織mTOR基因的表達(P<0.05，圖3)。不添加和添加終濃度為100 nmol/L的雷帕霉素時，Lys-Lys組奶牛乳腺組織mTORmRNA表達豐度均高于Lys組(P<0.05，圖3)。

添加雷帕霉素能顯著抑制游離Lys組和Lys-Lys組奶牛乳腺組織 4E-BP1基因表達(P<0.05，圖4)。不添加雷帕霉素時，Lys-Lys組奶牛乳腺組織 4E-BP1 mRNA表達豐度顯著高于Lys組(P<0.05，圖4)。當(dāng)添加終濃度為100 nmol/L 的雷帕霉素時，Lys-Lys組 4E-BP1 mRNA表達豐度雖高于Lys組，但差異不顯著(圖4)。

圖3 不同濃度雷帕霉素處理的mTOR基因表達Fig.3 mTOR gene expression under different concentration of rapamycin

圖4 不同濃度雷帕霉素處理的 4E-BP1基因表達Fig.4 4E-BP1 gene expression under different concentration of rapamycin

添加雷帕霉素能顯著抑制游離Lys組和Lys-Lys組奶牛乳腺組織 S6K1基因表達(P<0.05，圖5)。不添加雷帕霉素時，Lys-Lys組奶牛乳腺組織 S6K1 mRNA表達豐度顯著高于Lys組(P<0.05，圖5)。添加終濃度為100 nmol/L的雷帕霉素時，Lys-Lys組 S6K1 mRNA表達豐度高于Lys組，但差異不顯著(圖5)。

圖5 不同濃度雷帕霉素處理的 S6K1基因表達Fig.5 S6K1 gene expression under different concentration of rapamycin

3 討 論

3.1 賴氨酸二肽對αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因表達的影響

氨基酸可以作為信號分子通過活化蛋白激酶mTOR調(diào)控 4E-BP1和 S6K1等蛋白的磷酸化進而參與乳蛋白的合成調(diào)控[7]。Moshel等[2]利用體外培養(yǎng)的泌乳乳腺上皮細胞模型研究氨基酸對翻譯過程的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基酸經(jīng)由mTOR信號途徑調(diào)控乳腺上皮細胞中乳蛋白的合成速率。Prizant等[3]研究體外培養(yǎng)的泌乳鼠乳腺上皮細胞中必需氨基酸通過mTOR通路在蛋白合成中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自于氨基酸的正負調(diào)控信號通過mTOR信號傳導(dǎo)通路聯(lián)合胰島素調(diào)控來調(diào)節(jié)總蛋白和乳腺上皮細胞中特殊乳蛋白的合成速率。同樣，小肽也能作為信號分子發(fā)揮作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有很多諸如L-京都啡肽(L-Tyr-L-Arg)、肌肽(β-Ala-His)、Cys-Gly、Gly-Gln和N-乙酰-Asp-Glu等的神經(jīng)小肽發(fā)揮重要作用[8]。因此，小肽極有可能在乳腺中作為信號分子通過mTOR信號途徑調(diào)節(jié)乳蛋白的合成。本試驗結(jié)果表明，在培養(yǎng)液中添加3種賴氨酸二肽均顯著促進奶牛乳腺組織中αs1酪蛋白基因的表達(P<0.05)；Lys二肽亦可影響mTOR信號通路中3種主要效應(yīng)元件mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因的表達。與游離Lys組相比，Lys-Leu、Lys-Lys和Lys-His二肽均顯著提高mTOR和 4E-BP1 mRNA的表達豐度(P<0.05)；Lys-Lys和Lys-His則促進 S6K1基因的表達(P<0.05)。結(jié)果提示，同氨基酸一樣，某些Lys二肽也可能通過mTOR信號途徑參與對乳蛋白合成調(diào)控。

3.2 雷帕霉素對αs1酪蛋白、mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因表達的影響

哺乳動物TOR聯(lián)合調(diào)節(jié)蛋白(Raptor)對維持mTOR活性來說是必需的，它對mTOR活性發(fā)揮正調(diào)控作用[9]。雷帕霉素是mTOR的功能抑制劑，它可以干擾mTOR-Raptor的交互作用，進而阻止mTOR活化S6K和4E-BP[9-11]。為進一步研究小肽對mTOR信號通路的影響，試驗選擇在游離Lys組和Lys-Lys 5%等量替代組培養(yǎng)液中分別添加終濃度為0和100 nmol/L的雷帕霉素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素顯著抑制游離Lys組奶牛乳腺組織αs1酪蛋白基因的表達(P<0.05)，但對Lys-Lys組αs1酪蛋白mRNA表達豐度沒有顯著影響。這說明雷帕霉素的添加抑制乳腺組織中乳蛋白的合成，而Lys-Lys的添加則降低這種抑制作用。添加雷帕霉素顯著抑制游離Lys組和Lys-Lys組奶牛乳腺組織mTOR、 4E-BP1和 S6K1基因的表達(P<0.05)。與Lys相比，Lys-Lys的添加促進雷帕霉素處理組奶牛乳腺組織mTOR基因的表達(P<0.05)，提高雷帕霉素處理組 4E-BP1和 S6K1 mRNA的表達豐度。這些結(jié)果表明雷帕霉素抑制乳腺組織中mTOR信號通路中3種作用元件基因的表達，Lys-Lys的添加則降低這種抑制作用。綜上所述，雷帕霉素通過降低mTOR、 4E-BP1和 S6K1的活性進而抑制αs1酪蛋白的合成，Lys-Lys的添加則降低這種抑制作用。由此推測，與氨基酸一樣，Lys-Lys二肽很有可能作為信號分子通過激活mTOR信號通路，降低雷帕霉素對mTOR信號通路以及乳蛋白合成的抑制作用。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液中添加Lys-His、Lys-Lys和Lys-Leu 3種二肽均可顯著促進奶牛乳腺組織中αs1酪蛋白、mTOR和 4E-BP1基因的表達，Lys-Lys和Lys-His則促進 S6K1基因的表達；雷帕霉素能抑制mTOR、 4E-BP1、 S6K1和αs1酪蛋白基因的表達，Lys-Lys的添加則降低這種抑制作用，提示Lys二肽可能作為信號分子通過mTOR信號途徑參與乳蛋白合成調(diào)控。

Reference：

[1] AVRUCH J,LONG X,ORTIZ-VEGA S,etal.Amino acid regulation of TOR complex 1 [J].AmericanJournalofPhysiology-EndocrinologyandMetabolism,2009,296(4):592-602.

[2] MOSHEL Y,RHOADS R E,BARASH I.Role of amino acids in translational mechanisms governing milk protein synthesis in murine and ruminant mammary epithelial cells [J].JournalofCellularBiochemistry,2006,98(3):685-700.

[3] PRIZANT R L,BARASH I.Negative effects of the amino acids Lys,His,and Thr on S6K1 phosphorylation in mammary epithelial cells [J].JournalofCellularBiochemistry,2008,105(4):1038-1047.

[4] ZHOU M M,WU Y M,LIU H Y,etal.Effects of phenylalanine and threonine oligopeptides on milk protein synthesis in cultured bovine mammary epithelial cells [J].JournalofAnimalPhysiologyandAnimalNutrition,2015,99(2):215-220.

[5] 周苗苗,崔景香.含賴氨酸二肽對奶牛乳蛋白合成和乳腺氨基酸轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2016,43(5):1156-1161.

ZHOU M M,CUI J X.Effects of lysine dipeptides on gene expression of milk protein and amino acid transporters in bovine mammary gland explants [J].ChinaAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,2016,43(5):1156-1161(in Chinese with English abstract).

[6] 周苗苗,崔景香.泌乳相關(guān)激素及蘇氨酸和苯丙氨酸比例對乳蛋白合成的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2016,25(2):159-165.

ZHOU M M,CUI J X.Effects of lactogenic hormones and ratio of threonine to phenylalanine on milk protein synthesis in cultured bovine mammary gland [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2016,25(2):159-165 (in Chinese with English abstract).

[7] 余 婕,晏向華.氨基酸調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1信號通路的分子機制[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2015,27(7):2012-2017.

YU J,YAN X H.Molecular mechanism of amino acids in regulation of mammalian target of rapamycin complex 1 signaling pathway [J].ChineseJournalofAnimalNutrition,2015,27(7):2012-2017 (in Chinese with English abstract).

[8] THAKKAR S V,MIYAUCHI S,PRASAD P D,etal.Stimulation of Na+/Cl--coupled opioid peptide transport system in SK-N-SH cells by L-kyotorphin,an endogenous substrate for H+-coupled peptide transporter PEPT2 [J].DrugMetabolismandPharmacokinetics,2008,23(4):254-262.[9] HAY N,SONENBERG N.Upstream and downstream of mTOR [J].GenesandDevelopment,2004,18(16):1926-1945.

[10] KIM D H,SARBASSOV D D,ALI S M,etal.mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery [J].Cell,2002,110(2):163-175.

[11] OSHIRO N,YOSHINO K,HIDAYAT S,etal.Dissociation of raptor from mTOR is a mechanism of rapamycin-induced inhibition of mTOR function [J].GenesCells,2004,9(4):359-366.

(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Effects of Lysine Dipeptides on Gene Expression of mTOR Signal Pathway Elements in Gland Explants of Bovine Mammary .

ZHOU Miaomiao and CUI Jingxiang.

(Institute of Animal Science,Weifang University of Science and Technology,Shouguang Shandong 262700,China)

The study was to investigate the effects of lysine (Lys) dipeptides on gene expression of mammalian target of rapamycin (mTOR) signal pathway elements in gland explants of bovine mammary . Mammary gland tissues were obtained from Chinese Holstein dairy cows and cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium-F12 with the lactogenic hormones (prolactin, hydrocortisone and insulin). Firstly, the free Lys in culture medium was equivalent substituted with Lys-Lys, Lys-leucine (Leu), Lys-histidine (His) at ratio ofφ=5%, 5%, 10%, respectively. Then, rapamycin, the mTOR inhibitor, was added in the Lys group and Lys-Lys group at concentration of 0 and 100 nmol/L, respectively. After 48 h , mammary gland tissues were harvested for casein alpha s1,mTOR, 4E-BP1 and S6K1 gene expression analysis by real-time PCR. The Lys dipeptides significantly enhanced the gene expression of casein alpha s1,mTOR, 4E-BP1 and compared S6K1 with equivalent free Lys. The addition of rapamycin inhibited the gene expression of casein alpha s1,mTOR, 4E-BP1 and S6K1, and Lys-Lys dipeptide decreased the inhibitory effect. The results indicated that, as the synthetic substrates, the Lys dipeptides may also promote the synthesis of milk protein by modulating the mTOR signal pathway.

Lysine dipeptides; Casein alpha s1; Mammalian target of rapamycin; Bovine mammary gland explant

2016-04-18 Returned 2016-05-30

Project of Weifang Science and Technology Development (No.2015GX077).

ZHOU Miaomiao, female, Ph.D,associate professor. Research area:ruminant nutrition. E-mail: zhoumm0329@163.com

日期：2017-06-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1107.010.html

2016-04-18

2016-05-30

濰坊市科技發(fā)展計劃(2015GX077)。

周苗苗，女，博士，副教授，主要從事反芻動物營養(yǎng)研究。E-mail:zhoumm0329@163.com

S823

A

1004-1389(2017)07-0963-05