拜賴青霉活性產(chǎn)物的抗真菌作用研究

張楠楠, 白 凈, 張禮文, 徐玉泉, 王惠國(guó), 馮寶民

1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 遼寧 大連 116622; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

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拜賴青霉活性產(chǎn)物的抗真菌作用研究

張楠楠1,2, 白 凈2, 張禮文2, 徐玉泉2, 王惠國(guó)1*, 馮寶民1

1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 遼寧 大連 116622; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

采用平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)和生長(zhǎng)速率法，篩選和測(cè)定拜賴青霉ACCC 30440對(duì)尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌的抑制活性。結(jié)果表明，ACCC 30440的PDB發(fā)酵液和乙酸乙酯提取物均能夠抑制尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌的生長(zhǎng)，含10%發(fā)酵液的培養(yǎng)基對(duì)尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌的抑制率均達(dá)40%以上，含20%發(fā)酵液則可完全抑制這兩株病原真菌的生長(zhǎng)；ACCC 30440的乙酸乙酯提取物對(duì)尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌的半抑制濃度分別為518.63 μg/mL和443.42 μg/mL。說明拜賴青霉ACCC 30440菌株能夠產(chǎn)生抑制植物病原真菌生長(zhǎng)的活性物質(zhì)。

拜賴青霉；尖孢鐮刀菌；大麗輪枝菌；活性產(chǎn)物

植物病害是制約農(nóng)作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因素之一，70%～80%的植物病害是由病原真菌侵染所致[1]，其中，能夠引起植物枯萎病和黃萎病的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahlia)是世界性重要的土傳病原真菌。植物真菌病害不僅直接造成農(nóng)作物產(chǎn)量下降與品質(zhì)降低，而且部分病原真菌在侵染農(nóng)作物過程中，可分泌產(chǎn)生多種有害的毒素與代謝物，極大威脅了農(nóng)產(chǎn)品的安全性。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展及人類環(huán)境保護(hù)意識(shí)的提高，生物農(nóng)藥作為生物防治的重要內(nèi)容，具有來源廣、成本低、毒性低、易于降解和殘留小等優(yōu)點(diǎn)，成為開發(fā)農(nóng)用抗生素的重要來源[2]。

青霉菌廣泛存在于自然界中，具有生長(zhǎng)繁殖快、產(chǎn)孢能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，其生長(zhǎng)原料來源廣、價(jià)格低廉，更利于工業(yè)化生產(chǎn)[3]，是生物防治農(nóng)作物病原真菌的主要菌種。國(guó)內(nèi)外關(guān)于青霉菌株活性產(chǎn)物的抗真菌作用已有報(bào)道。如青霉(Penicillumsp.)TS67的發(fā)酵液能夠抑制玉蜀黍平臍蠕孢菌(Bipolarismaydis)和大豆尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能是影響植物病原真菌的細(xì)胞壁形成[4,5]。馬德里青霉(Penicilliummadriti)QMYCS-2發(fā)酵液中含有能夠抑制煙草黑脛病菌的有效成分[6];灰黃青霉(Penicilliumgriseofulvum)CF3發(fā)酵液對(duì)4株馬鈴薯土傳病原真菌均有較強(qiáng)抑制作用，并表明該作用由發(fā)酵液中抗菌活性代謝產(chǎn)物所致[3];青霉菌(P.italicum)對(duì)尖孢鐮刀菌在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、抗生作用方面均具有較好的抑制作用[7];海洋真菌梅花狀青霉FS83的發(fā)酵液提取物對(duì)綠色木霉、黑曲霉、膠孢炭疽菌具有一定的抑制效果，抑制率均達(dá)50%以上[8]。到目前為止，尚未見到有關(guān)拜賴青霉對(duì)植物病原真菌——尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌拮抗作用的研究報(bào)道。因此，本研究初步探討了拜賴青霉(Penicilliumbilaiae)ACCC 30440的發(fā)酵活性產(chǎn)物對(duì)植物病原真菌——尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌的抑制作用，以期為開發(fā)生物農(nóng)藥提供一種新的來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 拜賴青霉(Penicilliumbilaiae)ACCC 30440，由中國(guó)農(nóng)業(yè)菌種保藏中心提供。植物病原真菌：尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum) Foc TR4由海南大學(xué)劉柱實(shí)驗(yàn)室提供，大麗輪枝菌(Verticilliumdahlia) v991由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所程紅梅研究員提供。1.1.2 儀器與試劑 恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)MEMMERT公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(日本Digital Biology 公司)；生物安全柜(中國(guó)Haier公司)；旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；光學(xué)顯微鏡(上海締倫光學(xué)儀器有限公司)；恒溫振蕩器(美國(guó)精騏有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)EPPENDORF公司)。

乙酸乙酯、甲醇、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純，購(gòu)自北京化玻站生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基均購(gòu)自碧迪(BD)醫(yī)療器械(上海)有限公司。

1.2 ACCC 30440對(duì)病原真菌的抑制試驗(yàn)

采用平板對(duì)峙法，在直徑9 cm的PDA平板上分別接種2.5 μL含有107孢子/mL的ACCC 30440與病原真菌的孢子懸濁液，接種點(diǎn)距離3 cm，以不接青霉的為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察菌落的生長(zhǎng)狀況，用毫米刻度尺測(cè)量病原真菌與ACCC 30440共培養(yǎng)生長(zhǎng)的菌落直徑R1和病原真菌單獨(dú)生長(zhǎng)時(shí)的菌落直徑R2，并計(jì)算共培養(yǎng)5 d后對(duì)病原真菌的抑制率。計(jì)算公式：抑菌率I=[(R2-R1)/R2]×100%。

1.3 ACCC 30440發(fā)酵液對(duì)病原真菌抑制作用的測(cè)定

1.3.1 ACCC 30440發(fā)酵液的制備 菌株活化后，收取孢子，制成孢子懸濁液。配置PDB培養(yǎng)基，250 mL三角瓶中分裝100 mL培養(yǎng)基，121℃高壓蒸汽滅菌15 min。待培養(yǎng)基冷卻后，于無菌條件下，每個(gè)三角瓶中再加入20 μL ACCC 30440孢子懸濁液(107孢子/mL)，200 r/min 28℃培養(yǎng)10 d。于無菌條件下，分別將菌絲體過濾，得到發(fā)酵液，并將發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，收集上清并用0.22 μm濾膜過濾，獲得青霉30440無菌發(fā)酵液。

1.3.2 ACCC 30440發(fā)酵液對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的影響 發(fā)醇液對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的影響采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定。將不同體積的發(fā)酵液分別加入到40℃左右的PDA培養(yǎng)基(經(jīng)滅菌)中，分別制成含2.5%、5%、10%、20%發(fā)酵液的培養(yǎng)基，充分搖勻，并迅速倒入直徑為9 cm的平板中。以不含發(fā)酵液為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。在平板中央分別接入2.5 μL病原真菌孢子懸濁液，置于28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。每天觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑并計(jì)算第5天菌絲生長(zhǎng)抑制率。菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.4 ACCC 30440發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)病原真菌抑制作用的測(cè)定

1.4.1 ACCC 30440發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物與病原真菌菌餅的制備 將獲得的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得到發(fā)酵液乙酸乙酯提取物。將病原真菌菌株活化，5 d后收集孢子，制成孢子懸濁液，涂布到PDA平板中，28℃培養(yǎng)4 d，用于制備直徑5 mm的菌餅。

1.4.2 ACCC 30440發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的影響 稱取乙酸乙酯提取物配制成濃度為625 mg/mL的儲(chǔ)存液，分別用20%的DMSO稀釋成500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL和31.25 mg/mL，取40 μL加入到25 mL滅菌并冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中提取物的含量分別為1 000 μg/mL、800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL和50 μg/mL，混勻后貯備平板。以加入同體積的20% DMSO與水的平板為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。在平板中央分別接入直徑5 mm病原真菌菌餅，置于28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。每天觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑并計(jì)算第5天菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 ACCC 30440對(duì)病原真菌的抑制作用

通過平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，ACCC 30440

對(duì)尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌具有拮抗作用，能夠明顯抑制尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌的菌落生長(zhǎng)，見圖1。共培養(yǎng)5 d后，其對(duì)尖孢鐮刀菌的平板對(duì)峙抑制率為26.00%±3.12%，對(duì)大麗輪枝菌的平板對(duì)峙抑制率為22.33%±4.09%(表1)。

圖1 ACCC 30440平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)菌落形態(tài)Fig.1 Colony characteristics through plate confrontation on ACCC 30440.注：A1：ACCC 30440對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)有明顯抑制作用；A2：對(duì)照組尖孢鐮刀菌正常生長(zhǎng)；B1：ACCC 30440對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)有明顯抑制作用；B2：對(duì)照組大麗輪枝菌正常生長(zhǎng)。F：尖孢鐮刀菌；P：ACCC 30440；V：大麗輪枝菌。

表1 ACCC 30440與植物病原真菌平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

注：*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.2 ACCC 30440發(fā)酵液對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的影響

ACCC 30440發(fā)酵液能夠抑制病原真菌菌落的生長(zhǎng)，隨發(fā)酵液含量的增加，病原真菌菌落生長(zhǎng)受到抑制，菌落直徑逐漸變小(表2)。培養(yǎng)基中含20%發(fā)酵液時(shí)兩種病原真菌幾乎都不生長(zhǎng)(P<0.05)；含2.5%發(fā)酵液時(shí)，能夠抑制尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，而對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)的抑制現(xiàn)象不明顯；含10%發(fā)酵液時(shí)，對(duì)兩種病原真菌的抑制率均能達(dá)到40%以上(圖2)?？梢?，ACCC 30440發(fā)酵液能夠抑制植物病原真菌生長(zhǎng)，說明ACCC 30440發(fā)酵液中存在某種能夠抑制病原真菌生長(zhǎng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

2.3 ACCC 30440發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的影響

為了確定ACCC 30440對(duì)病原真菌的抑制作用是否由活性代謝產(chǎn)物引起，用等體積乙酸乙酯萃取3 L ACCC 30440的發(fā)酵液并得到1.2 g提取物。將不同濃度的乙酸乙酯提取物加入到培養(yǎng)基中，觀察其對(duì)兩株病原真菌生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ACCC 30440發(fā)酵液乙酸乙酯提取物能夠抑制這兩株病原真菌的生長(zhǎng)，隨乙酸乙酯提取物濃度的增加，尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌的菌落直徑逐漸變小(表3)。當(dāng)培養(yǎng)基中含1 000 μg/mL乙酸乙酯提取物時(shí)，能明顯抑制尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，抑制率能達(dá)到80%以上，此時(shí)大麗輪枝菌幾乎不生長(zhǎng)(P<0.05)(圖3)。使用半抑制濃度(IC50)計(jì)算軟件，計(jì)算得到乙酸乙酯提取物對(duì)尖孢鐮刀菌的IC50為518.63 μg/mL，對(duì)大麗輪枝菌的IC50為443.42 μg/mL，表明ACCC 30440乙酸乙酯提取物對(duì)大麗輪枝菌的抑制活性略高于尖孢鐮刀菌。

表2 ACCC 30440發(fā)酵液對(duì)病原真菌菌落生長(zhǎng)的影響(n=3)

注：*表示與CK組相比差異具有顯著性(P<0.05)。

圖2 ACCC 30440發(fā)酵液對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的抑制作用(n=3)Fig.2 Inhibities on mycelial growth influenced by the fermentation broth of ACCC 30440(n=3).注：A：對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用；B：對(duì)大麗輪枝菌的抑制作用；*表示與CK組相比差異具有顯著性(P<0.05)。

乙酸乙酯提取物含量(μg/mL)菌落直徑(mm)尖孢鐮刀菌大麗輪枝菌20%DMSO48．55±3．1625．00±0．000(CK)47．44±3．1224．67±0．515046．55±4．3024．00±1．0910044．89±4．2223．33±1．2120044．11±2．89?19．50±3．83?40036．22±1．98?13．50±2．73?80018．89±3．55?5．50±0．54?100010．22±2．16?5．00±0．00?

注：*表示與CK組相比差異具有顯著性(P<0.05)。

3 討論

過量使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致的農(nóng)藥殘留不僅會(huì)造成環(huán)境污染、生物多樣性被破壞，而且會(huì)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全造成重大隱患，因此開發(fā)和推廣可降解、選擇性高的生物農(nóng)藥，已成為保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要措施[9]。目前，抗植物病原真菌的活性成分來源廣泛，涉及植物、動(dòng)物、微生物等領(lǐng)域，尤其是微生物領(lǐng)域。青霉菌屬于曲霉科青霉屬，種類繁多、分布廣，廣泛存在于自然界，在工業(yè)中也具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究通過平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)拜賴青霉ACCC 30440能夠抑制尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌的生長(zhǎng)，利用生長(zhǎng)速率法發(fā)現(xiàn)ACCC 30440發(fā)酵液能夠顯著抑制這兩株病原真菌的生長(zhǎng)。拜賴青霉(Penicilliumbilaiae)[10,11]是一種真菌微生物，能夠促進(jìn)一些農(nóng)作物對(duì)土壤中磷的吸收，并能促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，例如小麥、油菜和豆科植物。Nakahara等[12]報(bào)道從拜賴青霉Chalabuda乙酸乙酯提取物中分離到3種化合物，均具有殺線蟲活性。拜賴青霉ACCC 30440是否也會(huì)產(chǎn)生殺線蟲的活性產(chǎn)物需要進(jìn)一步研究。Meng等[13]從紅樹林植物欖李(Lumnitzeraracemosa)的根際土壤中分離得到拜賴青霉MA-267，并從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離到兩種化合物Penicibilaenes A和Penicibilaenes B，發(fā)現(xiàn)這兩種化合物能夠抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)，但具有選擇性，主要抑制膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，其最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)分別為1.0 μg/mL和0.125 μg/mL。本研究還發(fā)現(xiàn)ACCC 30440乙酸乙酯提取物能夠同時(shí)抑制尖孢鐮刀菌與大麗輪枝菌的生長(zhǎng)，其半抑制濃度分別為518.63 μg/mL和443.42 μg/mL，即對(duì)大麗輪枝菌的抑制活性略高于尖孢鐮刀菌，表明ACCC 30440對(duì)植物病原真菌的拮抗作用可能具有廣泛性。

圖3 ACCC 30440乙酸乙酯提取物對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的抑制效果(n=3)Fig.3 Inhibities on mycelial growth influenced by the ethyl acetate extracts of ACCC 30440(n=3).注:A：對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用；B：對(duì)大麗輪枝菌的抑制作用; *表示與CK組相比差異具有顯著性(P<0.05)。

拜賴青霉對(duì)人畜和環(huán)境無害，目前市場(chǎng)上有神農(nóng)氏公司和哈爾濱尚仕生物科技有限公司生產(chǎn)的以拜賴青霉為主的菌肥“菌樂寶”和“增酶莙”等，具有增強(qiáng)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收、增加土壤肥力、提高植物抗病能力等特點(diǎn)，但由拜賴青霉生物合成的有效成分還不清楚。本文的研究結(jié)果表明，拜賴青霉能夠產(chǎn)生抑制植物病原真菌生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，為更合理的利用拜賴青霉提供了一定的理論依據(jù)，也為開發(fā)生物農(nóng)藥提供了一種新的來源，具有巨大的應(yīng)用前景。

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Study on the Antifungal Effect of Bioactive Metabolites Produced byPenicilliumbilaiae

ZHANG Nannan1,2, BAI Jing2, ZHANG Liwen2, XU Yuquan2, WANG Huiguo1*, FENG Baomin1

1.SchoolofLifeScienceandBiotechnology,DalianUniversity,LiaoningDalian116622,China; 2.BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

The antagonistic activity ofPenicilliumbilaiaeACCC 30440 againstFusariumoxysporumandVerticilliumdahliaewas screened and determined by plate confrontation experiment and growth rate method. The results showed that ACCC 30440 fermentation broth and ethyl acetate extract could inhibit the growth ofF.oxysporumandV.dahliae, and the inhibition rate toF.oxysporumandV.dahliaewere both more than 40% with 10% fermentation broth, while 20% fermentation broth completely inhibited the growth of these two pathogenic fungi. The half inhibitory concentrations of ACCC 30440 ethyl acetate extract onF.oxysporumandV.dahliaewere 518.63 μg/mL and 443.42 μg/mL, respectively. The results indicated thatP.bilaiaeACCC 30440 strain could produce bioactive metabolites that inhibited the growth of phytopathogenic fungi.

Penicilliumbilaiae;Fusariumoxysporum;Verticilliumdahliae; bioactive metabolites

2017-03-28; 接受日期：2017-04-14

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目(2015CB755700)；農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2016-X43)資助。

張楠楠，碩士研究生，研究方向?yàn)榇渭?jí)代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究與開發(fā)。E-mail：linyiznn@126.com。*通信作者：王惠國(guó)，副教授，研究方向?yàn)榇渭?jí)代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究與開發(fā)。E-mail：wanghuiguo163@163.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0020