昆蟲抗藥性檢測方法研究進(jìn)展

馬玉婷, 魏 娟, 李相敢

先正達(dá)生物科技(中國)有限公司, 北京 102206

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昆蟲抗藥性檢測方法研究進(jìn)展

馬玉婷, 魏 娟, 李相敢*

先正達(dá)生物科技(中國)有限公司, 北京 102206

隨著殺蟲劑被長期、廣泛地使用，昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性，昆蟲抗藥品種及抗藥劑量也相應(yīng)地逐年增加，這使得昆蟲抗藥性的監(jiān)測逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，昆蟲抗藥性的檢測方法也因此不斷改進(jìn)。介紹了檢測昆蟲抗藥性的兩類常見方法：生物測定法和分子生物學(xué)法，其中，生物測定法分為人工飼料混藥法、浸葉法、點(diǎn)滴法、噴霧法及噴粉法、藥膜法、浸蟲法和IRAC No.5法；而分子生物學(xué)法又包括PCR限制性內(nèi)切酶技術(shù)、特異性等位基因PCR技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)、TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、KASP技術(shù)和DNA測序技術(shù)。研究人員可通過比較昆蟲特性、環(huán)境因素、實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，選擇合適的檢測方法，以快速掌握昆蟲的抗性信息，并及時(shí)有效的調(diào)整昆蟲的防治策略。

昆蟲；抗藥性；生物測定；分子檢測

昆蟲抗藥性是指在昆蟲群體中發(fā)展起來的、能夠耐受殺死正常種群大多數(shù)個(gè)體的藥量的能力[1]。長期以來，由于殺蟲劑的選擇作用，許多昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。昆蟲抗藥性最早的記載是出現(xiàn)于1908年，Melander在研究美國加利福尼亞梨園蚧時(shí),發(fā)現(xiàn)其對(duì)石硫合劑產(chǎn)生了抗藥性[2]。隨后的幾年又發(fā)現(xiàn)紅圓蚧對(duì)氫氰酸產(chǎn)生抗藥性、蘋果蠹蛾對(duì)砷酸鉛產(chǎn)生抗藥性[3]。迄今為止，全世界有近600多種害蟲對(duì)1種或多種藥劑產(chǎn)生了抗藥性[4]。昆蟲抗藥性的產(chǎn)生會(huì)帶來許多不利的影響，比如農(nóng)作物產(chǎn)量降低、農(nóng)民種植成本升高等，同時(shí)，大量的噴灑農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致食品中農(nóng)藥殘留過高、污染生態(tài)環(huán)境并危害人類健康。因此，昆蟲的抗藥性問題一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn) 。

1 昆蟲抗藥性機(jī)制

大多數(shù)研究認(rèn)為，昆蟲的抗藥性機(jī)制主要包括藥劑穿透率下降、昆蟲體內(nèi)解毒酶活力增強(qiáng)即代謝抗性與靶標(biāo)敏感性降低等[5]。根據(jù)抗性機(jī)理，又可以將昆蟲抗藥性分為靶標(biāo)抗性和代謝抗性。

靶標(biāo)抗性是指昆蟲在殺蟲劑的長期選擇下，其殺蟲劑作用的靶標(biāo)部位的敏感性可能降低，從而形成靶標(biāo)抗性。昆蟲靶標(biāo)抗性主要涉及乙酰膽堿酯酶(AChE)、神經(jīng)軸突鈉離子通道(SC)和γ-氨基丁酸(GABA)受體氯離子通道這三大作用靶標(biāo)[6]。乙酰膽堿酯酶是有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑的靶標(biāo)，可以通過降低其對(duì)殺蟲劑的敏感性，使昆蟲產(chǎn)生抗性[7]。對(duì)有機(jī)磷酸酯的抗性與Ⅰ型乙酰膽堿酯酶(ACE-1)中的點(diǎn)突變和羧酸酯酶的過表達(dá)之間存在一定的關(guān)系[8]。二氯二苯三氯乙烷(DDT)和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)是昆蟲的神經(jīng)軸突鈉離子通道(SC)，在這類殺蟲劑的長期選擇下，昆蟲鈉離子通道靶標(biāo)部位敏感性下降，產(chǎn)生了擊倒抗性(knockdown resistance,kdr)[9]。通過電生理學(xué)研究證明，DDT和擬除蟲菊酯通過修飾鈉離子通道，使其在一段時(shí)間內(nèi)始終保持打開狀態(tài)[10]。而Knipple等[11]分析了家蠅kdr抗性品系與敏感性鈉離子通道基因cDNA的限制性片段，遺傳連鎖分析顯示，kdr性狀與電壓敏感性鈉離子通道基因片段緊密連鎖，鈉離子通道基因的突變是產(chǎn)生kdr抗性的基礎(chǔ)。γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動(dòng)物的腦部主要神經(jīng)傳輸抑制素，作用于GABA-A受體。而GABA-A受體是配體門控氯離子通道，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮度上起著重要作用[12]。γ-氨基丁酸(GABA)受體氯離子通道是環(huán)戊二烯類、抗生素類、二環(huán)苯甲酸酯類、吡唑類殺蟲劑的重要作用靶標(biāo)，受到抑制后會(huì)影響氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)，從而阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的正常傳遞[6]。

代謝抗性是指由于解毒酶活性增高，昆蟲對(duì)殺蟲劑代謝加速產(chǎn)生抗性，涉及氧化作用、還原作用、水解作用以及基團(tuán)的轉(zhuǎn)移作用和軛合作用，通過這些生化過程把殺蟲劑轉(zhuǎn)變?yōu)橐兹苡谒臉O性分子，從而排出體外[6]。與代謝抗性關(guān)系最大的酶包括細(xì)胞色素P450酶系[13～15]、非專一性酯酶[16]、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)[13,17]和醛氧化酶[18]。測定這些酶在天然群體中的活性是檢測其對(duì)殺蟲劑的抗性機(jī)制的重要步驟。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，昆蟲的抗藥性機(jī)制在分子生物學(xué)方面也有了很大的進(jìn)展，目前被普遍認(rèn)同的昆蟲抗藥性的分子機(jī)制主要集中在基因過量表達(dá)和基因結(jié)構(gòu)突變方面。比如斜紋夜蛾中細(xì)胞色素P450相關(guān)基因、家蠅中CYP6A1基因的表達(dá)量的升高與昆蟲的抗藥性呈正相關(guān)[19,20]。

2 昆蟲的抗藥性檢測方法

長期以來，快速、準(zhǔn)確的檢測方法是昆蟲抗藥性監(jiān)測的重要部分，并成為國內(nèi)外學(xué)者獲取最新的靶標(biāo)害蟲對(duì)農(nóng)藥的抗性信息，避免或減緩害蟲抗藥性繼續(xù)發(fā)展的重要途徑。過去的十幾年中，昆蟲的抗藥性檢測方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的生物測定法發(fā)展到現(xiàn)代分子生物技術(shù)水平。

2.1 生物測定法

生物測定法(bioassay)是根據(jù)“藥劑作用方式和昆蟲種類”建立標(biāo)準(zhǔn)的抗藥性檢測方法[21]。由于生物測定法能夠直觀地得到抗性圖譜，因而，長期以來得到廣泛的應(yīng)用。根據(jù)殺蟲劑進(jìn)入蟲體部位及途徑的不同，生物測定最常用的方式是胃毒毒力測定和觸殺毒力測定。

2.1.1 人工飼料混藥法 人工飼料混藥法的目標(biāo)昆蟲通常是東方黏蟲、二化螟、棉鈴蟲、甜菜夜蛾等鱗翅目昆蟲。操作流程是將藥粉與人工飼料按一定比例混合，每個(gè)處理接蟲20～50頭，然后置于適宜條件下培養(yǎng)，5 d后檢查昆蟲死亡情況[22]。由于此方法是殺蟲劑與食物一同被目標(biāo)昆蟲吞食，進(jìn)入消化道而發(fā)揮作用，故屬于胃毒作用方式。

2.1.2 浸葉法 浸葉法的目標(biāo)昆蟲是小菜蛾、甜菜夜蛾等鱗翅目昆蟲。該方法是將藥液配置成不同的濃度，再將葉片浸入藥劑溶液中，10 s后取出晾干置于培養(yǎng)皿中，接入供試?yán)ハx，48 h后檢查昆蟲死亡情況。浸葉法是通過昆蟲進(jìn)食含殺蟲劑的葉片而發(fā)揮毒殺作用的，屬于胃毒作用方式。浸葉法操作簡單、方便，在昆蟲的抗藥性實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用[23～27]。王玲等[28]通過改良浸葉法，建立了藥管浸葉法。藥管浸葉法采用2 mL的離心管和直徑為1 cm的寄主葉片同時(shí)浸藥、再飼喂葉螨的方法，可充分發(fā)揮其藥劑的觸殺和胃毒活性。分別采用傳統(tǒng)的玻片浸漬法和藥管浸葉法測定5種殺蟲殺螨劑對(duì)室內(nèi)截形葉螨種群的毒力，結(jié)果表明，與玻片浸漬法相比，藥管浸葉法測定截形葉螨對(duì)藥劑表現(xiàn)更為敏感，毒力測定的結(jié)果更低。

2.1.3 點(diǎn)滴法 點(diǎn)滴法是用毛細(xì)血管、微量點(diǎn)滴儀或微量注射器將一定濃度的藥液點(diǎn)滴在蟲體的一定部位，如胸部背面或胸部腹面，藥液進(jìn)入蟲體后而發(fā)揮觸殺作用。一定時(shí)間后檢測試蟲的生存及死亡個(gè)數(shù)。以計(jì)量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，概率值為縱坐標(biāo)繪圖，求該試蟲的LD50(lethal dose,50%)，即半數(shù)致死量[29]。并根據(jù)公式(抗性種群的LD50/敏感種群的LD50)計(jì)算抗性倍數(shù)。點(diǎn)滴法的靶標(biāo)昆蟲是黏蟲、二化螟等鱗翅目幼蟲以及蚜蟲、葉蟬等同翅目昆蟲。

2.1.4 噴霧法及噴粉法 噴霧法及噴粉法的目標(biāo)昆蟲是東方黏蟲、小菜蛾、煙粉虱等昆蟲。此方法是利用噴霧或噴粉裝置，將定量的藥液或粉劑均勻噴灑到盛有昆蟲的器皿內(nèi)，使藥劑直接與昆蟲接觸，待藥液稍干或蟲體沾粉較穩(wěn)定后，將目標(biāo)昆蟲轉(zhuǎn)移到處理前的生長環(huán)境中恢復(fù)1～2 h，然后定期觀察記錄昆蟲的生長、發(fā)育和死亡的情況。噴霧法與噴粉法在昆蟲抗藥性方面應(yīng)用比較廣泛[25,30～33]，是殺蟲劑穿透表皮引起昆蟲中毒致死的觸殺毒力測定方法，具有快速、簡便等特點(diǎn)，可同時(shí)對(duì)大批試蟲做不同濃度的處理。

2.1.5 藥膜法 藥膜法的基本原理是將一定量的殺蟲藥劑均勻地涂在濾紙或瓶壁上，形成一個(gè)藥膜，放入一定量的供試?yán)ハx，讓其爬行1 h后，再移至正常環(huán)境中，觀察試蟲的中毒死亡情況[34,35]。藥膜法的目標(biāo)昆蟲是東方黏蟲、小菜蛾等昆蟲。藥膜法中，藥劑不經(jīng)過昆蟲口器，而是通過體壁進(jìn)入蟲體而致死，因此屬于觸殺毒力測定。

2.1.6 浸蟲法 浸蟲法是將藥劑稀釋成不同的濃度，將蟲子浸漬在供試藥劑中，一段時(shí)間后取出蟲子，放在吸水紙上晾干，根據(jù)蟲子的致死率測定其對(duì)供試藥劑的抗性。浸蟲法屬于觸殺毒力測定方法，以死亡率的機(jī)率值為縱坐標(biāo)，以藥劑的濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制LD-P線，求毒力回歸方程和LD50[36]。浸蟲法的目標(biāo)昆蟲是黏蟲、二化螟等鱗翅目昆蟲以及蚜蟲等同翅目昆蟲。

2.1.7 IRAC No.5法 IRAC No.5法是抗性行動(dòng)委員會(huì)2013年提出的第5套抗性檢測方法，簡稱IRAC No.5法。該方法的目標(biāo)昆蟲是葉蟬和褐飛虱?；静襟E是將殺蟲劑配置成不同的濃度，將植物幼苗完全浸入藥劑中，10 s后取出，干燥，放入塑料或玻璃管中，每個(gè)處理接種10～15只昆蟲，一定時(shí)間后記錄蟲子的存活和死亡數(shù)量，利用Abbott公式計(jì)算蟲子死亡率。胡君等[37]分別用稻苗浸根法、稻苗浸漬法和IRAC No.5法測定吡蚜酮對(duì)褐飛虱的毒力，通過比較，認(rèn)為IRAC No.5法測定吡蚜酮對(duì)褐飛虱的LD50值更加接近實(shí)際水平。該方法屬于觸殺毒力的測試方法之一。

2.2 分子生物學(xué)法

隨著昆蟲抗藥性機(jī)理分子水平上研究的不斷深入，分子生物學(xué)檢測技術(shù)已逐漸在抗藥性檢測中發(fā)揮重要的作用。目前，大多數(shù)的分子檢測研究集中于靶標(biāo)抗性方面，即檢測靶標(biāo)基因的突變。常用的方法有限制性內(nèi)切酶技術(shù)、基于PCR的反應(yīng)技術(shù)和測序技術(shù)。

2.2.1 PCR限制性內(nèi)切酶技術(shù)(PCR restriction endonuclease,PCR-REN) PCR限制性內(nèi)切酶技術(shù)是根據(jù)昆蟲對(duì)藥物的靶標(biāo)序列產(chǎn)生變異，即相關(guān)作用位點(diǎn)基因的突變，從而使某些限制性內(nèi)切酶的作用位點(diǎn)改變的特性發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)。其技術(shù)原理是先對(duì)靶標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用合適的限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，由于昆蟲抗性基因和敏感基因的差異，酶切之后產(chǎn)生了不同長度的片段，由此可以鑒定區(qū)分抗性和敏感性個(gè)體的基因型[38]。該技術(shù)能快速、經(jīng)濟(jì)地檢測田間害蟲的抗藥性，但其缺點(diǎn)是僅局限于導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)發(fā)生變化的抗性突變檢測，若無合適的酶切位點(diǎn)，該技術(shù)則不能使用。

2.2.2 基于PCR的反應(yīng)技術(shù) ①特異性等位基因PCR技術(shù)(PCR amplication of specific alleles,PASA)。特異性等位基因PCR技術(shù)是一種快速檢測DNA單個(gè)堿基突變的方法[39,40]。該技術(shù)的基本原理是設(shè)計(jì)引物時(shí)可以優(yōu)先擴(kuò)增等位基因之一，例如特異性引物的3′端堿基與突變型等位位點(diǎn)堿基互補(bǔ)，在基因擴(kuò)增過程中含有突變型等位基因的序列優(yōu)先被擴(kuò)增出；而如果特異性引物的3′端堿基與等位敏感型位點(diǎn)堿基互補(bǔ)，則優(yōu)先擴(kuò)增出敏感型基因。PASA技術(shù)操作方便、成本低，省去了酶切的步驟，不僅能夠區(qū)分抗性個(gè)體和敏感個(gè)體，而且能夠進(jìn)行個(gè)體基因型的鑒定。但其反應(yīng)條件比較難控制，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

②隨機(jī)擴(kuò)增多肽性DNA技術(shù)(random amplified polymorphic DNA, RAPD)。隨機(jī)擴(kuò)增多肽性DNA技術(shù)(RAPD)是1990年由美國科學(xué)家Wiliams和Welsh分別研究提出的[41]。其原理是設(shè)計(jì)一組隨機(jī)引物，對(duì)樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到一系列大小不等的PCR產(chǎn)物。如果基因組在某一區(qū)域發(fā)生了遺傳變異，如堿基突變、DNA片斷的插入或缺失，從而導(dǎo)致了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，通過對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測即可測出基因組DNA的多態(tài)性[42]。RAPD技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高、對(duì)DNA模板純度要求不高等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于基因組研究的各個(gè)領(lǐng)域。

③TaqMan PCR檢測技術(shù)。TaqMan PCR反應(yīng)是目前分子生物學(xué)檢測方法中普遍運(yùn)用的方法，其原理是TaqMan雙標(biāo)記探針(5′標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和3′標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán))完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,沒有熒光信號(hào)產(chǎn)生(圖1A)；隨著PCR擴(kuò)增，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被檢測器接收(圖1B)。

④TaqMan-MGB探針。在此基礎(chǔ)上的TaqMan-MGB探針，是在雙標(biāo)記探針的3′端標(biāo)記了MGB(minor grove binding)基團(tuán)，它與DNA分子的小溝結(jié)合，不僅可以提高探針的退火溫度Tm，還可以增加探針識(shí)別特異性,達(dá)到區(qū)分1個(gè)堿基的差異的目的。

因此，檢測昆蟲抗藥性需要在昆蟲已知突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)MGB探針，在MGB探針的5′端標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)分別檢測敏感型和突變型，進(jìn)行PCR檢測。根據(jù)檢測方法不同，還可以分為Endpoint定性PCR和Real-time定量PCR。Endpoint定性PCR是在普通的PCR反應(yīng)后對(duì)Endpoint產(chǎn)物的熒光進(jìn)行檢測，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的匹配程度來區(qū)分敏感型、抗藥純合突變型以及抗藥雜合突變型(圖2,彩圖見圖版一)。 通過在突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)TaqMan MGB探針，對(duì)棉蚜蟲的kdr基因突變進(jìn)行了檢測，并與傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法進(jìn)行了比較，結(jié)果定量PCR方法比傳統(tǒng)方法更加靈敏、可靠，更適用于大量樣品的檢測[43]。白亮等[44]用TaqMan MGB探針Real-time定量PCR方法檢測中華按蚊kdr基因L1014位點(diǎn)的突變，對(duì)50個(gè)實(shí)驗(yàn)室和113個(gè)現(xiàn)場的中華按蚊樣本進(jìn)行了鑒定，經(jīng)檢測，50個(gè)實(shí)驗(yàn)室樣品均為野生型純合體，現(xiàn)場樣本中有101個(gè)樣本發(fā)生了突變，突變頻率為87.61%。

圖1 TaqMan Real-time PCR反應(yīng)原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of TaqMan Real-time PCR.注：A.探針與模板序列不匹配，無熒光信號(hào)；B.探針與模板序列匹配，有熒光信號(hào)產(chǎn)生。R代表熒光報(bào)告基團(tuán)，Q代表熒光猝滅基團(tuán)。

圖2 TaqMan-MGB探針區(qū)分不同基因型Fig.2 Using TaqMan-MGB probes to distinguish different genotypes.注：縱坐標(biāo)代表抗性基因產(chǎn)生的熒光，即抗藥純合突變(藍(lán)點(diǎn))；橫坐標(biāo)代表敏感基因產(chǎn)生的熒光，即敏感型(紅點(diǎn))；中間的為雜合型，即抗藥雜合突變(綠點(diǎn))。每個(gè)點(diǎn)代表一頭蟲子樣品。(彩圖見圖版一)

⑤KASP技術(shù)。KASP PCR(kompetitive allele-apecific PCR)，即競爭性等位基因特異性PCR，是由英國LGC公司新發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，主要應(yīng)用于基因分型，是一種高效經(jīng)濟(jì)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)檢測方法。其原理是設(shè)計(jì)2個(gè)SNP PCR引物，引物的3′端各對(duì)應(yīng)一個(gè)SNP的等位基因，SNP PCR引物的5′端是一段特定的序列，其與KASP反應(yīng)試劑盒中通用的熒光探針序列一致(圖3)。所以對(duì)于不同的反應(yīng)，只需要設(shè)計(jì)SNP特性引物即可，這段引物沒有熒光標(biāo)記，因此大大節(jié)省了成本。KASP技術(shù)的靈敏度和特異性均較好。由于其成本較低，已成為目前大規(guī)模SNP基因分型的主流方法之一[45～47]。KASP在昆蟲抗性檢測方面還未有報(bào)道，但由于其在SNP方面的出色表現(xiàn)，同樣能應(yīng)用于由于單堿基突變而引起的昆蟲抗性問題的研究。

圖3 KASP技術(shù)反應(yīng)原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of KASP technology reactions.注：A:第1輪PCR反應(yīng)，模板與可互補(bǔ)的(3′末端能配對(duì)的)PCR引物進(jìn)行退火，并發(fā)生擴(kuò)增；B:第2輪PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出帶有通用序列的PCR產(chǎn)物;C:接下來的PCR反應(yīng)，熒光探針結(jié)合到?jīng)]有淬滅基團(tuán)的互補(bǔ)鏈上，發(fā)出熒光。圖3C中球狀標(biāo)記為熒光發(fā)光基團(tuán)。

2.2.3 DNA測序技術(shù) 測序技術(shù)最早可以追溯到20世紀(jì)50年代，Whitfeld等[48]用化學(xué)降解的方法測定多聚核糖核苷酸序列。1977年，Sanger首次發(fā)明了雙脫氧核苷酸末端終止法，即Sanger測序法或一代測序法[49]。Sanger法簡單、快速，并經(jīng)過后續(xù)的不斷改良，測序讀長可達(dá)1 000 bp，準(zhǔn)確性為99.999%，已成為DNA測序的主流，是目前基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。但一代測序技術(shù)通量較低，已無法完全滿足研究的需要。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLID技術(shù)為代表的二代測序技術(shù)誕生了。二代測序技術(shù)降低了測序成本的同時(shí)，大幅提高了測序速度，并保持了高的準(zhǔn)確性。這三個(gè)技術(shù)平臺(tái)各有優(yōu)點(diǎn)。454技術(shù)的測序片段較長，高質(zhì)量的讀長可以達(dá)到400 bp。Solexa技術(shù)的成本較低，大約只有454技術(shù)的1/10。SOLID技術(shù)的準(zhǔn)確度很高，可達(dá)到99.999%，是目前二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。二代測序過程主要包括DNA測序文庫的制備、錨定橋接、PCR擴(kuò)增、單堿基延伸和數(shù)據(jù)分析。用不同顏色的熒光標(biāo)記4種dNTP, 當(dāng)DNA合成時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)收集到的熒光信號(hào)確定DNA的序列信息。二代測序技術(shù)以及以納米技術(shù)為核心的三代測序技術(shù)已經(jīng)在診斷、法醫(yī)生物學(xué)、生物系統(tǒng)學(xué)等眾多領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。在昆蟲的抗藥性鑒定方面，能夠在突變位點(diǎn)附近直接進(jìn)行DNA測序，無須繁瑣的實(shí)驗(yàn)，即可得到昆蟲抗性基因信息，是目前最簡單、最準(zhǔn)確的方法。拜耳作物科學(xué)的Benting等[50]利用測序技術(shù)對(duì)大批量棉蚜的擬除蟲菊酯進(jìn)行抗性測定，從而及時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)某一區(qū)域的棉蚜抗性水平進(jìn)行有效監(jiān)控。在轉(zhuǎn)錄組的測定方面，利用二代測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組水平的檢測，能夠全面快速地獲得抗性及敏感昆蟲幾乎所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息，對(duì)于研究抗性相關(guān)基因及其代謝功能具有重要意義[51,52]。

2.2.4 分子生物學(xué)方法的比較 分子生物學(xué)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)(表1)。測序技術(shù)的靈敏度無疑是最高的，無論是一代測序還是二代測序，靈敏度均可達(dá)99.9%以上，是目前基因檢測領(lǐng)域的權(quán)威。二代測序技術(shù)獨(dú)特的超高通量檢測平臺(tái)，使其已廣泛應(yīng)用于診斷醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。但是，測序技術(shù)成本較高，操作比較復(fù)雜，周期較長，尤其是二代測序技術(shù)，從DNA提取、PCR反應(yīng)到數(shù)據(jù)分析，大概需要1～2個(gè)月。因此，二代測序技術(shù)在縮短周期和降低成本方面仍有待提高。PCR方法由于操作簡單、靈敏度高，目前應(yīng)用比較廣泛。尤其是TaqMan PCR反應(yīng)，可以進(jìn)行384孔板高通量操作，數(shù)據(jù)也可以批量分析，是一種很成熟的高通量檢測方法。由于TaqMan探針的成本較高，為了降低成本，有時(shí)可以用KASP代替。酶切技術(shù)雖然通量低，但當(dāng)PCR的引物探針不易設(shè)計(jì)或擴(kuò)增效率較低時(shí)，就要考慮是否有合適的酶切位點(diǎn)。

3 展望

注：靈敏度比較中，“+”越多代表方法可檢測的靈敏度越高；通量比較中，“+”越多代表通量越高，即單位時(shí)間內(nèi)可完成的樣品數(shù)越多；時(shí)間比較中，“+”越多代表實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間越長；成本比較中，“+”越多代表所需成本越高；數(shù)據(jù)分析中，“+”越多代表數(shù)據(jù)分析越因難。

目前，常用的昆蟲抗藥性檢測方法除生物測定法和分子生物學(xué)方法外，還有一些其他的方法，比如神經(jīng)電生理檢測法、生物化學(xué)檢測法和免疫學(xué)檢測法[53,54]。生物測定法操作比較復(fù)雜，并且當(dāng)昆蟲群體抗性較低或有多種抗性時(shí)，很難進(jìn)行測定，因此往往具有滯后性，不利于昆蟲抗藥性的早期監(jiān)測。分子生物學(xué)方法操作簡單、特異性好，是目前昆蟲抗性測定的主要方法，但是該方法是建立在對(duì)抗藥性的分子機(jī)制深刻了解的基礎(chǔ)上的，需要確定抗性基因的突變位點(diǎn)，然后再設(shè)計(jì)PCR引物或查找酶切位點(diǎn)才可以檢測，如PCR-REN、PASA和TaqMan-MGB探針法。DNA測序不需要準(zhǔn)確的突變位點(diǎn)，操作簡單，但是也需要一個(gè)大致的靶區(qū)域，否則大規(guī)模的測序既是資金浪費(fèi)又難以開展數(shù)據(jù)分析。RAPD技術(shù)無需預(yù)先確定突變位點(diǎn)，但需要對(duì)總基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及凝膠電泳、PCR產(chǎn)物鑒定，無法實(shí)現(xiàn)高通量檢測。因此，目前較理想的方法是先找到農(nóng)藥的靶作用位點(diǎn)，將生物測定法和分子檢測方法結(jié)合起來進(jìn)行抗藥性檢測，第一時(shí)間掌握昆蟲的抗性水平。通過調(diào)節(jié)殺蟲劑的劑量、配比等，及時(shí)有效的對(duì)昆蟲進(jìn)行防治。

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Advance on Detection Method of Insecticide Resistance

MA Yuting, WEI Juan, LI Xianggan*

SyngentaBiotechnologyChinaCo.Ltd.,Beijing102206,China

Under widespread and long-time usage of insecticides, insects develop various degrees of resistance to insecticides, and the number of insect resistance varieties and resistance level to pesticides are increasing year by year accordingly. These situations make the monitor motheds become the focus so that the detection methods have been improved. This paper introduced two groups of methods commonly used for detecting insecticide resistance: Bioassay methods and molecular biology methods. Bioassay methods include artificial diet mixed drug, leaf dipping, topical application, spray and dusting, residual film, soaking method and IRAC No.5. And molecular biology methods include PCR-REN, PASA, RAPD, TaqMan Real-time PCR, KASP and DNA sequencing. By comparing insect characteristics, environmental factors, experimental conditions and objectives, researchers could select appropriate detection methods to quickly obtain insecticide resistance information and timely and effectively adjust the insect control strategy.

insects; insecticide resistance; bioassay; molecular detection

2016-11-23; 接受日期：2017-03-31

先正達(dá)生物技術(shù)平臺(tái)項(xiàng)目資助。

馬玉婷，研發(fā)助理，主要從事植物基因分型及表達(dá)分析研究。E-mail：yuting.ma@syngenta.com。*通信作者：李相敢，首席科學(xué)家，主要從事基因轉(zhuǎn)化和基因組編輯研究。E-mail：xianggan.li@syngenta.com

10.19586/j.2095-2341.2016.0153