正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化超臨界二氧化碳萃取桑葉總黃酮

謝玉龍, 石仝雨, 繆偉偉, 王志雄,2*

1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院, 上海 200093; 2.上海健康醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 上海 200237; 3.日本國(guó)大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科, 日本大阪府吹田市 565-0871

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正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化超臨界二氧化碳萃取桑葉總黃酮

謝玉龍1, 石仝雨1, 繆偉偉2,3, 王志雄1,2*

1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院, 上海 200093; 2.上海健康醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 上海 200237; 3.日本國(guó)大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科, 日本大阪府吹田市 565-0871

探索采用超臨界CO2法萃取桑葉中總黃酮提取的最佳方案。利用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)，依次用正交實(shí)驗(yàn)方法考查萃取壓強(qiáng)、萃取溫度、萃取時(shí)間以及夾帶劑流速對(duì)于桑葉中總黃酮得率的影響，優(yōu)選提取桑葉黃酮類化合物提取的最佳工藝條件。結(jié)果顯示，正交實(shí)驗(yàn)的最佳萃取條件為：萃取壓強(qiáng)為25 MPa，萃取溫度為40℃，萃取時(shí)間為3 h，夾帶劑無(wú)水乙醇流速為2.5 mL/min，該條件下，總黃酮得率為6.19%±0.26%，可重復(fù)性良好。采用超臨界二氧化碳萃取桑葉中黃酮類物質(zhì)的總黃酮提取率較高，為進(jìn)一步開發(fā)桑葉實(shí)驗(yàn)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

桑葉;超臨界萃取技術(shù);總黃酮得率;正交實(shí)驗(yàn)法

目前已有多種傳統(tǒng)中藥被證實(shí)對(duì)于對(duì)多種疾病的預(yù)防與治療具有良好功效[1,2]。桑葉作為一種低價(jià)、易得的中國(guó)傳統(tǒng)中藥材[3]，在我國(guó)擁有豐富的資源。桑葉中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，主要包括維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、黃酮類、生物堿類和多糖等，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、提高免疫力等藥理學(xué)作用[2～5]。但是目前在針對(duì)桑葉相關(guān)藥用成分的提取方面卻尚未有詳細(xì)研究[4]。

黃酮類化合物是桑葉的主要功能性成分之一，其中包括蕓香苷、槲皮素、異槲皮素、二氫山萘素等成分，相比一些傳統(tǒng)的中藥，桑葉中的總黃酮成分具有比較高的藥用價(jià)值[6～8]。超臨界二氧化碳流體(supercritical CO2fluid extraction，SFE-CO2)萃取方法是一種新興技術(shù)，目前在國(guó)際上屬于最先進(jìn)的物理萃取分離技術(shù)之一[9]。本研究采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化超臨界二氧化碳萃取桑葉總黃酮成分，研究獲得其最佳萃取條件，以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用桑葉中的總黃酮成分提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

桑葉干粉(日本野姬和株式會(huì)社)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(金穗生物公司)；無(wú)水乙醇、九水硝酸鋁(廣州化工)、氫氧化鈉(廣州化工)、亞硝酸鈉(廣州化工)均為分析純；二氧化碳(純度99.999%)；50 mL離心管；超純水(自制)、100 mL容量瓶；200 mL量筒；10 mL量筒，移液槍；15 mL離心管；0.45 μm過(guò)濾器，漏斗；濾紙；石英比色杯。

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(756P上海光譜儀器有限公司制造)；超臨界二氧化碳流體萃取設(shè)備(美國(guó)Waters設(shè)備有限公司)；恒溫水浴箱(CV-420，上海恒一精密儀器有限公司)；超純水系統(tǒng)(RE-100，上海本昂科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(FA2104，上海舜宇恒平)。

1.2 工藝路線

稱重干燥后的桑葉粉2 g，裝入超臨界萃取裝置的萃取釜中，根據(jù)相關(guān)的參考文獻(xiàn)，本試驗(yàn)選用無(wú)水乙醇作為夾帶劑[10]。在試驗(yàn)中通過(guò)改變相關(guān)的萃取參數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件完成相關(guān)萃取，獲得總黃酮提取液，并且計(jì)算得到總黃酮提取率。具體步驟：桑葉→干燥→稱重→超臨界萃取→總黃酮提取液→測(cè)定總黃酮提取率。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照《藥典》2010版中所述方法[11]，精確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg置于50 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇超聲溶解，搖勻，定容至50 mL，使之成為濃度100 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為貯備液備用。精密量取上述溶液0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置于10 mL容量瓶。加5%亞硝酸鈉水溶液0.3 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁0.3 mL，混勻后放置6 min，加入1%氫氧化鈉溶液4 mL，混勻，放置15 min后，加無(wú)水乙醇定容至10 mL，靜置15 min，等待顯色后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)在λ=510 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度[10]，試劑空白為對(duì)照，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，510 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11,12]。

1.2.2 桑葉提取液樣品的制備 精密稱取干燥至恒重的桑葉藥材粉末2 g，投入萃取釜中，按照相關(guān)的實(shí)驗(yàn)要求在Water萃取設(shè)備配套軟件界面設(shè)定所需萃取溫度、壓強(qiáng)、夾帶劑流速。當(dāng)制冷機(jī)溫度逐步降至3℃左右時(shí)，系統(tǒng)開始加入夾帶劑，同時(shí)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行加壓，CO2由氣瓶進(jìn)入冷凝器變?yōu)橐簯B(tài)，通過(guò)配套的高壓泵計(jì)量注入萃取釜中，逐步升溫進(jìn)入超臨界狀態(tài)進(jìn)行萃取。當(dāng)達(dá)到所設(shè)定的壓力值時(shí)，系統(tǒng)開始循環(huán)萃取，并保持恒溫恒壓。攜帶有桑葉萃取物的二氧化碳體依次進(jìn)入分離斧Ⅰ和Ⅱ，由節(jié)流閥控制逐級(jí)降壓并改變溫度，桑葉萃取物與CO2自行分離。當(dāng)達(dá)到所選定的時(shí)間后，逐步釋放萃取釜的壓力到常壓，打開取料口，獲取桑葉提取液[13],并在下一步的實(shí)驗(yàn)中將桑葉提取液作為供試品溶液。

1.2.3 總黃酮提取率的計(jì)算 量取1 mL供試品溶液于10 mL容量瓶，按繪制1.2.1項(xiàng)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的相關(guān)步驟顯色，直接于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，獲取供試品總黃酮濃度。然后根據(jù)下列公式，計(jì)算總黃酮提取率[13]。

C：提取液總黃酮的濃度(mg/mL)；V：提取液定容后的體積(mL)；M：稱取的樣品桑葉干粉的質(zhì)量(mg)。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10～12]和美國(guó)Waters公司二氧化碳萃取儀器的使用說(shuō)明書，得到影響總黃酮得率的主要因素有萃取溫度、壓強(qiáng)、萃取時(shí)間和夾帶劑流速。在本研究采用這4個(gè)因素水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察各因素對(duì)桑葉黃酮得率的影響，具體如表1所示。

1.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[14,15]，影響超臨界萃取的主要因素有4個(gè)，主要是萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間和夾帶劑流速，本研究以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，建立4因素3水平的正交試驗(yàn)分析上述因素對(duì)總黃酮得率的影響，具體的設(shè)計(jì)表2所示，分別考察各水平對(duì)桑葉黃酮得率的影響。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

通過(guò)SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，采用Sigmaplot 10.0和Excel 2007繪圖。

表1 單因素試驗(yàn)因素及水平

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素表

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，算出回歸方程為：y=0.012 3x，R2=0.999 4(圖1)，表明在該范圍內(nèi)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線Fig.1 Standard solution curve of rutin.

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of single factor experiment.

根據(jù)表1中的單因素試驗(yàn)及水平所得結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，萃取溫度45℃、提取時(shí)間2.5 h、萃取壓強(qiáng)為35 MPa和夾帶劑流速為2.5 mL/min為各單因素的最大響應(yīng)值。故在下文中以此為基礎(chǔ)條件，設(shè)計(jì)因素水平，進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，由表3可以看出：對(duì)總黃酮得率的影響大小順序?yàn)镃>A=D>B，即萃取時(shí)間>萃取壓強(qiáng)=夾帶劑無(wú)水乙醇流速>萃取溫度。其中萃取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響最大，其次是萃取壓強(qiáng)和夾帶劑流速，并且萃取的最優(yōu)化組合為A2B1C3D2，即最優(yōu)工藝為萃取壓強(qiáng)為25 MPa，萃取溫度為40℃，萃取時(shí)間為3 h，夾帶劑無(wú)水乙醇流速為2.5 mL/min。

2.4 工藝驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳方案為：萃取壓強(qiáng)為25 MPa，萃取溫度為40℃，萃取時(shí)間為3 h，夾帶劑無(wú)水乙醇流速為2.5 mL/min，按照該實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，得到總黃酮得率結(jié)果為6.19%±0.26%，可以證明采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)基本準(zhǔn)確可靠，可重復(fù)性良好，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 討論

桑葉作為中國(guó)的民間傳統(tǒng)藥用植物，含有大量的黃酮類成分，黃酮類物質(zhì)具有降脂、降糖、降低血壓以及改善人體血液循環(huán)等多種生理活性，在抑制癌癥、抗擊衰老等方面也發(fā)揮著重要作用，其在醫(yī)藥領(lǐng)域具有極廣闊的應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)萃取桑葉中的總黃酮的方法主要有：回流提取法、超聲提取法、微波提取法、索氏提取法[16,17]等。但是上述方法都存在需要較高的溫度、總黃酮提取率相對(duì)較低、萃余物質(zhì)存在大量的溶劑殘余等缺陷。相比而言，超臨界CO2萃取方法具有能夠在較低溫度條件下實(shí)現(xiàn)桑葉中總黃酮物質(zhì)的高效提取、萃取液中能夠保留多種具有生理活性的總黃酮成分、萃余物無(wú)有機(jī)溶劑殘留、流程簡(jiǎn)單、操作相對(duì)簡(jiǎn)單、可保護(hù)桑葉總黃酮中熱敏性物質(zhì)不受破壞等特點(diǎn)。其工藝特征能夠很好的解決上述工藝缺陷。本文利用超臨界CO2萃取技術(shù)和紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了桑葉提取液中的總黃酮提取率為6.19%±0.26%，根據(jù)一系列驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度高，偏差較小，為開發(fā)和科學(xué)利用桑葉中的有效成分提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為今后測(cè)定?？浦参镏锌傸S酮的含量提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

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Optimizing of Supercritical Carbon Dioxide Extraction of Flavonoids Ingredients from Mulberry Leaf by Thogonal Experiment Method

XIE Yulong1, SHI Tongyu1, MIAO Weiwei2,3, WANG Zhixiong1,2*

1.SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China; 2.PharmacySchool,ShanghaiUniversityofMedicineandHealthSciences,Shanghai200237,China; 3.GraduateSchoolofMedicine/FacultyofMedicine,OsakaUniversity,Osaka565-0871,Japan

The intent of this study is to explore the best solutions for the supercritical CO2extraction of flavonoids from mulberry leaves. This study used supercritical carbon dioxide extraction technology, detected the effects of extraction pressure, extraction temperature, extraction time, entrainer flow on the yield of total flavonoids in mulberry leaves through orthogonal experiment method, to optimize the best process conditions. Results showed that: orthogonal experiment for the optimum extraction conditions were as follows: extraction pressure was 25 MPa, extraction temperature was 40 ℃, extraction time was 3 h, entrainer anhydrous ethanol velocity was 2.5 mL/min. The expected flavonoids yield rate was 6.19%±0.26%, the repeatability was good. Flavonoids extraction rate by the supercritical carbon dioxide extraction from mulberry leaves was high. This study provided theoretical and experimental basis for further development of mulberry leaf.

mulberry; supercritical carbon dioxide extraction; flavonoid yield; thogonal experiment method

2016-11-03; 接受日期：2016-12-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81402030)資助。

謝玉龍，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)工程。E-mail：1609081872@qq.com。*通信作者：王志雄,高級(jí)工程師,研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)工程。E-mail:wangzx@sumhs.edu.cn

10.19586/j.2095-2341.2016.0127