抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米SW-1目標(biāo)性狀測(cè)試及多重PCR檢測(cè)

張 欣, 董玉鳳, 王旭靜, 王志興

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

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抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米SW-1目標(biāo)性狀測(cè)試及多重PCR檢測(cè)

張 欣, 董玉鳳, 王旭靜, 王志興*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

以轉(zhuǎn)基因玉米IE034和12-5為親本，通過雜交復(fù)合獲得同時(shí)含有cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs基因的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1。農(nóng)藝性狀檢測(cè)證明SW-1同時(shí)具有抗蟲和耐除草劑的特性。通過引物特異性篩選、退火溫度和引物濃度等條件優(yōu)化，建立了SW-1的多重PCR檢測(cè)體系。多重PCR檢測(cè)體系所用的內(nèi)標(biāo)基因?yàn)閦SSIIb，反應(yīng)體積為30 μL，最佳退火溫度為62℃，各引物加入量為0.3 μL(10 μmol/L)。利用此多重PCR檢測(cè)體系，當(dāng)產(chǎn)品中SW-1的質(zhì)量百分比超過0.5% 時(shí)，目標(biāo)基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs都能同時(shí)被檢測(cè)出來。研究結(jié)果為復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1的分子特征檢測(cè)提供了良好的技術(shù)支撐，同時(shí)也為含有cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs基因的其他轉(zhuǎn)化體的多重PCR檢測(cè)提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

復(fù)合性狀；抗蟲；耐除草劑；轉(zhuǎn)基因玉米；多重PCR檢測(cè)

復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物是同時(shí)含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因或性狀的轉(zhuǎn)基因植物。復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物能夠同時(shí)滿足種植者的多元化需求，自問世以來就受到廣大農(nóng)民的喜愛。目前，復(fù)合性狀已成為轉(zhuǎn)基因植物發(fā)展的重要趨勢(shì)。據(jù)ISAAA統(tǒng)計(jì)，2015年復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物的種植面積為5 850萬hm2，占全球轉(zhuǎn)基因植物種植面積的33%，共有14個(gè)國家種植了兩個(gè)及以上復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因植物[1]。當(dāng)前，批準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物主要是抗蟲抗除草劑和多基因抗蟲[2]。

隨著轉(zhuǎn)基因植物的大面積推廣應(yīng)用，其安全性問題引起了公眾和研究人員的廣泛關(guān)注。不同國家根據(jù)自身國情建立了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物安全管理制度，在保證安全的前提下，使轉(zhuǎn)基因植物充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，帶來更大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因植物安全管理的主要內(nèi)容之一。轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)主要包括DNA檢測(cè)和蛋白質(zhì)檢測(cè)[3]。在DNA檢測(cè)中，PCR技術(shù)在國際上應(yīng)用最為廣泛，我國玉米、大豆、棉花、油菜等的轉(zhuǎn)基因成分PCR檢測(cè)也已作為國家標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用[4～7]。但普通PCR檢測(cè)技術(shù)用于復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物的成分檢測(cè)時(shí)存在一定的不足，如無法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)基因、單個(gè)基因的依次檢測(cè)導(dǎo)致工作量增加和檢測(cè)成本提高等。因此，在復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品日益增多的情況下，新的檢測(cè)技術(shù)體系的建立具有十分重要的意義和應(yīng)用前景。

多重PCR在一個(gè)反應(yīng)體系中能同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)目標(biāo)基因片段，因具有快速、靈敏和高通量等優(yōu)點(diǎn)而受到研究者的關(guān)注。目前多重PCR技術(shù)不但在疾病診斷和食品檢測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8,9]，而且在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)領(lǐng)域也得到應(yīng)用[10～12]，如尹全等[13]建立了能同時(shí)檢測(cè)4種轉(zhuǎn)基因玉米的多重PCR體系，Germini等[14]建立了能同時(shí)檢測(cè)4種轉(zhuǎn)基因玉米和1種轉(zhuǎn)基因大豆的多重PCR檢測(cè)體系。但多重PCR在檢測(cè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米方面，尤其是能同時(shí)檢測(cè)抗蟲基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj及耐除草劑基因G10evo-EPSPs的多重PCR體系的報(bào)道較少。

本研究以抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米IE034和抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米12-5為親本，通過有性雜交獲得了同時(shí)含有抗蟲基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj及耐除草劑基因G10evo-EPSPs的轉(zhuǎn)基因玉米SW-1，并通過引物篩選和條件優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測(cè)cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs3個(gè)基因和玉米內(nèi)參基因zSSIIb的多重PCR檢測(cè)體系，為SW-1的快速檢測(cè)提供了科學(xué)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 轉(zhuǎn)cry1Ie基因抗蟲玉米IE034由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所王國英研究員饋贈(zèng)；轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米12-5由浙江大學(xué)沈志成教授饋贈(zèng)；非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58為本實(shí)驗(yàn)室保存。

供試?yán)ハx：亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所何康來研究員饋贈(zèng)。供試除草劑：41%草甘膦異丙胺鹽(glyphosate isopropylamine salt)水劑購自美國孟山都公司。

1.1.2 主要試劑 廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒購于博邁德生物技術(shù)有限公司；2×EasyTaqSuperMix、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(M)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成由上海生工生化公司完成，其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1的獲得 田間分期播種保證兩個(gè)親本花期相遇。花期以12-5為母本，以IE034為父本進(jìn)行雜交，獲得同時(shí)含有兩個(gè)抗蟲基因和耐除草劑基因的復(fù)合性狀抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米SW-1。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA提取 利用廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取玉米基因組DNA，具體操作詳見說明書。提取的玉米基因組DNA利用NANODROP 2000C測(cè)定濃度和純度。DNA濃度稀釋至25 ng/μL備用。

1.2.3 復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1的檢測(cè) ①PCR檢測(cè)。采用轉(zhuǎn)化體特異性引物檢測(cè)SW-1中3個(gè)外源基因的插入位點(diǎn)穩(wěn)定性。12-5的左側(cè)邊界引物SP1/LB-test(304 bp)(序列見表1)、右側(cè)邊界引物R1/RB-test(350 bp)，PCR反應(yīng)體系為：2×EasyTaqSuperMix 15 μL，正向、反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板DNA 2 μL(25 ng/μL)，加ddH2O至30 μL。PCR條件是：95℃ 5 min；95℃，45 s，65℃，50 s，72℃，30 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min(已申請(qǐng)專利：CN 104946631 A)。IE034的左側(cè)邊界引物IE034F/IE034R(314 bp)，PCR反應(yīng)體系為：2×EasyTaqSuperMix 15 μL，正向、反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板DNA 2 μL(25 ng/μL)，加ddH2O至30 μL。PCR條件是：95℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min(已申請(qǐng)專利：CN102604940 A)。

②農(nóng)藝性狀檢測(cè)。以復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1為試驗(yàn)材料，12-5和非轉(zhuǎn)基因玉米Z58為對(duì)照。所用試劑為41%草甘膦異丙胺鹽水劑，4～6葉期對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米材料噴施除草劑草甘膦，噴施濃度為推薦使用濃度的2倍，即0.4%。噴施7 d后觀察玉米表型變化。

表1 本研究所用引物

以復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1為試驗(yàn)材料，IE034、12-5和非轉(zhuǎn)基因玉米Z58為對(duì)照。在室內(nèi)可控條件下開展轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲性鑒定試驗(yàn)，取V6期新鮮心葉組織，將不同品種樣品清洗干凈后分別放置于培養(yǎng)皿中，每平皿接20頭待測(cè)品系的初孵幼蟲，每個(gè)培養(yǎng)皿為1個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)。放置在溫度28℃，相對(duì)濕度80%，光周期16:8 (L：D)的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種幼蟲2 d 后，開始統(tǒng)計(jì)幼蟲的存活情況，根據(jù)組織被取食消耗情況更換相同來源的新組織。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.4 復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1多重PCR檢測(cè)體系的建立 ①引物特異性檢測(cè)。PCR檢測(cè)中采用的內(nèi)標(biāo)基因?yàn)榫幋a玉米淀粉合酶異構(gòu)體ZSTSⅡ-2的基因zSSIIb，所用引物(表1)和反應(yīng)程序均參照國家標(biāo)準(zhǔn)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法》(農(nóng)業(yè)部1861號(hào)-3-2012)[15]。目標(biāo)基因的引物設(shè)計(jì)原則為：3′端要避免發(fā)生堿基配對(duì)，當(dāng)3′端發(fā)生聚合現(xiàn)象時(shí)，其︱△G︱盡量控制在8.0以內(nèi)[16]；為保證在瓊脂糖凝膠電泳中能夠清晰的分辯不同條帶，當(dāng)PCR 產(chǎn)物片段大小在 200 bp 以內(nèi)時(shí)，片段大小之間的差異應(yīng)大于30 bp，片段大小在500 bp以上時(shí)，差異要大于70 bp[17]。依據(jù)目標(biāo)基因的DNA序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的檢測(cè)引物，具體見表1。各檢測(cè)引物濃度稀釋至10 μmol/L備用。

以復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1、親本IE034和12-5、非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58基因組DNA為模板，分別利用目標(biāo)基因?qū)?yīng)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見表1)。PCR反應(yīng)體系為： 2×EasyTaqSuperMix 15 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板DNA 2 μL(25 ng/μL)，加ddH2O至30 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)分析每對(duì)引物的特異性。

②多重PCR退火溫度的優(yōu)化。以復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1、親本IE034和12-5、非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)在PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入擴(kuò)增基因zSSIIb、cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs的引物對(duì)(引物見表1)，引物的濃度為0.17 μmol/L，反應(yīng)體系為(30 μL)：2×EasyTaqSuperMix 15 μL，各引物對(duì)正向、反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板DNA 2 μL(25 ng/μL)，加ddH2O至30 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃ 30 s，退火溫度(設(shè)置不同梯度65℃、64℃、63℃、62℃、61℃、60℃、59℃、58℃)30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析，選擇特異性好、擴(kuò)增效率一致的溫度為最佳退火溫度。

③多重PCR引物濃度的優(yōu)化。復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1、親本IE034和12-5、非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)在PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入擴(kuò)增基因zSSIIb、cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs的引物對(duì)，按照表2中所示的比例設(shè)置引物濃度梯度，反應(yīng)體系為(30 μL)：2× EasyTaqSuperMix 15 μL，各引物對(duì)體積比見表2(10 μmol/L)，模板DNA 2 μL(25 ng/μL)，加ddH2O至30 μL。退火溫度為62℃，其余擴(kuò)增程序與②相同。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，篩選出特異性好、擴(kuò)增效率一致的濃度為最適引物濃度配比。

表2 30 μL反應(yīng)體系中不同引物對(duì)的體積配比

④多重PCR方法靈敏度檢測(cè)。將SW-1和非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58的DNA稀釋到相同濃度25 ng/μL，按質(zhì)量比混合，制備成SW-1基因組質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%等7份不同比例的樣品，根據(jù)已經(jīng)優(yōu)化好的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5 樣品檢測(cè) 采用優(yōu)化好的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)已知樣品進(jìn)行驗(yàn)證，確定所建體系的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 PCR檢測(cè)結(jié)果 在田間同時(shí)播種SW-1、12-5、IE034、鄭58，取4～6葉期的葉片，用轉(zhuǎn)化體特異性引物檢測(cè)插入位點(diǎn)的穩(wěn)定性。圖1結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因玉米IE034和復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1均擴(kuò)增出目的大小為314 bp的條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照未出現(xiàn)特異性條帶,條帶7為非特異性條帶；復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1能夠擴(kuò)增出350 bp、304 bp大小的特異性條帶，其大小與陽性對(duì)照12-5一致。陰性對(duì)照和空白對(duì)照未出現(xiàn)特異性條帶。該結(jié)果說明復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1 同時(shí)含有3個(gè)目的基因且插入位點(diǎn)未發(fā)生改變。

圖1 轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)引物擴(kuò)增圖譜Fig.1 The amplification of specific detection for transformant.M：DNA Marker(2 000 bp)；1～4：轉(zhuǎn)基因玉米IE034右側(cè)邊界；5～8：轉(zhuǎn)基因玉米12-5左側(cè)邊界；9～12：轉(zhuǎn)基因玉米12-5右側(cè)邊界。1：轉(zhuǎn)基因玉米IE034；2、6、10：復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1；3、7、11：非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58；5、9：轉(zhuǎn)基因玉米12-5；4、8、12：陰性對(duì)照。

2.1.2 抗蟲抗除草劑檢測(cè)結(jié)果 在4～6葉期，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米12-5、復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1和非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58進(jìn)行除草劑草甘膦噴施處理，結(jié)果見圖2(彩圖見圖版一)。本實(shí)驗(yàn)噴施濃度為推薦使用濃度的2倍即0.4%，噴施7 d 后觀察表型：轉(zhuǎn)基因玉米12-5和復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米均能正常生長(zhǎng)，且無明顯變化，非轉(zhuǎn)基因玉米出現(xiàn)病害，受害率為100%。表明雜交后的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1具有除草劑耐性。

圖2 噴施2倍除草劑后田間植株除草劑耐性Fig.2 Herbicide-tolerance of transgenic maize after spraying 2 times glufosinate-ammonium in the field.(彩圖見圖版一)

室內(nèi)生測(cè)法試驗(yàn)結(jié)果表明(表3)，亞洲玉米螟幼蟲取食轉(zhuǎn)基因玉米IE034和復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1 V6期玉米心葉片3 d后存活率明顯降低；取食非轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)照鄭58心葉，亞洲玉米螟幼蟲存活率變化不大。 4 d后取食轉(zhuǎn)基因玉米IE034和復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1心葉的亞洲玉米螟幼蟲4 d后存活率為0.00，全部死亡；而取食非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8的亞洲玉米螟幼蟲4 d后存活率為0.80。結(jié)果表明，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1具有抗蟲性。

表3 亞洲玉米螟幼蟲取食不同樣品的存活率

注：表中數(shù)據(jù)代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示P<0.05 水平上差異顯著。

2.2 多重PCR體系的建立與優(yōu)化

2.2.1 DNA質(zhì)量分析 樣品總DNA提取采用廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒，通過NANODROP 2000C(Thermo scientific)分光光度計(jì)測(cè)定濃度及質(zhì)量。結(jié)果表明，所有樣品濃度都大于25 ng/μL，且OD260/OD280范圍介于1.8～2.0，OD260/OD230大于2.0。用提取的DNA進(jìn)行玉米內(nèi)參基因zSSIIb的擴(kuò)增，在所有的玉米材料中均擴(kuò)增出151 bp大小的目的條帶，表明提取的玉米基因組DNA滿足轉(zhuǎn)基因植物PCR檢測(cè)的要求(圖3)。

圖3 玉米內(nèi)參基因zSSIIb擴(kuò)增圖譜Fig.3 The amplification of reference gene zSSIIb.M：DNA Marker；1：轉(zhuǎn)基因玉米IE034；2：轉(zhuǎn)基因玉米12-5；3：復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1；4：非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58；5：陰性對(duì)照。

2.2.2 引物特異性分析 引物的特異性是影響PCR檢測(cè)的主要因子之一，本研究通過對(duì)設(shè)計(jì)的系列引物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)引物對(duì)IE-1-F/R、Ab-1-F/R、G10-1-F/R分別擴(kuò)增目標(biāo)基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs時(shí)特異性非常好，沒有雜帶，而且擴(kuò)增效率很高，可用于多重PCR檢測(cè)體系(圖4)。

2.2.3 多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 在不同退火溫度下，內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb、3個(gè)目標(biāo)基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs都能有效擴(kuò)增，但隨溫度升高，基因zSSIIb、cry1Ie和cry1Ab/cry2Aj的擴(kuò)增效率明顯降低，溫度降低時(shí)，基因G10evo-EPSPs的擴(kuò)增效率逐漸降低(圖5)。因此考慮所有目的條帶的擴(kuò)增效率和單基因擴(kuò)增時(shí)的退火溫度，選擇62℃作為多重PCR反應(yīng)時(shí)的最佳退火溫度。

在多重PCR擴(kuò)增時(shí)，引物的濃度也是影響擴(kuò)增效率的一個(gè)重要因子。經(jīng)過引物濃度梯度試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在30 μL反應(yīng)體系中，加入不同體積的引物，擴(kuò)增結(jié)果明顯不同，引物濃度過低或引物對(duì)間配比不合適，都會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率不一致或不能同時(shí)擴(kuò)增到4個(gè)基因。如圖6所示，當(dāng)擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb、目標(biāo)基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs引物對(duì)的體積均為0.3 μL和0.4 μL時(shí)，4個(gè)基因都能得到很好的擴(kuò)增，而且沒有非特異條帶出現(xiàn)?？紤]到引物濃度增加可能會(huì)導(dǎo)致引物二聚體的產(chǎn)生，認(rèn)為在30 μL反應(yīng)體系中，擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb、目標(biāo)基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs的引物對(duì)的最佳體積均為0.3 μL。

圖4 單一目標(biāo)基因的PCR檢測(cè)Fig.4 The amplification of single target gene.A:cry1Ie；B:G10evo-EPSPs；C:cry1Ab/cry2Aj；M：DNA Marker；1：轉(zhuǎn)基因玉米IE034；2：轉(zhuǎn)基因玉米12-5；3：復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1；4：非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58；5：陰性對(duì)照。

圖5 不同退火溫度下目標(biāo)基因的擴(kuò)增Fig.5 Target gene amplification at different annealing temperature.M：DNA Marker；1～8：退火溫度65℃、64℃、63℃、62℃、61℃、60℃、59℃、58℃；9：Z58；10：空白對(duì)照。

圖6 不同引物對(duì)體積比下的目標(biāo)基因擴(kuò)增Fig.6 Target gene amplification at different volume ratio of primer pair.M：DNA Marker；1～6：引物對(duì)體積比0.4：0.4：0.4：0.4， 0.4:0.3:0.4:0.4， 0.3:0.3:0.3:0.3， 0.2:0.2:0.3:0.3， 0.2:0.2:0.2:0.2， 0.1:0.1:0.1:0.1；7：Z58；8：陰性對(duì)照。

2.2.4 靈敏度檢驗(yàn) 為驗(yàn)證多重PCR檢測(cè)體系的靈敏度，將SW-1基因組DNA與同濃度的非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58基因組DNA按質(zhì)量比混合，制備成50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%的DNA樣品，采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只要樣品中含有0.5%以上的SW-1轉(zhuǎn)基因成分，利用此體系都能穩(wěn)定的檢測(cè)出3個(gè)目標(biāo)基因(圖7)，證明本試驗(yàn)建立的多重PCR檢測(cè)體系所達(dá)到的靈敏度可達(dá)0.5%。

2.3 已知樣品的驗(yàn)證

采用此多重PCR體系檢測(cè)復(fù)合性狀基因玉米SW-1、轉(zhuǎn)基因親本12-5和IE034、非轉(zhuǎn)基因受體。結(jié)果表明，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1能同時(shí)擴(kuò)增出cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs的目的條帶；轉(zhuǎn)基因親本IE034能夠擴(kuò)增出cry1Ie基因的目的條帶；12-5能夠擴(kuò)增出cry1Ab/cry2Aj、G10evo-EPSPs基因的目的條帶；對(duì)于非轉(zhuǎn)基因玉米僅有內(nèi)參基因的擴(kuò)增(圖8)。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了該試驗(yàn)建立的多重PCR檢測(cè)方法的特異性及可靠性。

圖7 多重PCR靈敏度檢測(cè)Fig.7 The amplification of sensitivity test.M:100 bp DNA Marker；1～7：SW-1的質(zhì)量分別為:50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%；8：非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58。

圖8 已知樣品的驗(yàn)證Fig.8 Validation of known sample.M：DNA Marker(100 bp)；1：轉(zhuǎn)基因玉米IE034；2：轉(zhuǎn)基因玉米12-5；3、4：復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米SW-1；5：非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58；6：空白對(duì)照。

3 討論

多重 PCR在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)完成多個(gè)基因的擴(kuò)增，是一種簡(jiǎn)便快捷的DNA檢測(cè)方法，最早是由Chamberlain等[18]在1988年提出的，用于診斷杜氏肌營養(yǎng)不良癥。與常規(guī)PCR相比，多重PCR的反應(yīng)體系涉及到多對(duì)引物，容易導(dǎo)致引物二聚體、錯(cuò)配、非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象，從而降低了擴(kuò)增效率[19]。因此，在建立多重PCR反應(yīng)體系時(shí)，首先需要對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件兩部分進(jìn)行優(yōu)化[13,20]。反應(yīng)體系主要包括引物、緩沖液、Taq酶、模板等。反應(yīng)條件包括退火溫度、循環(huán)數(shù)等。

建立多重PCR反應(yīng)體系的前提是篩選到特異性高的引物。一般而言，引物的退火溫度越高、引物越長(zhǎng)，其特異性就更好。因此，建議設(shè)計(jì)的引物解鏈溫度在65℃以上，GC含量在50%～60%，避免3′端出現(xiàn)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，引物對(duì)解鏈溫度相似并避免互補(bǔ)序列[17,21]。依據(jù)此原則，本研究設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，并篩選得到了特異性良好的引物對(duì)。因此，建議在進(jìn)行多重PCR檢測(cè)時(shí)，應(yīng)多設(shè)計(jì)幾對(duì)引物，并相互結(jié)合，最終才能篩選出特異性好的引物，為后續(xù)工作奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

引物濃度是影響多重PCR擴(kuò)增效率的重要因素之一。如果多重PCR反應(yīng)體系中添加與單基因PCR相同的引物量，則會(huì)導(dǎo)致引物濃度過高而出現(xiàn)擴(kuò)增效率低和引物二聚體明顯等問題。因此，多重PCR反應(yīng)體系中各引物對(duì)的用量要比單基因PCR少。李憶等[22]發(fā)現(xiàn)，P-CaMV 35S和T-NOS兩個(gè)基因的多重PCR檢測(cè)時(shí)的最適引物配比為0.2∶0.2，當(dāng)多重PCR檢測(cè)P-CaMV 35S、P-ract1、T-NOS、bar、pat、PMI6個(gè)基因時(shí)，反應(yīng)體系中引物的最適配比為0.2∶0.1∶0.1∶0.1∶ 0.1∶0.05。同樣，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，多重PCR檢測(cè)體系中所需的引物對(duì)濃度低于單基因PCR擴(kuò)增。通過不同引物濃度的配比來摸索合適的反應(yīng)體系，發(fā)現(xiàn)在引物濃度為10 μmol/L的初始濃度下，30 μL反應(yīng)體系中內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb、目標(biāo)基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs的引物對(duì)的最佳體積為0.3∶0.3∶0.3∶0.3，比單基因PCR擴(kuò)增時(shí)的引物體積減少了0.2 μL。

在復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物的安全評(píng)價(jià)中，所有親本的外源基因是否在雜交后代中穩(wěn)定遺傳是研究者和管理者共同關(guān)注的問題之一，建立適宜的檢測(cè)方法是解決問題的關(guān)鍵。單基因PCR檢測(cè)已不能滿足復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)的需求，如對(duì)于含有8個(gè)基因的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物玉米SmartStaxTM，單基因PCR檢測(cè)耗時(shí)、費(fèi)力、增加成本。多重PCR檢測(cè)為復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)提供了新的思路，本研究結(jié)果和數(shù)據(jù)為多重PCR檢測(cè)在復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物上的應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。

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Target Trait Test and Multiple PCR Detection of Insect-resistance and Herbicide Tolerance Transgenic Maize SW-1

ZHANG Xin, DONG Yufeng, WANG Xujing, WANG Zhixing*

BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

Stacked transgenic maize SW-1 containingcry1Ie,cry1Ab/cry2AjandG10evo-EPSPs, was cultivated by hybridization using transgenic maize IE034 and 12-5 as parents. Agronomic traits test showed that SW-1 had the characteristics of insect-resistance and herbicide tolerance. The multiplex PCR detection system was established by optimizing specific primers, annealing temperature and primer concentration. Multiplex PCR detection system used an endogenous reference genezSSIIb, the reaction volume was 30 μL, the best annealing temperature was 62℃ and the amount of each primer was 0.3 μL (10 μmol/L ). Using this multiplex PCR detection system, the target genecry1Ie,cry1Ab/cry2AjandG10evo-EPSPscan simultaneously be detected, when the mass percentage of SW-1 in the product was more than 0.5%. The results provided a good technical support for the molecular detection of stacked genetically modified maize SW-1. Meanwhile, this study provided scientific data for multiplex PCR detection of other transformation containingcry1Ie、cry1Ab/cry2AjandG10evo-EPSPsgenes.

stack trait; insect-resistance; herbicide-tolerance; transgenic maize; multiplex PCR detection

2016-12-16; 接受日期：2017-02-14

國家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08011-04B)資助。

張欣,碩士研究生，主要從事轉(zhuǎn)基因安全研究。E-mail：zhangxin2014916@sina.com。*通信作者：王志興，研究員，研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因生物安全。E-mail：wangcotton@126.com

10.19586/j.2095-2341.2016.0160