民族藥刺齒鳳尾蕨抑制人源結(jié)腸癌細(xì)胞活性成分研究

孫丹++++++張艷++++++孫強(qiáng)++++++彭玉勃++++++王磊

[摘要] 目的 研究民族藥刺齒鳳尾蕨抑制人源結(jié)腸癌細(xì)胞活性成分。 方法 采用95%乙醇提取藥材，聚酰胺色譜、葡聚糖凝膠色譜以及制備型高效液相色譜等技術(shù)獲取化合物，磁共振波譜技術(shù)（NMR）對(duì)得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定?；酋Ａ_丹明B比色法（SRB）對(duì)化合物進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選。 結(jié)果 從刺齒鳳尾蕨中分離得到5個(gè)二萜類化合物，分別鑒定為geopyxin A（1），geopyxin C（2），ent-11β-acetoxykaur-16-en-18-ol（3），7β，16α，17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid（4）和neolaxiflorin K（5）?；钚院Y選表明化合物1，2和5具有顯著的抑制人源結(jié)腸癌細(xì)胞活性，IC50值分別為1.20、2.45和3.26 μmol/L。 結(jié)論 化合物1～5首次從刺齒鳳尾蕨中分離得到。

[關(guān)鍵詞] 刺齒鳳尾蕨；化學(xué)成分；體外抗腫瘤活性

[中圖分類號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（a）-0020-04

Study on chemical constituents and their inhibition of anthropogenic colon cancer cells bioactivity from ethnic medicine Pteris dispar

SUN Dan ZHANG Yan SUN Qiang PENG Yubo WANG Lei

Jiamusi College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Jiamusi 154007， China

[Abstract] Objective To study the inhibition of anthropogenic colon cancer cells activity constituents of Pteris dispar. Methods The medicinal materials were extracted by 95% ETOH. Compounds were obtained by kinds of chromatographies including polyamide， Sephadex LH-20 and pre-HPLC and the structures identified by NMR. In vitro antitumor activity was tested by SRB methods. Results 5 compounds were obtained from the plant and their structures were established as geopyxin A （1）， geopyxin C （2）， ent-11β-acetoxykaur-16-en-18-ol （3）， 7β， 16α， 17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid （4） and neolaxiflorin K （5）. Compounds 1， 2 and 5 showed strong in vitro antitumor activity against HCT-116， with IC50 values of 1.20， 2.45 and 3.26 μmol/L respectively. Conclusion Compounds 1-5 are obtained from Pteris dispar for the first time.

[Key words] Pteris dispar； Chemical component； In vitro antitumor activity

刺齒鳳尾蕨為鳳尾蕨科（Pteridaceae）鳳尾蕨屬藥用植物，具有清熱解毒，涼血去痰的功效[1]，該藥用植物含有鳳尾蕨屬植物特征性成分貝殼杉烷型二萜類化合物[2]，該類成分具有廣譜的抗腫瘤活性[3]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該類化合物進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了一些化合物具有顯著抗腫瘤活性[3]。如我國(guó)天然藥物學(xué)家孫漢董院士對(duì)該類成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究[4-8]。其中冬凌草甲素具有療效確切的抗腫瘤活性，是非常有希望成為新抗腫瘤制劑的先導(dǎo)化合物[9-12]。然而，刺齒鳳尾蕨作為一種富含貝殼杉烷型二萜類成分的民族藥，對(duì)其蘊(yùn)含的大量二萜成分的結(jié)構(gòu)和抗腫瘤活性沒(méi)有得到深入研究。本課題組從該植物中分離得到5個(gè)二萜類成分，其中3個(gè)化合物具有顯著的抗腫瘤活性。

1 儀器與試藥

Varian VNS-400磁共振儀（Varian公司，美國(guó)），TMS為內(nèi)標(biāo)；Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技公司，美國(guó)），連接DAD檢測(cè)器；Agilent 1100制備型高效液相色譜儀（安捷倫科技公司，美國(guó)），YMC C18制備型色譜柱（250 mm × 20 mm，5 μm，YMC公司，日本）；聚酰胺樹(shù)脂（60～90目，浙江臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠，中國(guó)）；Sephadex LH-20（25～100 μm，Pharmacia Biotek公司）；乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher、Tedia公司，美國(guó)）；SRB（Sigma公司，美國(guó)）；人源結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；Thermo熱電FC酶標(biāo)儀（熱電公司，美國(guó)）。

藥材采集于云南省西雙版納地區(qū)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)陳效忠副教授鑒定為刺齒鳳尾蕨的全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 化合物的分離和鑒定

95%乙醇提取刺齒鳳尾蕨藥材（10.0 kg）3次，每次1 h，得到浸膏（1.0 kg）。浸膏分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到相應(yīng)的4個(gè)萃取部位。乙酸乙酯萃取物（200.0 g）過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱色譜，分別用不同濃度乙醇洗脫，30%乙醇洗脫物（50.0 g）過(guò)sephadex LH-20柱色譜得到30個(gè)流份S1-S30。制備型HPLC（乙腈-水=30∶70，流速5.0 mL/min）對(duì)S10進(jìn)行分離，得到化合物2（12.0 mg）和5（12.0 mg）。制備型HPLC（乙腈-水=40∶60，流速5.0 mL/min）對(duì)S11進(jìn)行分離，得到化合物1（12.0 mg）和3（12.0 mg）。制備型TLC對(duì)S12（2.0 g）進(jìn)行分離，得到化合物4（5.0 mg）。

化合物1白色不定型粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：3.52（1H，dd，J = 12.0、5.0 Hz，H-1），2.00（1H，m，H-2a），1.63（1H，m，H-2b），2.12（1H，m，H-3a），1.28（1H，m，H-3b），2.11（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5），1.96（1H，m，H-6），3.85（1H，d，J = 2.8 Hz，H-7），2.09（1H，m，H-9），3.00（1H，m，H-11a），1.48（1H，m，H-11b），2.00（1H，m，H-12a），1.63（1H，m，H-12b），3.06（1H，d，J = 2.5 Hz，H-13），2.28（1H，m，H-14a），1.48 （1H，m，H-14b），5.96（1H，s，H-17a），5.30（1H，s，H-17b），1.21（3H，s，H-18），1.11（3H，s，H-20）；13C NMR（CDCl3，100 MHz） δ：81.9（C-1），30.2（C-2），35.3（C-3），42.8（C-4），45.0（C-5），27.0（C-6），72.2（C-7），53.4（C-8），47.3（C-9），44.5（C-10），20.8（C-11），33.0（C-12），38.3（C-13），35.4（C-14），214.8（C-15），149.4（C-16），115.6（C-17），28.5（C-18），183.6（C-19），11.5（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定化合物為geopyxin A，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

化合物2白色不定型粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：1.84（1H，m，H-1a），0.96（1H，m，H-1b），1.70（1H，m，H-2a），1.47（1H，m，H-2b），2.16（1H，m，H-3a），1.09（1H，td，J = 13.2、4.0 Hz，H-3b），2.05（1H，m，H-5），2.03（1H，m，H-6a），1.91（1H，m，H-6b），3.93（1H，m，H-7），1.84（1H，d，J = 8.0 Hz，H-9），1.86（1H，m，H-11a），1.48（1H，m，H-11b），1.92（1H，m，H-12a），1.70（1H，mz，H-12b），3.06（1H，s，H-13），2.30（1H，m，H-14a），1.48（1H，m，H-14b），6.00（1H，s，H-17a），5.31（1H，s，H-17b），1.25（3H，s，H-18），1.03（3H，s，H-20）；13C NMR（CDCl3，100 MHz） δ：39.8（C-1），18.5（C-2），37.5（C-3），43.3（C-4），46.5（C-5），27.4（C-6），72.4（C-7），53.1（C-8），46.3（C-9），40.1（C-10），18.9（C-11），32.7（C-12），38.1（C-13），34.7（C-14），214.3（C-15），149.2（C-16），116.0（C-17），28.7（C-18），184.1（C-19），15.8（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定化合物為geopyxin C，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

化合物3白色不定型粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：1.98（1H，m，H-1a），0.95（1H，m，H-1b），1.64（1H，m，H-2a），1.55（1H，m，H-2b），1.46（1H，m，H-3a），1.29（1H，m，H-3b），1.22（1H，m，H-5），1.50（1H，m，H-6a），1.35（1H，m，H-6b），1.68（1H，m，H-7a），1.56（1H，m，H-7b），1.38（1H，m，H-9），5.08（1H，m，H-11），1.95（1H，m，H-12a），1.90（1H，m，H-12b），2.65（1H，s，H-13），2.00（1H，m，H-14a），1.18（1H，m，H-14b），2.50（1H，d，J = 16.8 Hz，H-15a），2.05（1H，m，H-15b），4.85（1H，s，H-17a），4.70（1H，s，H-17b），3.45（1H，d，J = 10.8 Hz，H-18a），3.12（1H，d，J = 10.8 Hz，H-18b），0.77（1H，s，H-19），1.03（1H，s，H-20），1.95（1H，s，11-OAc）；13C NMR（CDCl3，100 MHz） δ：39.5（C-1），17.8（C-2），35.2（C-3），37.7（C-4），49.4（C-5），19.9（C-6），40.7（C-7），43.0（C-8），62.0（C-9），38.0（C-10），69.3（C-11），39.8（C-12），42.5（C-13），39.5（C-14），48.0（C-15），155.5（C-16），103.2（C-17），72.0（C-18），17.7（C-19），18.0（C-20），170.3（11a-OAc），21.8（11b-OAc）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定化合物為ent-11β-acetoxykaur-16-en-18-ol，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3。

化合物4白色不定型粉末。1H NMR（MeOH，400 MHz） δ：1.88（1H，m，H-1a），0.95（1H，m，H-1b），2.00（1H，m，H-2a），1.43（1H，m，H-2b），2.18（1H，m，H-3a），1.09（1H，m，H-3b），1.77（1H，m，H-5），2.11（1H，m，H-6a），1.99（1H，m，H-6b），3.64（1H，s，H-7），1.43（1H，d，J = 7.8 Hz，H-9），1.65（1H，m，H-11a），1.58（1H，m，H-11b），1.68（1H，m，H-12a），1.59（1H，m，H-12b），2.09（1H，m，H-13），1.85（1H，d，m，H-14a），1.71（1H，m，H-14b），1.75（1H，d，J = 14.0 Hz，H-15a），1.56（1H，d，J = 14.0 Hz，H-15b），3.71（1H，d，J = 12.0 Hz，H-17a），3.65（1H，d，J = 12.0 Hz，H-17b），1.19（1H，s，H-18），1.04（1H，s，H-20）；13C NMR（MeOH，100 MHz） δ：41.7（C-1），20.4（C-2），39.3（C-3），44.3（C-4），48.1（C-5），30.4（C-6），78.0（C-7），49.1（C-8），51.1（C-9），40.5（C-10），19.2（C-11），27.7（C-12），46.2（C-13），37.5（C-14），50.2（C-15），82.8（C-16），66.8（C-17），29.2（C-18），182.5（C-19），16.1（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定化合物為7β，16α，17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖4。

化合物5白色不定型粉末。1H NMR（Pyridine-d5，400 MHz） δ：6.26（1H，d，J = 10.5 Hz，H-2），6.72（1H，d，J = 10.5 Hz，H-3），2.38（1H，m，H-5），4.82（1H，m，H-6），2.05（1H，m，H-9），2.23（1H，m，H-11a），1.65（1H，m，H-11b），2.20（1H，m，H-12a），1.35（1H，m，H-12b），2.87（1H，m，H-13），2.56（1H，d，J = 12.5 Hz，H-14a），2.48（1H，dd，J = 12.5、4.6 Hz，H-14b），6.05（1H，s，H-17a），5.38（1H，s，H-17b），1.57（1H，s，H-18），4.09（1H，d，J = 12.0 Hz，H-19a），3.75（1H，d，J = 12.0 Hz，H-19b），5.05（1H，d，J = 9.6 Hz，H-20a），4.62（1H，d，J = 9.6 Hz，H-20b）；13C NMR（Pyridine-d5，100 MHz） δ：197.9（C-1），130.2（C-2），157.6（C-3），42.1（C-4），58.9（C-5），73.6（C-6），96.8（C-7），60.3（C-8），49.3（C-9），47.1（C-10），20.3（C-11），30.2（C-12），34.8（C-13），25.8（C-14），209.1（C-15），153.8（C-16），118.2（C-17），25.8（C-18），65.8（C-19），66.2（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定化合物為neolaxiflorin K，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖5。

2.2 體外抗腫瘤活性測(cè)試

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞置于96孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，設(shè)置5個(gè)不同濃度梯度（分別為1.0、5.0、25.0、75.0、125.0 μmol/L）的待測(cè)化合物，加到細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入SRB試劑，按照SRB方法[17]測(cè)定化合物抑制腫瘤細(xì)胞的IC50值。

以人源結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116）為模型對(duì)化合物進(jìn)行體外活性篩選，結(jié)果顯示化合物1～5的IC50值分別為1.20、2.45、50.2、58.9和3.26 μmol/L。

3 討論

體外抗腫瘤活性篩選表明化合物1、2和5具有顯著的抗腫瘤活性，而化合物3和4沒(méi)有抗腫瘤活性。通過(guò)比較化合物的結(jié)構(gòu)特征和活關(guān)系可知化合物1、2和5具有α，β不飽和酮基團(tuán)從而表現(xiàn)出抗腫瘤活性，而化合物3和4不具備上述基團(tuán)從而活性消失，該結(jié)論與此類化合物的構(gòu)效關(guān)系總結(jié)一致[3]，下一步工作將繼續(xù)研究本屬植物，期待發(fā)現(xiàn)活性更強(qiáng)的貝殼杉烷二萜類化合物。

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（收稿日期：2016-12-20 本文編輯：李亞聰）