離子色譜法測(cè)定水果和蔬菜中3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸的含量

趙振東，李 平，朱建忠

（1.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，?？?70228； 2.海南國(guó)際旅游島發(fā)展研究院，?？?70228；3.海南賽諾實(shí)業(yè)有限公司，?？?70125）

離子色譜法測(cè)定水果和蔬菜中3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸的含量

趙振東1，2，李 平3，朱建忠1

（1.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，?？?70228； 2.海南國(guó)際旅游島發(fā)展研究院，海口570228；3.海南賽諾實(shí)業(yè)有限公司，?？?70125）

水果或蔬菜樣品（5.00g）采用含10%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈的35mmol·L－1氫氧化鈉溶液45mL超聲提取，萃取液經(jīng)固相萃取C18小柱凈化后，選用AS11分離柱（4mm×250mm）進(jìn)行色譜分離，用與上文中相同的乙腈－氫氧化鈉混合液為流動(dòng)相。用紫外檢測(cè)器測(cè)定。3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸的質(zhì)量濃度均在0.05～10g·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，兩者的檢出限（3S／N）依次為0.009，0.012g·L－1。對(duì)10g·L－1的3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測(cè)定6次，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差依次為0.14%，1.4%。在0.50，2.0，10g·L－1等3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率在77.1%～104%之間。

離子色譜法；3－吲哚乙酸；3－吲哚丁酸；水果；蔬菜

3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸具有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和水果蔬菜催熟等方面。由于不規(guī)范使用，其對(duì)當(dāng)前環(huán)境的影響日趨嚴(yán)重，引起了人們極大的關(guān)注。目前對(duì)3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸的測(cè)定方法主要有氣相色譜法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法等［16］。這些方法存在樣品處理操作步驟繁瑣，所測(cè)成分中途損失嚴(yán)重，獲得的數(shù)據(jù)可靠性較低等缺點(diǎn)［7］。也有使用離子色譜－電導(dǎo)檢測(cè)和離子色譜－熒光檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道［8］，但尚未見離子色譜－紫外檢測(cè)的方法。本工作建立了離子色譜－紫外檢測(cè)對(duì)3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸的殘留量的分析方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CIC 500型離子色譜儀，配二元泵、柱溫箱、淋洗液發(fā)生器、自動(dòng)進(jìn)樣器和紫外檢測(cè)器；LC 30AD型液相色譜儀；JYL－C50T型粉碎機(jī)；SB－3200DTS型超聲波萃取儀；PureLab Ultra超純水系統(tǒng)；離子色譜專用固相萃?。⊿PE）C18小柱（300mg）。

3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1.000g·L－1，稱取3－吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.5%）和3－吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.9%）各10.05，10.01mg置于10mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解（可超聲波助溶解）。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms

乙腈為色譜純，試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

AG11保護(hù)柱（4mm×50mm），AS11分離柱（4mm×250mm）；柱溫30℃；流動(dòng)相為含10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙腈的35mmol·L－1氫氧化鈉溶液，流量1.0 mL·min－1；進(jìn)樣體積25μL，分析時(shí)間30min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取經(jīng)粉碎機(jī)打粉后的試樣5.00g于50mL容量瓶中，加入流動(dòng)相45mL作為提取溶液，密封超聲萃取30min，靜置至室溫后加入流動(dòng)相定容，轉(zhuǎn)移部分溶液至離心管中，于4℃下，以10 000r· min－1轉(zhuǎn)速離心20min。上清液經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過濾，濾液經(jīng)SPE C18小柱凈化后，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、豇豆空白樣品和豇豆加標(biāo)樣品的色譜圖見圖1。

由圖1可知：3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸的保留時(shí)間分別為2.8，4.8min。

2.2 樣品提取方法的選擇

水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留的提取方法主要采用水浴搖床萃取、加速溶劑萃取和勻漿萃取等，這些方法操作過程稍繁瑣，提取效率欠佳，同時(shí)分析成本高。超聲萃取具有提取時(shí)間短、效率高和分析成本低的特點(diǎn)。試驗(yàn)選用超聲萃取法提取水果、蔬菜樣品中農(nóng)藥殘留。

3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸在強(qiáng)堿性溶劑中主要呈陰離子狀態(tài)存在，由于具備π電子共軛體系，它們?cè)谒械娜芙舛容^小，故在提取溶劑中加入少量乙腈有助于提高滲透效率。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在不連接色譜柱的情況下，采用含10%乙腈的35mmol·L－1氫氧化鈉溶液作為流動(dòng)相，對(duì)10g· L－1的3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在配二極管陣列檢測(cè)器的液相色譜儀中進(jìn)行全掃描（190～600nm）。結(jié)果表明：3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸在波長(zhǎng)210nm處有較強(qiáng)的紫外吸收。進(jìn)一步對(duì)空白樣品進(jìn)行掃描發(fā)現(xiàn)，在波長(zhǎng)210nm處干擾物質(zhì)吸收不強(qiáng)，便于檢測(cè)。試驗(yàn)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。

2.4 色譜條件的選擇

2.4.1 色譜柱

水果和蔬菜中化學(xué)成分比較復(fù)雜，化學(xué)性質(zhì)差別明顯，只有選擇合適的色譜柱對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行分離，才能達(dá)到有效分離的目的。試驗(yàn)考察了AS11分離柱（4mm×250mm）和AS19分離柱（4mm× 250mm）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品的分離效果。結(jié)果表明：AS11分離柱能有效將3－吲哚乙酸、3－吲哚丁酸與其他共存離子分離，峰形較好，分析時(shí)間短。此外，使用AS11分離，柱壓較低，在連續(xù)分析復(fù)雜樣品時(shí)，能起到保護(hù)泵的作用。試驗(yàn)選用AS11陰離子柱（4mm×250mm）為分離柱。

2.4.2 淋洗液

準(zhǔn)確測(cè)定目標(biāo)離子，必須選擇合適的淋洗液，保證被測(cè)組分與其他離子能有效分離。目前用于分離陰離子的淋洗液有碳酸鹽和氫氧根體系；其中氫氧根體系對(duì)于有機(jī)酸的分離最佳，且無需單獨(dú)配制，工作效率比較高。試驗(yàn)選用氫氧根體系的淋洗液。

3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸由于具備π電子共軛體系，會(huì)與色譜柱填料中π電子產(chǎn)生共軛效應(yīng)，導(dǎo)致長(zhǎng)期保留在色譜柱內(nèi)，因此試驗(yàn)在淋洗液中加入一定量的乙腈（乙腈的加入不影響紫外檢測(cè)），利用乙腈屏蔽色譜柱中的π電子對(duì)。試驗(yàn)考察了在淋洗液中加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明：乙腈的體積分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，色譜保留行為太弱，目標(biāo)組分與干擾組分共流出；乙腈的體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，目標(biāo)組分保留時(shí)間過長(zhǎng)，同時(shí)重復(fù)性變差；乙腈的體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，既能保證目標(biāo)組分與干擾離子的有效分離，又節(jié)約分析時(shí)間。試驗(yàn)選擇在淋洗液中加入10%乙腈。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

移取1 000g·L－1的3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配成0.05，0.10，1.0，5.0，10g· L－1的3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按色譜條件對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，以3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸的質(zhì)量濃度均在0.05～10g·L－1內(nèi)呈線性，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

取等比例空白基質(zhì)樣品，混合后加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，采用逐級(jí)稀釋方法，以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（3S／N），以10倍信噪比計(jì)算方法的測(cè)定下限（10S／N），結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.1 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.6 精密度試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)10g·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果表明：3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.20%，1.2%；3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸峰面積的RSD分別為0.14%，1.4%。

2.7 回收試驗(yàn)

采用1 000g·L－1的3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成0.50，2.0，10g·L－1的提取液。稱取打漿后的水果和蔬菜空白樣品各5g，依次加入3種不同濃度加標(biāo)提取液，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)平行樣品3份，其結(jié)果見表2。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of test for recovery（n＝3）

本工作采用離子色譜－紫外檢測(cè)的方法快速測(cè)定水果和蔬菜中3－吲哚乙酸和3－吲哚丁酸的殘留量，相比于其他方法，本法前處理更為簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快捷，靈敏度高，特別適用于大量樣品檢測(cè)。

［1］ 李惠琳，云自厚，楊亦平，等.α－溴－2、3、4、5、6五氟甲苯衍生氣相色譜同時(shí)測(cè)定吲－3－乙酸和脫落酸［J］.植物學(xué)報(bào)，1990，32（3）：205－209.

［2］ ESPSTEIN E，COHEN J D.Microscale preparation of pentafluorobenzyl esters：dlectron－capture gas chromatographic detection of indole－3－acetic acid from plants［J］.Journal of Chromatography，1981，209（3）：413－420.

［3］ 吳少伯，黃海，趙毓桔.植物激素脫落酸的放射免疫測(cè)定［J］.植物生物學(xué)通訊，1985（1）：44－46.

［4］ 吳頌如，陳婉芬，周夔.酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定內(nèi)源植物激素［J］.植物生物學(xué)通訊，1988（5）：53－57.

［5］ 謝君，張義正.植物內(nèi)源激素的反相高效液相色譜法測(cè)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2001，20（1）：60－61.

［6］ 張培志，徐育，朱巖.離子色譜法分離－抑制電導(dǎo)檢測(cè)吲哚乙酸和吲哚丁酸［J］.理化檢驗(yàn)－化學(xué)分冊(cè)，2002，38（9）：448－449.

［7］ 吳東亮，徐茂生，張培志，等.離子色譜法電導(dǎo)檢測(cè)測(cè)定土壤中的吲哚－3－乙酸［J］.儀器儀表學(xué)報(bào)，2001，22（4）：376－377.

［8］ 施青紅，吳東亮，陳志斌，等.離子色譜熒光檢測(cè)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素吲哚－3－乙酸和吲哚－3－丁酸［J］.寧波高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2001，13：147－150.

IC Determination of Indol－3－acetic Acid and Indol－3－butyric Acid in Fruit and Vegetable

ZHAO Zhendong1，2，LI Ping3，ZHU Jianzhong1
（1.College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou570228，China；2.Institute for the Development of Hainan International Tourism Island，Haikou570228，China；3.Hainan Shiner Industrial Co.，Ltd.，Haikou570125，China）

The sample of fruit or vegetable（5.00g）was extracted ultrasonically with（45mL）of a mixture of CH3CN and 35mmol·L－1NaOH solution（10＋90），and the extract was then purified on C18SPE colunm.The purified extract was separated by IC，using AS11column（4 mm×250 mm）as stationary phase and the same mixture of CH3CN and NaOH solution mentioned above as mobile phase.UV detector was used in the determination.Linear relationships between values of mass concentration of indol－3－acetic acid and indol－3－butyric acid were kept in the same range of 0.05－10g·L－1，with detection limits（3S／N）of 0.009，0.012g·L－1respectively.Precision of the method was tested at the concentration level of 10g·L－1indol－3－acetic acid and indol－3－butyric acid mixed standard solution for 6determination，RSD′s found from the peak area values were 0.14%and 1.4%respectively.Tests for recovery were made by standard addition method at the concentration levels of 0.50，2.0，10g·L－1，giving values of recovery in the range of 77.1%－104%.

IC；indol－3－acetic acid；indol－3－butyric acid；fruit；vegetable

O657.7

A

1001－4020（2017）05－0590－04

10.11973／lhjy－h(huán)x201705023

2016－05－11

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)（2012YQ090229）；海南省自然科學(xué)基金（20152020）

趙振東（1981－），男，天津人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事色譜、質(zhì)譜分析工作，zhaozhendong＠hainu.edu.cn