高效液相色譜法測(cè)定脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的含量Δ

李 婷，安紅麗，辛 蕾，封衛(wèi)毅，張玉平

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 西安 710061； 2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心，陜西 西安 710061)

高效液相色譜法測(cè)定脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的含量Δ

李 婷1*，安紅麗2，辛 蕾1#，封衛(wèi)毅1，張玉平1

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 西安 710061； 2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心，陜西 西安 710061)

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的含量。方法：色譜柱為Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為0.03%的磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈；流速為1 ml/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm；單次自動(dòng)進(jìn)樣體積為5 μl。結(jié)果：哈巴俄苷質(zhì)量濃度在5.0～500.0 μg/ml(即0.025～2.500 mg)范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r2=0.999 7)，平均回收率為98.11%(RSD=1.32%，n=5)。結(jié)論：本方法為脈絡(luò)寧注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了新的依據(jù)，為臨床安全用藥提供了理論指導(dǎo)。

脈絡(luò)寧注射液； 哈巴俄苷； 含量測(cè)定； 高效液相色譜法

脈絡(luò)寧注射液是由玄參、牛膝、石斛、金銀花等中藥材制成，具有活血化瘀、清熱養(yǎng)陰的功能，可用于靜脈血栓形成、血栓閉塞性脈管炎、動(dòng)脈硬化性閉塞癥、腦血栓形成及其后遺癥等的治療[1]。臨床上許多報(bào)道指出，應(yīng)用脈絡(luò)寧注射液會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，其中，過敏反應(yīng)是其突出的不良反應(yīng)。根據(jù)初步研究結(jié)果，確定哈巴俄苷是脈絡(luò)寧注射液中潛在致敏組分，故本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-11]，采用高效液相色譜(high performance liquid chromat-ography，HPLC)法對(duì)脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料

1.1 儀器

RPL-10ZD型裝柱機(jī)(大連日普利科技儀器有限公司)；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；QL-901VORTEX型渦旋混勻儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；SB-5200型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；ZNCL磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；RG-18型高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；MCO-15AC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社)；XDS-1B型倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)；TDL80-2b型臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；YXQ-LS-50SⅡ型高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；濾器(培養(yǎng)基專用，上海艾研生物科技有限公司)；優(yōu)普超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)；液氮生物容器(成都金鳳液氮容器有限公司)；AUY-120型精密天平(日本島津公司)；YP-5102型電子天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

哈巴俄苷(純度≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：130604)；脈絡(luò)寧注射液(批號(hào)：20120206、20131005、20131113、20140426、20140907)；磷酸(西安化學(xué)試劑廠)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Tedia有限公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為0.03%的磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速設(shè)定為1 ml/min，哈巴俄苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，單次自動(dòng)進(jìn)樣5 μl，色譜柱柱溫設(shè)定為30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 哈巴俄苷系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液的制備：精密稱取哈巴俄苷對(duì)照品5 mg分別置于6個(gè)5 ml棕色容量瓶中，加入色譜純甲醇超聲溶解，混勻，并最終用色譜純甲醇定容，得到6份質(zhì)量濃度均為1 mg/ml的哈巴俄苷儲(chǔ)液，用甲醇分別將各自的儲(chǔ)液稀釋至哈巴俄苷終質(zhì)量濃度為5.0、10.0、50.0、100.0、300.0、500.0 μg/ml的系列質(zhì)量濃度樣品，置于4 ℃條件下避光保存，用于哈巴俄苷的線性關(guān)系考察。

2.2.2 脈絡(luò)寧注射液供試品溶液的制備：精密量取脈絡(luò)寧注射液1 ml置于10 ml容量瓶中，用抽濾過的超純水定容至刻度，混勻，用0.22 μm水相微孔濾膜濾過，置于4 ℃條件下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 哈巴俄苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍考察：將“2.2.1”中制備的哈巴俄苷質(zhì)量濃度為5.0、10.0、50.0、100.0、300.0、500.0 μg/ml的系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液分別進(jìn)入HPLC系統(tǒng)進(jìn)行色譜分析，重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄色譜圖(見圖1)，得到各對(duì)照品溶液哈巴俄苷的色譜峰面積均值分別為54 009、102 432、548 635、1 148 784、3 240 172、5 525 073，以各樣品哈巴俄苷的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以各樣品中哈巴俄苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性擬合，得到其回歸方程為Y=10 993X+1 778，r2=0.999 7。結(jié)果表明，哈巴俄苷質(zhì)量濃度在5.0～500.0 μg/ml(即0.025～2.500 mg)范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

A.供試品；B.對(duì)照品A.test samples；B.reference substance圖1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)色譜圖Fig 1 Chromatograms of system suitability test

2.3.2 檢測(cè)限與定量限：采用目測(cè)法計(jì)算信噪比(S/N)，當(dāng)S/N=3時(shí)，所分析哈巴俄苷的質(zhì)量為檢測(cè)限；當(dāng)S/N=10時(shí)，所分析哈巴俄苷的質(zhì)量為定量限。測(cè)得該方法下哈巴俄苷的檢測(cè)限為0.75 ng，定量限為2.50 ng。

2.3.3 日內(nèi)與日間精密度：24 h內(nèi)，分別連續(xù)5次重復(fù)分析低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(20.0、200.0、400.0 μg/ml)的哈巴俄苷對(duì)照品溶液，得到色譜圖中哈巴俄苷峰的色譜峰面積(見表1)，計(jì)算低、中、高2個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液中哈巴俄苷峰面積的RSD分別為0.25%、0.79%、0.27%，說(shuō)明該色譜條件下哈巴俄苷測(cè)定方法的日內(nèi)精密度良好。連續(xù)5 d，每日分別進(jìn)樣低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的哈巴俄苷對(duì)照品溶液各3次，記錄各自的峰面積，取5 d內(nèi)每日進(jìn)樣低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的色譜圖中哈巴俄苷色譜峰面積的平均值(見表2)，計(jì)算低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度峰面積的RSD分別為1.46%、1.98%、1.11%，說(shuō)明該色譜條件下哈巴俄苷測(cè)定方法的日間精密度良好。

表1 哈巴俄苷的日內(nèi)精密度

表2 哈巴俄苷的日間精密度Tab 2 Intra-day precision of harpagoside

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：將脈絡(luò)寧注射液與400.0 μg/ml的哈巴俄苷對(duì)照品溶液置于室溫(25 ℃)條件下，分別于0、6、12、24、48 h進(jìn)樣分析，記錄每次進(jìn)樣色譜圖中哈巴俄苷的色譜峰面積(見表3)，計(jì)算0、6、12、24、48 h峰面積與0 h峰面積的比值(Ar/A0)，其值在98%～102%之間，符合穩(wěn)定性考察要求，故脈絡(luò)寧注射液與哈巴俄苷對(duì)照品溶液在室溫(25 ℃)條件下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Stability of the experimental results

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果：將脈絡(luò)寧注射液供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣，每次進(jìn)樣5 μl，記錄進(jìn)樣色譜圖中哈巴俄苷的色譜峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的質(zhì)量，向脈絡(luò)寧注射液分別加入質(zhì)量濃度為0.50 mg/ml的哈巴俄苷溶液80、80、80、100、100、100、120、120、120 μl進(jìn)樣分析，記錄每次進(jìn)樣后色譜圖中哈巴俄苷的色譜峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出加樣后脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的質(zhì)量，根據(jù)公式計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。低、中、高三組加入哈巴俄苷的脈絡(luò)寧注射液的加樣回收率分別為(98.02±0.41)%、(96.69±0.24)%、(99.63±0.22)%，三組的平均回收率為98.11%，三組回收率之間的RSD為1.32%。

2.4 脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的含量測(cè)定結(jié)果

在上述色譜條件下，將5批脈絡(luò)寧注射液分別進(jìn)樣分析，各進(jìn)樣3次，將得到的各色譜圖中哈巴俄苷峰色譜峰面積的平均值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各供試品中哈巴俄苷的含量，結(jié)果見表5。

表4 哈巴俄苷在脈絡(luò)寧注射液中加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Recovery test of harpagoside in mailuoning injections

表5 脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的含量測(cè)定結(jié)果Tab 5 Content determination of harpagoside in mailuoning injections

3 討論

本研究結(jié)果顯示，所測(cè)定的脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的含量范圍為0.87～1.03 mg/ml，說(shuō)明同一廠家不同批號(hào)脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的含量有差異，這可能與生產(chǎn)工藝、貯藏時(shí)間、貯藏條件等有關(guān)系。此結(jié)果可為進(jìn)一步的細(xì)胞水平、動(dòng)物水平相關(guān)的過敏實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

任何含量測(cè)定方法的建立都需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所建立的哈巴俄苷測(cè)定方法，待測(cè)樣品中哈巴俄苷的含量在5.0～500.0 μg/ml(即0.025～2.500 mg)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，該方法對(duì)于哈巴俄苷的檢測(cè)限為0.75 ng、定量限為2.50 ng，日內(nèi)及日間精密度、穩(wěn)定性均良好，加樣回收率也能夠滿足哈巴俄苷定量測(cè)定試驗(yàn)的要求。因此，本研究所建立的脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷的含量測(cè)定方法是可行的，可以應(yīng)用此方法對(duì)脈絡(luò)寧注射液中的哈巴俄苷的含量進(jìn)行測(cè)定，為脈絡(luò)寧注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了新的依據(jù)，為臨床安全用藥提供了理論指導(dǎo)。

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Content Determination of Harpagoside in Mailuoning Injections by HPLCΔ

LI Ting1, AN Hongli2, XIN Lei1, FENG Weiyi1， ZHANG Yuping1

(1.Dept.of Pharmacy, the First Hospital Affiliated to Xi’an Jiaotong University,Shaanxi Xi’an 710061, China； 2.Medical Transformation Center， the First Hospital Affiliated to Xi’an Jiaotong University， Shaanxi Xi’an 710061， China)

OBJECTIVE：To establish the method for content determination of harpagoside in mailuoning injections by HPLC.METHODS: The chromatographic column was Diamonsil C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm), the mobile phase A was 0.03% phosphoric acid solution, and mobile phase B was acetonitrile, with flow rate of 1 ml/min, column temperature of 30 ℃, detection wavelength of 278 nm, and single automatic sample volume of 5 μl. RESULTS: The harpagoside showed a good linear relationship in content of 5.0 μg/ml-500.0 μg/ml (0.025 mg-2.500 mg) (r2=0.999 7), the average recovery was 98.11% (RSD=1.32%,n=5). CONCLUSIONS: This method provides new reference for the formulation of quality standard of mailuoning injections, in addition of theoretical guidance for clinical safety administration.

Mailuoning injections; Harpagoside; Content determination; HPLC

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2016JM8037)

R927.2

A

1672-2124(2017)05-0584-03

2017-03-20)

*藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：121152808@qq.com

#通信作者：藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：396526973@qq.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.05.003