UGT1A10基因SNP rs10187694對(duì)嗎替麥考酚酯代謝的影響*

肖超，孫紅成，鄧貴龍，宋國賀，王宇鵬，陳健，孫星，鐘林，彭志海，王曉亮

（上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院 普外科，上海 200080）

UGT1A10基因SNP rs10187694對(duì)嗎替麥考酚酯代謝的影響*

肖超，孫紅成，鄧貴龍，宋國賀，王宇鵬，陳健，孫星，鐘林，彭志海，王曉亮

（上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院 普外科，上海 200080）

目的 體外研究尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT1A10）基因SNP rs10187694多態(tài)位點(diǎn)G/A變異對(duì)嗎替麥考酚酯（MMF）代謝的影響，明確該位點(diǎn)變異是否與MMF個(gè)體代謝差異有關(guān)。方法采用基因重組、定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建UGT1A10基因SNP rs10187694位點(diǎn)含有不同等位基因的重組過表達(dá)載體，POLO 3000轉(zhuǎn)染法將重組過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC/MS/MS）系統(tǒng)，檢測(cè)霉酚酸（MPA）代謝產(chǎn)物7-O-葡醛酸苷（MPAG）的生成量，以評(píng)估轉(zhuǎn)染不同等位基因HEK293細(xì)胞中酶的活性。結(jié)果成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-prom（G）和pIRES2-EGFP-prom（A）重組過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。LC/MS/MS系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示，攜帶A等位基因的突變型UGT1A10代謝MMF產(chǎn)生MPAG的能力降低，其24 h MPAG的生成量為（226.00±14.57）nmol/L，而野生型的生成量為（269.00±14.07）nmol/L，UGT1A10突變型 MPAG 的生成量是野生型的84.00%，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論UGT1A10基因SNP rs10187694位點(diǎn)G/A突變可影響MMF代謝產(chǎn)物MPAG的生成，可能是造成不同個(gè)體MMF代謝差異的重要原因之一。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶；霉酚酸酯；藥物代謝

嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）是臨床廣泛應(yīng)用的抗增殖免疫抑制劑之一，能夠預(yù)防肝、腎等大臟器移植術(shù)后的急、慢性移植排斥反應(yīng)[1]。MMF作為霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）的2-乙基酯類衍生物，是一種前體藥物，本身不具有活性，經(jīng)口服或靜脈給藥后，需在體內(nèi)迅速水解生成活性產(chǎn)物MPA，才能發(fā)揮藥理作用[2]。MPA能非競(jìng)爭(zhēng)性、選擇性及可逆性地抑制次黃嘌呤核苷酸酶（inosine-5'-monophosphate dehydrogenase，IMPDH），從而抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖，被廣泛用于器官移植術(shù)后和自身免疫病的治療。但是MPA的個(gè)體化藥代動(dòng)力學(xué)差異明顯，如果免疫抑制不足就會(huì)發(fā)生器官移植后排斥反應(yīng)，免疫抑制過度則會(huì)產(chǎn)生許多副作用，比如腹瀉、貧血、白細(xì)胞減少和感染等[3]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGT）是參與MPA代謝的限速酶，UGT及其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）會(huì)影響MPA的藥物代謝，并最終造成不同人群、不同個(gè)體免疫抑制的療效和副作用出現(xiàn)差異[4]。

UGT是一個(gè)超家族酶，其中最重要的是UGT1和UGT2家族。有研究表明，UGT1亞家族中的UGT1A10參與MMF代謝，UGT1A10基因多態(tài)性可以影響MMF代謝產(chǎn)物7-O-葡醛酸苷（mycophenolic acid glucuronide，MPAG）的生成水平[5]。UGT1A10 基因SNP rs10187694是第415位堿基處的G堿基突變?yōu)锳堿基。該位點(diǎn)突變后，對(duì)MMF代謝影響尚不明確。因此，本研究通過體外構(gòu)建UGT1A10基因該位點(diǎn)的野生型和突變型過表達(dá)載體，評(píng)估轉(zhuǎn)染不同等位基因的細(xì)胞中MMF代謝產(chǎn)物MPAG的24 h生成量，從而明確該位點(diǎn)突變對(duì)MMF代謝的影響，將有助于預(yù)測(cè)用藥時(shí)可能產(chǎn)生的副作用，并為臨床個(gè)體化用藥提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MPA、MPAG購自美國Roche Bioscience公司，HEK293細(xì)胞（美國ATCC公司），DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金公司），BglⅡ酶、SalⅠ酶購自美國MBI公司，DNA連接試劑盒（日本TaKaRa公司），小量質(zhì)粒抽提試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒購自美國Axgene公司，胎牛血清、改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自美國Invtrogen公司，POLO 3000（上海銳賽生物技術(shù)有限公司），質(zhì)粒pIRES2-EGFP、引物設(shè)計(jì)及目的基因測(cè)序?yàn)槊绹鳬nvitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司），CEQ8000測(cè)序儀（美國Beckman&Coulter公司）。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC/MS/MS）系統(tǒng)包括：Agilent 1100（美國安捷倫科技有限公司）液相色譜系統(tǒng)、LEAP CTC HTS PAL自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)（瑞士CTC分析儀器股份公司）、API4000三重四級(jí)桿檢測(cè)器（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司），操作軟件為Analyst 1.5.1。

1.3 方法

1.3.1 UGT1A10基因CDS區(qū)全長擴(kuò)增和過表達(dá)載體的構(gòu)建 以含目的基因UGT1A10的質(zhì)粒作為模板，PCR擴(kuò)增UGT1A10基因CDS區(qū)，在目的基因的5'-端添加BglⅡ酶切位點(diǎn)，3'-端添加SalⅠ酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)信息見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，61℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。預(yù)期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物全長1 593 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，觀察目的DNA條帶并拍照。目的基因PCR產(chǎn)物和目的載體pIRES2-EGFP用BglⅡ、SalⅠ分別進(jìn)行酶切后，將目的基因連接至表達(dá)載體。將10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那抗性的溶菌肉湯（luria bertani，LB）培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，將PCR鑒定呈陽性的克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中，搖菌過夜，次日抽提質(zhì)粒。將菌落PCR呈陽性的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，預(yù)期DNA產(chǎn)物應(yīng)為1 593 bp和5.3 kbp 2個(gè)條帶，將菌落PCR和酶切鑒定均呈陽性的克隆進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)。

1.3.2 UGT1A10基因相應(yīng)SNP位點(diǎn)定點(diǎn)突變和過表達(dá)載體的構(gòu)建 按照突變PCR程序，進(jìn)行分段擴(kuò)增并電泳切膠回收2個(gè)片段。將上述2個(gè)片段進(jìn)行PCR拼接，進(jìn)行突變體全長擴(kuò)增。用BglⅡ/SalⅠ酶對(duì)突變體PCR產(chǎn)物和目的載體pIRES2-EGFP進(jìn)行雙酶切，并將酶切回收的突變PCR產(chǎn)物與pIRES2-EGFP連接。按1.3.1的方法，培養(yǎng)挑選菌落進(jìn)行PCR和酶切鑒定，預(yù)期酶切鑒定DNA產(chǎn)物應(yīng)為1 590和2 300 bp 2個(gè)條帶，將鑒定均呈陽性的克隆測(cè)序與序列比對(duì)。見表1。

表1 擴(kuò)增與突變引物序列

1.3.3 UGT1A10目的基因轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞 采用POLO 3000轉(zhuǎn)染法，將攜帶綠色熒光蛋白的目的基因真核過表達(dá)載體pIRES-EGFP-UGT1A10轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染前24 h，將HEK293細(xì)胞用胰蛋白酶充分消化，接入6孔板，然后將各孔細(xì)胞分別置于1 ml（DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素+1%Glutamax）培養(yǎng)基，37℃、95%濕潤空氣、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中，使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞融合度達(dá)60%～80%。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將6孔板各孔分別換上新鮮800 μl DMEM+10%胎牛血清的培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃孵育。配制轉(zhuǎn)染所用的試劑混合物。A管取目的基因真核表達(dá)載體、陽性對(duì)照質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒各 1.2 μg，分別與 50 μl Opti-MEM 混勻；B 管取19.2 μl Lipo 2000與300 μl Opti-MEM混勻（6孔用量）。室溫靜置5 min，分別取50 μl B管溶液加入A組各管中，混勻，室溫孵育20 min。取100 μl上述DNA-Lipo混合液，均勻滴加到6孔板的相應(yīng)HEK293細(xì)胞中，輕輕搖勻，37℃培養(yǎng)箱過夜。8 h后，換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率并拍照。

1.3.4 轉(zhuǎn)染不同過表達(dá)載體HEK293細(xì)胞的MPAG產(chǎn)量檢測(cè) MMF的有效成分是MPA，MPA的主要終產(chǎn)物是MPAG，故可以將MPA作為底物加入HEK293細(xì)胞培養(yǎng)皿，通過評(píng)價(jià)最終代謝產(chǎn)物MPAG的水平來評(píng)估不同基因型細(xì)胞對(duì)MMF的代謝能力。用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）將MPA配制為濃度為600 mmol/L的溶液，用DMEM Media稀釋DMSO終濃度為0.1%，MPA的終濃度為600 μmol/L。將稀釋好的MPA加入轉(zhuǎn)染UGT1A10野生型、突變型及空白質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2、4和24 h后，加入 4倍含內(nèi)標(biāo)的預(yù)冷甲醇，終止反應(yīng)。離心取上清液，LC/MS/MS系統(tǒng)檢測(cè)代謝終產(chǎn)物MPAG的生成量。最終結(jié)果以突變型UGT1A10的相對(duì)活性表示：相對(duì)活性（%）=突變型亞酶活性/野生型亞酶活性×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用 t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UGT1A10基因CDS區(qū)全長擴(kuò)增和過表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，得到與預(yù)期1 593 bp大小一致的目的條帶（見圖1）。樣品3～10在1 593 bp處均見與預(yù)期一致的目的條帶（見圖2）。隨機(jī)挑選的樣品，均在1 593 bp和5.3 kbp處出現(xiàn)與預(yù)期一致的2條目的條帶（見圖3）。

2.2 UGT1A10基因定點(diǎn)突變和過表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

樣品4～9均在15 90 bp處出現(xiàn)目的條帶（見圖4）。樣品1、2、3均在1 590和2 300 bp處出現(xiàn)與預(yù)期一致的2條目的條帶。見圖5。

圖1 UGT1A10目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 重組克隆菌落的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 重組UGT1A10質(zhì)粒酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 目的基因定點(diǎn)突變前后測(cè)序結(jié)果

連接成功的樣品進(jìn)行基因測(cè)序證明，目的基因的相應(yīng)位點(diǎn)（UGT1A10基因的第415位堿基）的G堿基已經(jīng)突變?yōu)锳堿基，并且其他位置的基因序列與基因庫中該基因序列無差異。見圖6。

2.4 目的基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果

分別將空白質(zhì)粒、攜帶突變型位點(diǎn)及野生型位點(diǎn)的UGT1A10過表達(dá)載體（表達(dá)綠色熒光蛋白）轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。48 h后，普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果。見圖7。

2.5 轉(zhuǎn)染不同過表達(dá)載體HEK293細(xì)胞的MPAG生成量比較

分別轉(zhuǎn)染突變型、野生型及空白質(zhì)粒的3種HEK293細(xì)胞，每種細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，共3個(gè)6孔板，以檢測(cè)終產(chǎn)物MPAG的生成量，最終每種細(xì)胞MPAG的生成量為該種細(xì)胞各復(fù)孔結(jié)果的平均值。突變型與野生型復(fù)孔生成量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.199，P=0.000）。將相同濃度的底物MPA加入上述細(xì)胞24 h后，分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染突變型、野生型期空白質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞所代謝產(chǎn)生的MPAG生成量，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞中，6個(gè)復(fù)孔均未檢測(cè)到MPAG；在轉(zhuǎn)染突變型UGT1A10（AA）的HEK293細(xì)胞中，檢測(cè)到的MPAG生成量為轉(zhuǎn)染野生型UGT1A10（GG）的84.00%。結(jié)果表明，該位點(diǎn)的基因突變會(huì)影響MPA代謝產(chǎn)物MPAG的生成。2種UGT1A10類型各復(fù)孔MPAG的生成量見表2。

圖4 重組克隆菌落的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖5 重組UGT1A10質(zhì)粒酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳圖

圖6 目的基因定點(diǎn)突變前后測(cè)序結(jié)果

圖7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果 （×40）

表2 2種UGT1A10類型各復(fù)孔MPAG的生成量比較

3 討論

目前，MMF被廣泛應(yīng)用于預(yù)防器官移植術(shù)后的急、慢性排斥反應(yīng)和自身免疫疾病的治療[6]。MMF口服完全吸收，在體內(nèi)可迅速且完全（95%）地轉(zhuǎn)化成活性成分MPA，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用。然而，MMF的治療窗較窄，許多研究報(bào)道其藥效和毒性反應(yīng)，且存在很大個(gè)體差異[7-8]。有研究表明，體外孵育實(shí)驗(yàn)時(shí)，相同濃度MPA對(duì)T、B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抑制效果差異不大。然而，口服相同劑量MMF時(shí)，不同個(gè)體的MPA暴露水平差異＞10倍[9]。臨床許多因素，如性別、年齡、吸煙、肝腎功能及白蛋白濃度等，均可影響MPA的藥物代謝。UGT作為MPA代謝的限速酶，其SNP也被證明是MPA在不同個(gè)體之間產(chǎn)生藥物代謝差異的重要原因之一。

UGT是酶的超家族，含有117種酶，根據(jù)其核苷酸序列的相似性，分為4大家族：UGT1、UGT2、UGT3及UGT8。其中，最重要的是UGT1和UGT2家族。UGT1又包括 9個(gè)亞型：UGT1A（1、3～10），UGT2 包括亞型：UGT2A（1～3）和 UGT2B（4、7、10、11、15、17、28）[10]。人體內(nèi) 40%～70%的藥物需要通過Ⅱ相代謝反應(yīng)清除，而由UGT催化的葡萄糖醛酸化反應(yīng)占人體所有Ⅱ相反應(yīng)＞35%[11]。MMF的活性成分是MPA，MPA也需要在肝臟、腸道、腎臟的UGT的作用下，經(jīng)過葡萄糖醛酸化反應(yīng)，最終生成主產(chǎn)物MPAG，并經(jīng)腎臟排出體外[3]。在胃腸道中，UGT1A10對(duì)MPA葡萄苷酸化具有重要作用。已有研究表明，UGT1A10基因的多態(tài)性影響多種藥物的代謝，如某些抗腫瘤藥、免疫抑制類藥物，如麥考酚酸、類固醇類和酚類物質(zhì)等?；蚨鄳B(tài)性方面，SAEKI等[12]發(fā)現(xiàn)，UGT1A10的 3 個(gè)單核苷酸多態(tài)性：A177G（M59I）、T605C（T202I）和 T693C（無氨基酸改變）。其中，T202I的突變可能會(huì)對(duì)口服藥物的腸肝循環(huán)和葡萄苷酸化產(chǎn)生影響[13]。MARTINEAU等[14]報(bào)道UGT1A10的I211T突變會(huì)導(dǎo)致該酶對(duì)麥考酚酸的代謝能力喪失。ELAHI等[15]發(fā)現(xiàn)UGT1A10的E139K、T240M和L244I突變會(huì)導(dǎo)致氨基酸的改變，E139K突變即UGT1A10基因SNP rs10187694位點(diǎn)G/A突變。

如上所述，許多研究表明，UGT1A10對(duì)MPA的代謝產(chǎn)生影響。為此，本研究采用體外實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建UGT1A10基因SNP rs10187694位點(diǎn)野生型和突變型過表達(dá)載體，通過評(píng)估轉(zhuǎn)染該位點(diǎn)不同等位基因細(xì)胞中MMF代謝產(chǎn)物MPAG的24h生成量，明確該位點(diǎn)突變對(duì)MMF代謝產(chǎn)生的影響。數(shù)據(jù)分析顯示，攜帶A等位基因的變異型UGT1A10酶的活性降低，代謝產(chǎn)物MPAG的24 h生成量為攜帶G等位基因野生型的84.00%。結(jié)果表明，UGT1A10基因SNP rs10187694位點(diǎn)突變可影響MMF代謝產(chǎn)物MPAG的24 h生成量，推測(cè)該位點(diǎn)的多態(tài)性可能是造成不同個(gè)體MMF藥物代謝差異的重要原因之一。

在本研究中，筆者揭示UGT1A10基因第415位點(diǎn)突變與MPAG生成量的關(guān)系，表明UGT1A10基因多態(tài)性可能是造成不同個(gè)體MMF藥物代謝差異的重要原因之一。當(dāng)然，關(guān)于UGT1A10還有許多方面需要深入探索，如監(jiān)測(cè)臨床患者在服用MMF后的血藥濃度變化、進(jìn)一步明確該酶參與體內(nèi)藥物轉(zhuǎn)化的機(jī)制和過程，以及研究我國不同地區(qū)、人群中該基因的變異率等。

總之，UGT1A10基因多態(tài)性是影響MMF代謝的重要因素之一，本研究為臨床MMF的個(gè)體化用藥提供理論支持。如果能夠根據(jù)患者的基因遺傳特征，預(yù)測(cè)血藥濃度，合理設(shè)計(jì)個(gè)體化的給藥方案，相信會(huì)取得更好的治療效果。

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（童穎丹 編輯）

Effect of SNP rs10187694 ofUGT1A10gene on metabolism of Mycophenolate mofetil*

Chao Xiao,Hong-cheng Sun,Gui-long Deng,Guo-he Song,Yu-peng Wang,Jian Chen,Xing Sun,Lin Zhong,Zhi-hai Peng,Xiao-liang Wang
(Department of General Surgery,Shanghai General Hospital,Shanghai 200080,China)

ObjectiveTo study the effect of G/A mutation in SNP rs10187694 site of uridine diphosphate glucuronosyl transferase (UGT1A10)on Mycophenolate mofetil metabolism.MethodsThe recombinant overexpression vectors ofUGT1A10gene were constructed by gene recombination technique and the strategy of site directed mutagenesis.Then,the recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells by POLO3000 method.By detecting the yields of mycophenolic acid(MPA)metabolite 7-o-glucuronide(MPAG),the activity of enzyme in the HEK293 cells transfected with different alleles were evaluated.ResultsThe overexperession vectors pIRES2-EGFP-prom(G)and pIRES2-EGFP-prom(A)were successfully constructed and transfected into HEK293 cells.The results analyzed by LC/MS/MS showed that the cells containing mutant type ofUGT1A10gene with A allele produced less MPAG than those with G allele,the concentration of MPAG produced by mutant type in 24 hours was(226.00±14.57)nmol/L,however,the concentration in wild type was(269.00±14.07)nmol/L.The generation amount of MPAG in mutant type was 84.00%of that in wild type in 24 hours(P＜0.05).ConclusionsUGT1A10gene SNP rs10187694 can significantly affect the production of MPAG,which may be one of the reasons causing the difference in Mycophenolate mofetil metabolism.

UGT1A10;Mycophenolate mofetil;drug metabolism

R969.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.002

1005-8982（2017）12-0009-06

2016-03-29

國家自然科學(xué)基金（No：81270557，81110108010）

王曉亮，E-mail：xiaoliangwang2009@163.com