酶法輔助超聲提取功勞木中小檗堿的工藝優(yōu)化

寧娜，韓建軍，胡宇莉

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，貴州銅仁 554300；2.貴州省中獸藥工程研究中心，貴州銅仁 554300；3.重慶市動物疾病預(yù)防控制中心，重慶 401120)

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酶法輔助超聲提取功勞木中小檗堿的工藝優(yōu)化

寧娜1,2，韓建軍1,2，胡宇莉3

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，貴州銅仁 554300；2.貴州省中獸藥工程研究中心，貴州銅仁 554300；3.重慶市動物疾病預(yù)防控制中心，重慶 401120)

為了優(yōu)化酶法輔助超聲提取功勞木中小檗堿的工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析法，以小檗堿收率為響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，酶解最佳工藝條件為：酶解pH值3.5、酶用量10.6 mg/g、酶解溫度51 ℃、酶解時間97 min。在此條件下，小檗堿收率為22.46 mg/g。優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、收率高，為功勞木的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

功勞木；小檗堿；纖維素酶；超聲提取

功勞木為小檗科植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.) Carr.或細(xì)葉十大功勞Mahoniafortunei(Lindl.) Fedde的干燥莖，其性寒味苦，具清熱燥濕、瀉火解毒的作用，主治腸黃瀉痢、濕熱黃疸等癥[1]。功勞木含多種生物堿類成分，其中小檗堿為主要藥效成分[1-2]。研究表明小檗堿可促進(jìn)肉雞的生長代謝[3]、提高肉兔屠宰率[4]、改善肉兔脂質(zhì)代謝及增強(qiáng)機(jī)體抗氧化機(jī)能[5]等作用。

酶法輔助超聲提取作為植物有效成分提取的一種聯(lián)用技術(shù)，通常先用適宜的酶對植物進(jìn)行預(yù)處理，繼而利用超聲儀進(jìn)行有效成分的提取[6]。酶法輔助超聲提取作為一種新型聯(lián)用提取技術(shù)，已被應(yīng)用于兩面針[7]、蓖麻葉[8]、紫蘇葉[9]等多種植物有效成分提取中。目前已報到的功勞木提取方法主要有回流法[10]和超聲法[11]。本文首次將超聲波法和酶法聯(lián)合應(yīng)用于功勞木小檗堿的提取中，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，為功勞木深度開發(fā)和綜合利提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 FA1004B電子天平(奧克斯國際貿(mào)易上海有限公司)；KQ-500DE臺式數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Agilent1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；PHS-25型數(shù)字式顯示酸度計(上海偉業(yè)儀器廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 藥品與試劑 功勞木藥材(采自貴州省安順市布依族苗族自治縣六馬鄉(xiāng))，經(jīng)本院梁玉勇教授鑒定；小檗堿對照品(批號：110713-201212)，中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶(酶活力：11000 U/g)，寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；水為雙蒸水。

1.3 方法

1.3.1 小檗堿的提取

1.3.1.1 酶法輔助超聲提取 取干燥的功勞木藥材粉碎并過60 目篩。準(zhǔn)確稱取15 g置于裝有150 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的錐形瓶中，按照設(shè)定酶解條件(酶解pH值、酶用量、酶解溫度、酶解時間)進(jìn)行酶解后，過濾，并向經(jīng)過酶解處理的功勞木藥材中加入120 mL 70%乙醇，在超聲功率為400 W的條件下超聲提取30 min，過濾，合并提取液，即得到功勞木提取液。

1.3.1.2 回流法提取 取干燥的功勞木藥材粉碎并過60目篩。準(zhǔn)確稱取15 g置于圓底燒瓶中，加入120 mL 70%乙醇，乙醇熱回流提取3次，每次120 min。合并3次提取液，即得到功勞木提取液。

1.3.1.3 超聲法提取 取干燥的功勞木藥材粉碎并過60目篩。準(zhǔn)確稱取15 g置于裝有150 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的錐形瓶中，在提取pH值為3.5，提取溫度為51 ℃的條件下提取97 min后收集濾液，向藥材中加入120 mL 70%乙醇，在超聲功率為400W的條件下超聲提取30 min，過濾，合并提取液，即得到功勞木提取液。

1.3.2 小檗堿的含量測定

1.3.2.1 測定條件 采用HPLC法測定小檗堿含量[1]，色譜條件為：Diomansil-C18柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(用磷酸調(diào)pH值至3.0)(30∶70)為流動相，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長265 nm，進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.2.2 測定方法 將功勞木提取液濃縮至100 mL，然后精密吸取0.3 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。供試品溶液按照1.3.2.1色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計算小檗堿收率。其中，小檗堿收率(mg/g)是指從每克功勞木藥材粉末中提取得到的小檗堿的量(mg)。

1.3.3 功勞木小檗堿提取的響應(yīng)面優(yōu)化 基于前期單因素預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計方法，對影響酶法輔助超聲提取功勞木中小檗堿的關(guān)鍵因素進(jìn)行研究。以小檗堿收率為響應(yīng)值，以酶解pH值、酶用量、酶解溫度和酶解時間為自變量，試驗(yàn)設(shè)計見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗堿的含量測定結(jié)果 小檗堿對照品及功勞木藥材按照1.3.2.1項(xiàng)下色譜條件測定得到色譜圖，見圖1。以峰面積Y對小檗堿濃度X(μg/mL)進(jìn)行回歸，得到回歸方程為：Y=99.51X+450.47 (R2=0.9999)，線性范圍為：5.00～50.00 μg/mL。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計因素及水平表Tab 1 Factors and levels used in response surface design

圖1 小檗堿對照品(A)和功勞木藥材(B)的HPLC圖Fig 1 HPLC chromatograms of berberine in standard (A) and Mahonia bealei (B)

2.2 酶法輔助超聲提取功勞木中小檗堿的工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面分析及試驗(yàn)結(jié)果 超聲輔助酶法提取功勞木小檗堿的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2,對各因素進(jìn)行回歸擬合，得到二次回歸方程：

Y=-861.8588+212.2317X1+13.9836X2+15.2670X3+1.1884X4+0.3117X1X2-0.3280X1X3-0.0155X1X4-0.0858X2X3-0.0117X2X4-0.0109X3X4-28.6350X12-0.4506X22-0.1201X32-0.0024X42。

利用Design-Expert 8.0.6對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明：該模型達(dá)極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著，模型總決定系數(shù)R2=0.9841，校正決定系數(shù)RAdj2=0.9655，說明該模型擬合情況較好，可用該模型適宜用于超聲輔助酶法提取功勞木小檗堿工藝條件的優(yōu)化。通過方差分析結(jié)果中的P值可知：X2、X1X3、X2X4均對小檗堿收率的影響顯著(P<0.05)，X1、X3、X4、X12、X22、X32、X42、X2X3、X3X4均對小檗堿收率的影響極顯著(P<0.01)。通過方差分析結(jié)果中的F值可知：各因素對小檗堿收率影響的順序依次為：酶解pH值>酶解時間>酶解溫度>酶用量。

2.2.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖可直觀反映兩兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度，其坡度陡峭程度與兩兩因素交互作用對響應(yīng)值影響大小呈正比關(guān)系[12]。根據(jù)回歸方程得到兩兩因素之間交互作用對小檗堿收率影響的響應(yīng)面圖，見圖2。由圖2和方差分析結(jié)果可知，酶解pH值與酶解溫度、酶用量與酶解時間對小檗堿收率的影響達(dá)到顯著水平，而酶用量與酶解溫度、酶解溫度與酶解時間對小檗堿收率的影響達(dá)到極顯著水平。

2.2.3 最佳工藝條件驗(yàn)證 通過響應(yīng)面優(yōu)化得到酶法輔助超聲提取功勞木小檗堿的酶解最優(yōu)參數(shù)為：酶解pH值3.45、酶用量10.62 mg/g、酶解溫度50.67 ℃、酶解時間97.02 min，該條件下模型預(yù)測小檗堿的理論收率為22.64 mg/g?？紤]實(shí)際可操作性，將酶解最優(yōu)工藝參數(shù)修正為：酶解pH值3.5、酶用量10.6 mg/g、酶解溫度51 ℃、酶解時間97 min。在該修正條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到小檗堿的平均收率為22.46 mg/g，RSD=0.52%(n=3)，試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測相對誤差為0.80%，與理論值接近，表明建立的數(shù)學(xué)模型對功勞木小檗堿提取工藝具有實(shí)用價值。另取同等質(zhì)量功勞木藥材粉末6份，其中3份按照1.3.1.2回流法提取，其余3份按照1.3.1.3超聲法進(jìn)行提取。結(jié)果表明，回流法中小檗堿平均收率為17.27 mg/g，RSD=0.41%(n=3)；超聲法中小檗堿平均收率為8.24 mg/g，RSD=0.61%(n=3)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Tab 2 Experimental design and results for response surface analysis

圖2 各因素相互作用對小檗堿收率影響的響應(yīng)面Fig 2 Response surface of interaction between every two factors on extraction rate of berberine

3 討論與小結(jié)

小檗堿作為功勞木的主要有效成分，已被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床實(shí)踐中。如硫酸小檗堿注射液、鹽酸環(huán)丙沙星鹽酸小檗堿預(yù)混劑、諾氟沙星鹽酸小檗堿預(yù)混劑等常用獸藥均含有小檗堿成分。目前功勞木中小檗堿的提取主要有常規(guī)的回流提取法[10]和超聲法[11]，其他提取方法鮮有報道。超聲波是利用震動波增強(qiáng)提取溶劑對植物藥材的滲透力，從而達(dá)到高效提取的目的，同時避免高溫對植物藥材有效成分的影響。將酶法與超聲波結(jié)合，可在低溫環(huán)境下加速植物細(xì)胞內(nèi)有效成分溶出，從而使提取時間及有效成分得率得到最優(yōu)化。基于上述優(yōu)點(diǎn)，本研究采用酶法輔助超聲這一新型聯(lián)用技術(shù)提取功勞木小檗堿成分，為功勞木的資源開發(fā)利用提供參考。

單因素試驗(yàn)中，小檗堿收率隨著酶解pH值和酶解溫度的增大而增大，但當(dāng)酶解pH值3.5以上、酶解溫度50 ℃以上，小檗堿收率反而下降，可能與酶的空間結(jié)構(gòu)改變、酶失活等因素有關(guān)。小檗堿收率隨著酶用量的增加而增大，但當(dāng)酶用量11 mg/g以上，小檗堿收率反而下降，可能當(dāng)纖維素酶相對于功勞木達(dá)到飽和后繼續(xù)增加纖維素酶用量會阻礙小檗堿的溶出。小檗堿收率隨著酶解時間的延長而增大，但當(dāng)酶解時間90 min以上，小檗堿收率增加趨勢趨于平緩。

通過響應(yīng)面法及驗(yàn)證試驗(yàn)得到超聲輔助酶法提取功勞木小檗堿的酶解最佳工藝條件為：酶解pH值3.5、酶用量10.6 mg/g、酶解溫度51 ℃、酶解時間97 min。通過響應(yīng)面法得到的功勞木小檗堿超聲輔助酶法提取工藝與常規(guī)的回流法相比，小檗堿收率提高了31%，耗時僅為回流法的1/3；與常規(guī)的超聲法相比，酶解預(yù)處理步驟使功勞木中小檗堿收率提高了2.7倍。綜上所述，本研究優(yōu)選的酶法輔助超聲提取功勞木中小檗堿工藝具有提取時間短、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，為功勞木的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

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(編輯：陳希)

Optimization of Emzyme-assisted Ultrasonic Extraction Process for Berberine fromMahoniabealei

NING Na1,2, HAN Jian-jun1,2, HU Yu-li3

(1.DepartmentofPhamrmacy,TongrenVocationalandTechnicalCollege,Tongren,Guizhou554300,China; 2.EngineeringResearchCenterofVeterinaryTraditionalChineseMedicineinGuizhou,Tongren554300,China; 3.AnimalDiseasePreventionandControlCenterofChongqing,Chongqing401120,China)

To optimize emzyme-assisted ultrasonic extraction process of berberine fromMahoniabealei. Experimental factors and their levels were determined by one-factor tests. Subsequently, the Box-Behnken experimental design with 4 factors and 3 levels was performd, and the factors influencing the extraction process were estimated by means of regression analysis with the berberine yield as the response value. The optimal conditions were as follows: pH 3.5, cellulase dosage 10.6 mg/g, enzymolysis temperature 51 ℃, enzymolysis time 97 min. Under this condition, the berberine yield was up to 22.46 mg/g. The optimized extraction technique is stable and feasible, with a high extraction rate, providing reference for industrialized production ofMahoniabealei.

Mahoniabealei; berberine; cellulase; ultrasonic extraction

貴州省農(nóng)業(yè)類工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目：黔科合農(nóng)G字[2015]4001號；貴州省銅仁市科技局科研計劃項(xiàng)目：銅市科研2016(98)號 作者簡介： 寧娜，博士，副教授，從事藥用資源的開發(fā)利用工作。E-mail: ningnaok@163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.6.04

2017-03-05

A

1002-1280 (2017) 06-0027-06

S853.7