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    辣椒素對腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制探討*

    2017-07-18 12:04:41李群英何清華徐露李
    中國中醫(yī)急癥 2017年5期
    關(guān)鍵詞:辣椒素陽性細(xì)胞腦缺血

    李群英何清華徐 露李 靖

    (1.四川省遂寧市中心醫(yī)院,四川 遂寧 629000;2.重慶醫(yī)科大學(xué),重慶 400016;3.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院,重慶 401520)

    ·研究報(bào)告·

    辣椒素對腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制探討*

    李群英1何清華1徐 露2李 靖3△

    (1.四川省遂寧市中心醫(yī)院,四川 遂寧 629000;2.重慶醫(yī)科大學(xué),重慶 400016;3.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院,重慶 401520)

    目的 觀察辣椒素對腦缺血再灌注模型大鼠的影響并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法 將75只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組:空白組、模型組、辣椒素高劑量組、辣椒素中劑量組和辣椒素低劑量組,每組15只。除空白組外,線栓法建立大鼠右腦缺血再灌注模型。辣椒素高、辣椒素中和辣椒素低劑量組分別灌胃辣椒素100、50、25 mg/(kg·d),其他兩組灌胃相應(yīng)劑量的CMC-Na溶液,連續(xù)7 d。隨后進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分、干濕重法檢測大鼠腦含水量、TUNEL法測定神經(jīng)元的凋亡、Western blot法測定cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 辣椒素高、辣椒素中和辣椒素低劑量組均顯著降低了神經(jīng)功能評分、腦含水量、神經(jīng)元凋亡數(shù)量和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 辣椒素對腦缺血再灌注有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抑制cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)有關(guān)。

    腦缺血再灌注 辣椒素 cleaved Caspase-3

    腦缺血再灌注損傷是指腦缺血后發(fā)生細(xì)胞損傷,但恢復(fù)血供后損傷反而加重的現(xiàn)象。腦缺血再灌注損傷是3大致死疾病之一,其致殘致死率逐年上升,嚴(yán)重危害著公眾的健康。細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的主要機(jī)制之一,如何抑制神經(jīng)元的凋亡,是治療藥物開發(fā)的重要方向[1]。辣椒素(CAP)是辣椒中引起辣味的物質(zhì),分子式為C18H27NO3。藥理學(xué)研究證實(shí),辣椒素具有鎮(zhèn)痛、調(diào)血脂、保護(hù)胃黏膜、抗癌等作用;研究發(fā)現(xiàn),辣椒素能有效抑制缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞凋亡[2-3]。辣椒素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中能否發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用目前尚無報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)將觀察辣椒素對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年健康雄性SD大鼠75只,體質(zhì)量(250±50)g,購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,合格證編號:2007.0001,SPF級飼養(yǎng)條件。

    1.2 藥物與試劑 辣椒素購自成都曼斯特生物科技有限公司(批號20141012,純度>98%),將其溶于0.5%的CMC-Na溶液中,配制成50 mg/mL的混懸液。TUNEL試劑盒和cleaved Caspase-3抗體,購自Abcam公司。

    1.3 模型制備 根據(jù)Longa的方法,建立腦缺血再灌注大鼠模型[4]。10%水合氯醛以350 mg/kg的劑量腹腔注射用以麻醉大鼠。將麻醉后的大鼠固定于鼠板上,于頸正中切開皮膚,分離出右側(cè)頸內(nèi)動脈(ICA)與頸外動脈(ECA),于Y型分枝下3 cm處結(jié)扎ECA,于ECA上剪一“V”型小口,再將長度為20 mm的魚線經(jīng)ECA插進(jìn)ICA,深度約(18.50±0.50)mm,從而阻斷MCA血供。缺血時(shí)間為2 h,2 h后再將魚線輕輕拔出,實(shí)現(xiàn)再灌。建立好的腦缺血再灌注損傷大鼠模型經(jīng)Longa的神經(jīng)評分法評分,分?jǐn)?shù)>3分的納入實(shí)驗(yàn)[4]。

    1.4 分組與給藥 75只健康成年雄性SD大鼠,分為空白組、模型組、辣椒素高劑量組、辣椒素中劑量組和辣椒素低劑量組,每組15只??瞻捉M不進(jìn)行任何手術(shù)處理,其余各組用線栓法制備腦缺血再灌注大鼠模型。辣椒素高、中和低劑量組分別灌胃100、50和25 mg/kg的辣椒素,空白及模型組灌胃相應(yīng)劑量的CMC-Na溶液,每日1次。連續(xù)7 d。

    1.5 觀察指標(biāo) 1)神經(jīng)功能評分:各組大鼠于末次給藥后,根據(jù)Longa 5分法對神經(jīng)功能進(jìn)行評分。無神經(jīng)缺損,為0分;提鼠尾左前爪內(nèi)收,且無法伸直,為1分;行走左傾,為2分;左旋轉(zhuǎn),為3分;昏迷或無法行走,為4分。2)腦含水量檢測:腦含水量檢測方法為干濕重法,每組抽取大鼠5只。經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉,麻醉后斷頭取腦,去除嗅球、小腦與低位腦干,分離左右腦半球,迅速稱質(zhì)量,所得質(zhì)量為濕質(zhì)量。隨后放入110℃電烤箱進(jìn)行烘烤,時(shí)間為24 h,取出迅速稱質(zhì)量,所得質(zhì)量為干質(zhì)量。腦含水量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。3)TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡:每組抽取大鼠5只,用水合氯醛進(jìn)行麻醉,再仰臥固定于鼠板,在胸腹處進(jìn)行聯(lián)合切口再暴露出心臟。右心耳剪一缺口,將灌注針從心尖插入左心室,先灌入500 mL生理鹽水,沖干血液,再灌入4℃的40 g/L濃度的多聚甲醛緩沖液,固定。斷頭取腦,常規(guī)固定2 h,洗滌4 h,再梯度乙醇脫水,經(jīng)二甲苯透明后,進(jìn)行石蠟包埋,再切厚度為5 μm的切片。其余步驟嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒的說明書步驟進(jìn)行操作。光鏡下觀察,有棕黃色顆粒細(xì)胞核的細(xì)胞為陽性細(xì)胞,算作凋亡細(xì)胞。每張切片在400倍光鏡下,選取海馬CA1區(qū)獨(dú)立的4個(gè)視野區(qū),計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目,計(jì)算出TUNEL陽性細(xì)胞的平均數(shù)。4)cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測:每組隨機(jī)選取5只大鼠,提取出腦組織蛋白。先以BCA法檢測出蛋白含量,再將生理鹽水稀釋組織勻漿上清液至2000 μg/mL。加入4倍上樣緩沖液,于沸水中進(jìn)行5 min水浴,再于-40℃中儲存?zhèn)溆?。取?0 μL樣品,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,恒壓設(shè)為80 V,電泳時(shí)間為30 min,再設(shè)為120 V,至電泳結(jié)束,取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。于200 mA下轉(zhuǎn)膜1 h,再于室溫下封閉液進(jìn)行PVDF膜的封閉,過夜。剪下PVDF膜,加入1∶250cleaved Caspase-3、β-actin一抗,再在室溫下孵育1 h,TBST漂洗3次,每次為5 min。隨后加入1∶5000二抗,室溫孵育45 min。TBST漂洗3次,5 min。ECL法顯色,于暗室中曝光2 min,再顯影定影。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有顯著性。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 見表1。結(jié)果示腦缺血再灌注后,模型組及辣椒素高、中、低劑量組動物均發(fā)生明顯的神經(jīng)功能損害。與模型組相比,辣椒素高、中和低劑量組的神經(jīng)功能評分顯著降低(P<0.01)。

    表1 各組神經(jīng)功能評分及腦含水量比較(±s)

    表1 各組神經(jīng)功能評分及腦含水量比較(±s)

    與模型組比較,*P<0.01。下同。

    組 別 n 神經(jīng)功能評分(分) 腦含水量(%)空白組 15 0.0±0.0 77.62±0.18模型組 15 3.67±0.51 83.47±0.47辣椒素高劑量組 15 2.32±0.31*80.22±0.33*辣椒素中劑量組 15 2.44±0.46*80.64±0.37*辣椒素低劑量組 15 2.36±0.43*80.75±0.40*

    2.2 各組大鼠腦含水量檢測結(jié)果比較 見表1。腦含水量結(jié)果表明,腦缺血再灌注后,模型組和辣椒素高、中、低劑量組動物的腦含水量均出現(xiàn)明顯升高。與模型組相比,辣椒素高、中和低劑量組腦含水量顯著下降(P<0.01)。

    2.3 各組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞結(jié)果比較 見表2。TUNEL陽性細(xì)胞是細(xì)胞核內(nèi)黃色顆粒的細(xì)胞。結(jié)果表明,腦缺血再灌注后,模型組和辣椒素高、中、低劑量組動物的陽性細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)明顯上升,與空白組有顯著差異(P<0.05)。與模型組比較,辣椒素高、中和低劑量組陽性細(xì)胞數(shù)明顯下降(P<0.01)。

    表2 各組海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)

    表2 各組海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)

    組 別 n 陽性細(xì)胞數(shù) cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量空白組 15 1.97±0.72 0.36±0.08模型組 15 10.63±2.98 0.89±0.07辣椒素高劑量組 15 4.25±1.26*0.52±0.05*辣椒素中劑量組 15 4.03±1.20*0.55±0.04*辣椒素低劑量組 15 3.79±1.15*0.61±0.06*

    2.4 各組大鼠cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)比較見圖1,表2。Western blot結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組、辣椒素高、中和低劑量組動物的cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均出現(xiàn)明顯的升高。與模型組相比,辣椒素高、中和低劑量組cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)。

    圖1 各組大鼠cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

    3 討 論

    隨著我國人口老齡化,腦血管疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。腦缺血再灌注損傷在腦血管疾病中占有極大的比例,而目前臨床上沒有針對該損傷的有效藥物,亟需開發(fā)出新的有效藥[5]。辣椒(Capsicum annuum L.syn.c.frutescans)是屬于茄科辣椒屬植物,其主要辛辣成分為辣椒素,是含香草酰胺的生物堿[6]。目前,針對辣椒素的藥理作用已經(jīng)進(jìn)行了很多研究,已發(fā)現(xiàn)辣椒素具有治療消化性潰瘍、預(yù)防心血管疾病、治療咳嗽、感冒、抗癌等作用[7]。

    腦缺血再灌注發(fā)生后,炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、神經(jīng)興奮性毒性都會引起腦組織損傷。其中腦細(xì)胞發(fā)生的程序性死亡,即細(xì)胞凋亡,造成了一系列神經(jīng)功能障礙[8]。Caspase家族是哺乳類動物凋亡的啟動者和執(zhí)行者。在Caspase家族中,有一種關(guān)鍵的酶,叫做Caspase-3,它是最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶,是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[9-10]。前期研究表明,缺血缺氧損傷中引起神經(jīng)元凋亡的主要通路就是由Caspase參與的信號級聯(lián)反應(yīng)[11]。正常情況下,Caspase-3以酶原的形式存在,在各組水解酶的作用下,其裂解后發(fā)生活化,活化的Caspase-3通過自催化,再次裂解為cleaved Caspase-3。cleaved Caspase-3是細(xì)胞凋亡早期階段激活的關(guān)鍵蛋白酶,是目前已知的執(zhí)行凋亡的最后因子[12-14]。cleaved Caspase-3使得DNA發(fā)生結(jié)構(gòu)性斷裂,從而使得細(xì)胞發(fā)生凋亡[15-16]。

    通過建立腦缺血再灌注大鼠模型,我們發(fā)現(xiàn)辣椒素能能顯著降低神經(jīng)功能評分、腦含水量、神經(jīng)元凋亡數(shù)量和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá),說明辣椒素對腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能為通過抑制cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá),從而抑制神經(jīng)元凋亡,減輕腦損傷。

    [1] 甘照儒,桑櫟楠.腦缺血再灌注損傷級聯(lián)反應(yīng)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2009,15(1):43-45.

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    [10]Poter AG,Ianicke RU.Emerging roles of caspase-3 in apoptosis[J].Cell Death Differ,1999,6(2):99-104.

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    [15]楊柳,張敏,賀曦,等.姜黃素對大鼠慢性腦缺血誘發(fā)腦損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究[J].中國藥業(yè),2015,24(4):31-34.

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    Effect of Capsaicin on the Rat Model of Cerebral Focal Ischemia with Reperfusion and its Mechanism

    LI Qunying,HE Qinghua,XU Lu,et al.SuiNing City Central Hospital,Sichuan,Suining 629000,China.

    Objective:To study the effects of capsaicin on rats of cerebral focal ischemia with reperfusion and its mechanism.Methods:75 SD rats were randomly divided into 5 groups:control group,model group,cap high dose,cap middle dose and cap low dose group with 15 rats in each group.The suture method was used to establish the model of MCAO-reperfusion except the control group.Cap high dose,cap middle dose and cap low dose group were given 100,50 and 25 mg/kg cap for consecutive 7 days.Neurological deficit was scored,brain water content was detected with dry-wet method,neuronal apoptosis was measured with TUNEL method and level of cleaved caspase-3 were detected with western blot method.Results:Neurological deficit testing scores,brain water content,neuronal apoptosis and the level of cleaved caspase-3 decreased significantly in cap high dose,cap middle dose and cap low dose group(P<0.01)and the difference was statistically significant compared the control group.Conclusion:Capsaicin has a protective effect on the rats of cerebral focal ischemia with reperfusion,and its mechanism may be related to reducing the expression of cleaved Caspase-3 protein.

    MCAO;Capsaicin;Cleaved Caspase-3

    R285.5

    A

    1004-745X(2017)05-0797-03

    10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.013

    2017-02-07)

    重慶市科委基礎(chǔ)與前沿項(xiàng)目(cstc2016jcyA0268)

    △通信作者(電子郵箱:lijing1976@163.com)

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