羊口瘡病毒蛋白ORFV035的表達(dá)、純化和多克隆抗體的制備

陳慧芹 王小平 羅樹紅 王麗潔 陳倩倩 郝文波

（南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所，廣州 510515）

羊口瘡病毒蛋白ORFV035的表達(dá)、純化和多克隆抗體的制備

陳慧芹 王小平 羅樹紅 王麗潔 陳倩倩 郝文波

（南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所，廣州 510515）

克隆表達(dá)羊口瘡病毒蛋白ORFV035，并制備其多克隆抗體，為后續(xù)對病毒復(fù)制、裝配、形態(tài)發(fā)生和成熟過程的研究奠定基礎(chǔ)。PCR擴(kuò)增羊口瘡病毒ORFV035基因，將其與質(zhì)粒pET-30a（+）經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-035。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測序鑒定，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)情況。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行超聲破碎和Ni柱純化，純化后目的蛋白免疫小鼠，制備多克隆抗體并對其進(jìn)行鑒定。成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET30a-035，在大腸桿菌BL21中以包涵體形式高效表達(dá)。包涵體洗滌、溶解后進(jìn)行Ni柱純化，得到純度較高的ORFV035-his融合蛋白。以純化蛋白免疫小鼠獲得多克隆抗體。Western blot檢測顯示該多抗可以識(shí)別天然ORFV035蛋白。成功誘導(dǎo)表達(dá)、純化ORFV035蛋白并制備ORFV035多克隆抗體。

羊口瘡病毒；ORFV035；純化；多克隆抗體

羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）屬痘病毒科，副痘病毒屬。該病毒可引起羊傳染性膿皰病，是羊的主要疫病之一［2］。由于病毒的抵抗力強(qiáng)，羊群一旦被感染則不易清除，可持續(xù)危害羊群多年，給畜牧業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。ORFV基因組含132個(gè)基因，由末端基因區(qū)和中間核心基因區(qū)組成［4］。ORFV中間核心基因區(qū)（ORFs009-111）較保守，主要包括與病毒復(fù)制和病毒粒子裝配成熟的相關(guān)基因，與痘病毒相關(guān)基因的同源性較高［5］。ORFV035即為中間核心區(qū)的一個(gè)基因，較保守，基因全長為1 293 bp，編碼大小約48.68 kD的蛋白。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ORFV035基因與痘苗病毒（VV）I7L的基因結(jié)構(gòu)類似。在痘苗病毒中，I7L編碼核心半胱氨酸蛋白水解酶，主要識(shí)別核心蛋白前體P25K和P4b的A-G-A位點(diǎn)，是核心蛋白的成熟，病毒組成和感染子代所必須的。羊口瘡病毒的ORFV035是否同樣編碼半胱氨酸蛋白水解酶，發(fā)揮與痘苗病毒I7L基因類似的功能，尚有待進(jìn)一步研究［6］。

本研究通過PCR擴(kuò)增獲取了ORFV035的基因片段，將其克隆入pET-30a（+）中。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得與His融合表達(dá)的ORFV035蛋白，純化后免疫小鼠制備多克隆抗體，旨為進(jìn)一步研究035蛋白在ORFV感染過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質(zhì)粒及菌株 ORFV NA1/11病毒株及其基因組DNA和質(zhì)粒pET-30a（+）由本室保存；TOP10感受態(tài)細(xì)胞和大腸桿菌BL21（DE3）pLys購自TIANGEN公司。

1.1.2 試劑 PrimeStar Max DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、DNA Marker、T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA片段凝膠純化回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；LB培養(yǎng)基，酶切緩沖液10× K buffer，TAE緩沖液購自寶生物工程（大連）有限公司；SDS-PAGE電泳緩沖液，SDS樣品緩沖液，考馬斯亮藍(lán)R-250染色液，考馬斯亮藍(lán)脫色液，異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì) 利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORFV035基因的特異性引物，在上、下游引物中分別引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。引物序列如下：Forward primer：（BamH Ⅰ）5'GCGGATCCATG GACAAGTACACGGATTTAGTGG 3'；Reverse primer：（Hind Ⅲ）5' ATAAGCTTTTCATGGCGCCGCCGGCTT CTCGGG 3'。引物送華大基因公司合成。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 以O(shè)RFV NA1/11基因組為模板，建立 50 μL PCR 反應(yīng)體系：PrimeStar Mix 25 μL、病毒 DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 21 μL、DMSO 1 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸15 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并切膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將回收的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pET-30a（+）分別進(jìn)行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，膠回收后用T4 DNA連接酶4℃反應(yīng)過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞?？敲顾睾Y選陽性重組克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并送華大基因有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析 測序正確的重組質(zhì)粒pET30a-035及空質(zhì)粒pET-30a（+）分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。分別挑單個(gè)菌落接種于1 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)2 h；按1∶1 000的比例將菌液加到對應(yīng)的含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)3 h至OD≈0.6；收集未誘導(dǎo)的菌液作為陰性對照，余下菌液按1∶500加誘導(dǎo)劑IPTG使終濃度為0.2 mmol/L，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)4 h。10% SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。相同條件對小量表達(dá)成功的陽性重組菌進(jìn)行大量表達(dá)，收集誘導(dǎo)后樣品。冰浴中超聲破碎菌體。裂解后的菌液分別收集超聲上清和沉淀，10% SDS-PAGE分析重組蛋白的可溶性。

1.2.5 包涵體溶解 大量誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，用1× PBS重懸，并加入溶菌酶，-80℃反復(fù)凍融3次。1∶ 1 000加入100 mmol/L PMSF，冰上超聲破碎菌體，4℃高速離心收集包涵體沉淀。用包涵體洗滌液重懸沉淀，攪拌2 h，12 000 r/min，4℃條件下離心30 min，棄上清繼續(xù)重懸沉淀，共洗滌包涵體3次。用40 mL×2的1% NLS（十二烷基肌氨酸鈉）徹底重懸沉淀［7］，4℃震蕩3 d，12 000 r/min，4℃，60 min離心收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析鑒定。

1.2.6 Ni柱親和層析純化 采用鎳柱親和層析法純化包涵體蛋白［8］。將1% NLS溶解的融合蛋白用0.22 μmol/L濾膜過濾，過平衡好的鎳柱，再用含1% NLS的Binding Buffer平衡，采用0.1 mol/L、0.25 mol/L、0.5 mol/L咪唑的Elution Buffer進(jìn)行洗脫，并分別收集流穿液和洗脫液［9］。10% SDS-PAGE電泳分析蛋白純化情況［10］。

1.2.7 ORFV035抗血清的制備及鑒定 純化的pET30a-035融合蛋白與弗氏佐劑以1∶1（V/V）的比例進(jìn)行乳化后對小鼠的頸部、背部皮下多點(diǎn)注射。首次免疫采用弗氏完全佐劑，抗原劑量為80 μg/只；之后每隔1周，加強(qiáng)免疫一次，抗原劑量不變，佐劑為弗氏不完全佐劑，加強(qiáng)免疫3次。第3次免疫后3 d斷尾采集少量血，分離血清測定效價(jià)。待效價(jià)符合要求后，再加強(qiáng)免疫一次，3 d后眼球采血，靜置后4℃離心后取上清液，-80℃保存?zhèn)溆?。Western blot分析制備的ORFV035抗血清的特異性。用感染復(fù)數(shù)（MOI）為3的野生株病毒感染OFTu細(xì)胞，未感染病毒的細(xì)胞作為陰性對照，感染后24 h裂解細(xì)胞，加入含β-巰基乙醇的2× loading buffer煮樣，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用全濕法電轉(zhuǎn)移到0.22 μmol/L PVDF膜。以制備的ORFV035多抗為一抗（1∶2 000），HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增ORFV035基因

PCR擴(kuò)增ORFV035基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳鑒定，獲得了與預(yù)期大?。? 293 bp）相符的特異性片段，見圖1。

圖1 ORFV035基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒pET30a-035的構(gòu)建與鑒定

PCR產(chǎn)物回收后與質(zhì)粒pET30a（+）雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET30a-035。重組質(zhì)粒pET30a-035用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定，除載體片段外，還出現(xiàn)了約1 293 bp的條帶，其大小與預(yù)期相符（圖2）。選取陽性克隆送華大基因有限公司進(jìn)行DNA測序，結(jié)果與NA1/11株ORFV035基因完全一致。

圖2 重組質(zhì)粒ORFV-035的雙酶切鑒定

2.3 重組蛋白的表達(dá)與鑒定

重組質(zhì)粒pET30a-035在大腸桿菌BL21中小量誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，與對應(yīng)空載體pET-30a的菌液相比，重組質(zhì)粒pET30a-035的誘導(dǎo)菌在大小40-55 kD間出現(xiàn)一條較粗的蛋白條帶。而未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌均沒有出現(xiàn)相同的條帶（圖3）。擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集細(xì)菌，經(jīng)超聲破碎及離心分離沉淀和上清，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果（圖4）顯示重組蛋白主要存在于沉淀中，表明蛋白表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。

圖3 SDS-PAGE分析pET30a-035的誘導(dǎo)表達(dá)

圖4 SDS-PAGE分析pET30a-035融合蛋白的可溶性

2.4 包涵體的溶解與純化

將洗滌過的包涵體用1% NLS溶解，離心后收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果（圖5）顯示重組蛋白主要存在于上清中，表明重組表達(dá)的包涵體蛋白溶解效果較佳。

圖5 pET30a-035 1% NLS溶解效果的檢測

溶解后的包涵體蛋白過鎳柱親和純化，SDSPAGE電泳結(jié)果（圖6）顯示，洗脫獲得的目的蛋白相比誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白和流穿液中的目的蛋白雜帶明顯減少，達(dá)到預(yù)期純化效果。

2.5 多克隆抗體的制備與鑒定

以純化的重組ORFV035免疫小鼠，制備了鼠抗ORFV035多克隆抗血清。效價(jià)測定顯示該多抗血清效價(jià)達(dá)1∶20 000以上。Western blot分析（圖7）顯示ORFV多抗能識(shí)別病毒感染OFTu細(xì)胞組約48 kD的特異性條帶，而正常OFTu細(xì)胞組未見到此大小條帶，表明該多抗能夠識(shí)別天然ORFV035蛋白，可用于后期該蛋白的功能研究。

圖6 pET30a-035純化效果SDS-PAGE檢測

圖7 Western blot檢測天然ORFV035蛋白

3 討論

羊口瘡病毒的ORFV035與痘苗病毒的I7L同源性高。在早期和晚期的病毒裝配中，I7L編碼的病毒蛋白酶與病毒包膜和核心蛋白在特異性位點(diǎn)AG/X斷裂相關(guān)［11］，也參與到了體內(nèi)三大核心蛋白的水解（P4a、P4b和P25K）［12］?？梢哉f，I7L編碼的半胱氨酸蛋白酶和其他基因產(chǎn)物負(fù)責(zé)病毒核心蛋白水解酶（vCPP）的活動(dòng)［13］。ORFV035預(yù)測功能與I7L相似，推斷在ORFV病毒裝配中也是需要其作為核心蛋白水解酶來水解核心蛋白以達(dá)到形成有感染性子代的目的。研究該蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的酶學(xué)和輔助因子的需求，有可能促進(jìn)抗病毒藥物的發(fā)展［14］。而對ORFV035的結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究都需要有效表達(dá)該蛋白并制備其特異性抗體。

本實(shí)驗(yàn)中，為獲得滿足免疫原用量需求的ORFV035蛋白大量表達(dá)，選用大腸桿菌作為表達(dá)體系。因?yàn)槿狈φ婧说鞍仔揎楏w系，二硫鍵的錯(cuò)配加大了蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊的可能性，表達(dá)產(chǎn)物主要為包涵體形式。實(shí)驗(yàn)中嘗試了多種誘導(dǎo)條件，包括18℃的低溫表達(dá)等，結(jié)果依然為包涵體表達(dá)。而配對正確的二硫鍵是形成正確蛋白構(gòu)象的前提，所以要想獲得具有生物活性的蛋白必須經(jīng)過包涵體的變性和復(fù)性，打斷錯(cuò)配的二硫鍵并重新配對。我們對包涵體蛋白的溶解條件也做了多次摸索，采用常規(guī)的尿素溶解方法，濃度達(dá)到8 mol/L尿素溶解效果仍不佳。后采用1% NLS（十二烷基肌氨酸鈉），終于獲得較好包涵體蛋白溶解效果。包涵體溶解后純化的蛋白作為免疫原免疫小鼠，也獲得了效價(jià)好、能特異性識(shí)別天然ORFV035的多克隆抗血清。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-035，并在大腸桿菌BL21中以包涵體形式高效表達(dá)。包涵體經(jīng)變性、復(fù)性、純化后獲得的ORFV035融合蛋白具有較好的免疫原性，免疫小鼠獲得了效價(jià)好、能特異性識(shí)別天然ORFV035的多克隆抗體。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Expression and Purification of orf Virus Protein ORFV035 and Preparation of Polyclonal Antibody

CHEN Hui-qin WANG Xiao-ping LUO Shu-hong WANG Li-jie CHEN Qian-qian HAO Wen-bo
（Institute of Antibody Engineering，School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou 510515）

This work aims to express and purify recombinant orf virus encoded protein 035（ORFV035）in Escherichia coli and prepare a polyclonal antibody（pAb）against ORFV035 for immunoassays，as well as lay foundation for the further researches on the replication，assembly，morphogenesis，and mature process . The gene of ORFV035 was amplified by PCR from orf viral genome，and sub-cloned into the expression vector pET-30a（+），and recombinant plasmid pET-30a-035 was constructed by enzymatic digestion and ligation of BamH I and Hind III. Then the plasmid pET-30a-035 after double enzyme digestion and sequencing was transformed into Escherichia coli BL21，the transformants were induced by IPTG，and SDS-PAGE was used to identify the expression of the protein. The His-tagged fusion protein ORFV035 was ultrasonic-treated and then purified through Ni-chelating affinity chromatography. The purified ORFV035 was used to immune into BALB/c mouse for producing anti-ORFV035 pAb. The results showed that the recombinant plasmids pET30a-035 was successfully constructed，and the protein ORFV035 in E. coli BL21 was in inclusion body. The ORFV035-his fusion protein was obtained after washing，dissolving，and purifying the inclusion body，and the pAb anti-ORFV035 was prepared. The Western blot analysis showed that this pAb recognized natural ORFV035.

orf virus；ORFV035；purification；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1182

2017-01-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31672536，31170147）

陳慧芹，女，碩士，研究方向：羊口瘡病毒ORFV119蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制；E-mail：595235420@qq.com

郝文波，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：病原體與宿主相互作用；E-mail：haowa@126.com