環(huán)狀RNA的研究進展

張瀠月馬月輝趙倩君

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

環(huán)狀RNA的研究進展

張瀠月1馬月輝2趙倩君1

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

環(huán)狀RNA（Circular RNA，circRNA）是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），主要由前體RNA（pre-mRNA）通過可變剪切加工產(chǎn)生，circRNA廣泛存在于所有真核生物中，并且非常穩(wěn)定。目前，circRNA的研究已經(jīng)成為了RNA研究領(lǐng)域的新熱點，研究發(fā)現(xiàn)circRNA在轉(zhuǎn)錄本中占有相當(dāng)大的比例，有的表達豐度甚至顯著高于其他轉(zhuǎn)錄本。同時，circRNA對基因的表達有重要調(diào)控作用，在生物的發(fā)育進程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能，如充當(dāng)miRNA海綿、作為內(nèi)源性RNA以及生物標(biāo)記物，在疾病的診斷與治療中也發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)circRNA在一些疾病的發(fā)生中扮演了重要角色，包括動脈硬化、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、糖尿病和癌癥的發(fā)生。綜述了circRNA的研究進展，闡述了circRNA的研究歷史、circRNA的特點、形成過程、表達情況、circRNA與疾病間的關(guān)系以及circRNA的功能，并討論了circRNA的研究意義及存在的問題。

環(huán)狀RNA；非編碼RNA；可變剪切；RNA測序；生物功能；表達機制

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）呈閉合環(huán)狀，是一類不具有5'末端帽子和3'末端尾巴的特殊內(nèi)源性非編碼RNA，主要由外顯子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物組成，是目前RNA研究領(lǐng)域的新熱點。circRNA普遍存在于人、鼠、線蟲、獼猴、果蠅、槍棘魚等各類動物體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)circRNA在轉(zhuǎn)錄本中實際上所占比例相當(dāng)大，一些基因的circRNA表達量至少是其線性轉(zhuǎn)錄本的10倍［1］。近年來的研究 顯示，circRNA在生物的發(fā)育進程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能，同時對于基因表達也具有重要調(diào)控作用，包括對其親本基因及與之結(jié)合miRNA的靶基因調(diào)控。環(huán)狀RNA在生物體內(nèi)非常穩(wěn)定，在疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中也扮演著重要角色，這使circRNA的研究具有重大意義。雖然對circRNA的研究起步較晚，但該研究方向發(fā)展非常迅速。

1 環(huán)狀RNA的特征

目前已鑒定的circRNA主要有以下特征：（1）circRNA存在于多種真核生物中，在同種生物的不同組織中也廣泛存在［2-9］。它們在人體細胞中廣泛表達，有些circRNA的表達水平甚至超過其線性異構(gòu)體10倍之多［1，10］；（2）多數(shù)具有高度保守序列［1，10］，僅少數(shù)在進化上不保守［11］；（3）大多數(shù)定位于細胞質(zhì)中，少數(shù)定位于細胞核內(nèi)［11］；（4）多由一個或多個外顯子形成，少數(shù)來源于內(nèi)含子或內(nèi)含子片段；（5）大部分是非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）；（6）circRNA呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不具有像線性RNA的5'和3'游離末端，不易被RNA核糖核酸酶R（Ribonuclease R，RNase R）分解，與線性RNA相比更穩(wěn)定［11］。環(huán)狀RNA的半衰期一般超過48 h，可利用RNase R消化其他RNA，提純circRNA［12］。因此RNase R的處理對circRNA起富集作用，并成為判定RNA是否成環(huán)的一個重要條件。有研究懷疑有少部分circRNA對RNase R敏感［13］，還有待證實；（7）部分circRNA擁有miRNA應(yīng)答元件（miRNA response element，MRE），具有 miRNA sponge功能，與miRNA相互作用，調(diào)控靶基因的表達［14］；（8）大多數(shù)circRNA能在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，少數(shù)能在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用。

2 環(huán)狀RNA的發(fā)現(xiàn)

1976年，Sanger等［2］利用電鏡首先在植物感染的類病毒（Viroids）中發(fā)現(xiàn)了這些以共價鍵形成的閉合環(huán)狀單鏈RNA分子，它們具有高度的熱穩(wěn)定性。1990年，首次在真菌細胞中發(fā)現(xiàn)其蹤跡，Matsumoto等［3］在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)20S RNA沒有自由的5'端和3'端，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，這也是呈環(huán)形的RNA分子。隨后發(fā)現(xiàn)從腫瘤抑制基因DCC、人Ets-1基因以及小鼠Sry基因中轉(zhuǎn)錄而來的環(huán)狀RNA［4-7］。盡管在真核細胞中早已發(fā)現(xiàn)了circRNA的存在，但卻被視為一種由外顯子轉(zhuǎn)錄本發(fā)生剪接錯誤而未能引起科學(xué)家的關(guān)注［15］。

隨著RNA測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)的發(fā)展及生物信息技術(shù)的更新和完善，為研究circRNA提供了有力手段，使生物學(xué)家們累積了大量的RNA序列數(shù)據(jù)，其中一些來自無尾巴的RNA，于是circRNA的研究被帶回到了前沿，成為研究的新熱點［1］。近年來，科學(xué)家們陸續(xù)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了大量內(nèi)源性、保守且穩(wěn)定的circRNA，在動物（人、小鼠、果蠅、線蟲、斑馬魚等）、植物（擬南芥）、真菌（釀酒酵母等）、原生生物（瘧原蟲等）中的circRNA存在明顯的差異［9］。2012年，Danan等［8］在古細菌中發(fā)現(xiàn)circRNA大量存在并具有一定的生物學(xué)功能，且具有很高的保守性。

3 環(huán)狀RNA的形成

circRNA通常由一個以上外顯子構(gòu)成，簡單來說就是以“頭對尾”的方式，由前體RNA（pre-mRNA）通過特殊的選擇性剪切產(chǎn)生［16］，并大量存在于真核細胞的細胞質(zhì)中。與一般線性RNA的經(jīng)典剪切方式不同，circRNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成方式是多樣的［14］?；诖罅康腞NA序列數(shù)據(jù)累積及后期生物信息分析、試驗分析驗證，學(xué)者發(fā)現(xiàn)circRNA形成包括套索驅(qū)動環(huán)化、內(nèi)含子驅(qū)動環(huán)化、內(nèi)含子自身環(huán)化以及由RBP引起的類似內(nèi)含子自身環(huán)化4種方式。

2013年，Jeck等［1］提出了circRNA發(fā)生的兩種模型：套索驅(qū)動的環(huán)化（Lariat-driven circularization）和內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化（Intron-nairing-driven circularization）。套索驅(qū)動的環(huán)化與線性pre-mRNA的正向剪接相反，是指在可變剪切過程中，外顯子跳躍（Exon skipping），前體RNA（Pre-mRNA）的下游外顯子SD的3'剪接供體（Spice donor）連接到上游外顯子SA的5'剪接受體（Spice acceptor），形成套索結(jié)構(gòu)，套索結(jié)構(gòu)拉近了剪切位點，隨后切除內(nèi)含子，促進了序列成環(huán)。環(huán)化外顯子RNA（Circular exonic RNA）主要存在于細胞質(zhì)中，由前體RNA（pre-mRNA）索尾插接產(chǎn)生［17］。第二個模型是內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化，即依賴pre-mRNA中臨近的兩個內(nèi)含子反向互補配對序列堿基配對形成環(huán)狀套索，拉近剪切位點，進而切除內(nèi)含子，促進序列成環(huán)。它們生成的第一步是不同的：套索驅(qū)動的環(huán)化由外顯子組成的剪接供體和剪接受體共價結(jié)合，而內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化則由兩個內(nèi)含子互補配對結(jié)合，從而形成環(huán)化結(jié)構(gòu)。在接下來的步驟中，這兩種模型的過程基本一致，即剪接體（Splicesome）切除剩余內(nèi)含子形成circRNA。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，反向重復(fù)序列Alu（IRAlu）對外顯子剪接和環(huán)狀RNA的形成起重要作用［17-25］。

有研究在人源胚胎干細胞H9中發(fā)現(xiàn)了近萬條環(huán)形RNA［17］，并首次證明了內(nèi)含子RNA互補序列介導(dǎo)的外顯子環(huán)化，證實外顯子環(huán)化依賴于兩側(cè)的內(nèi)含子互補序列，為內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化模型提供了有利證據(jù)；還發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域間內(nèi)含子互補序列的競爭性配對，可以選擇性的產(chǎn)生線性RNA或是環(huán)形RNA。同時，在人類基因組內(nèi)含子蘊含著大量的互補序列，這些互補序列的選擇配對及其動態(tài)調(diào)控使得同一個基因可產(chǎn)生多個環(huán)形RNA，這種現(xiàn)象可被稱為可變環(huán)化（Elternative circularization）；有研究通過對大量circRNA的兩端序列進行研究，發(fā)現(xiàn)circRNA的生成依賴5'端剪切位點的7 bp和3'端剪切位點的11 bp核心保守序列，揭示了內(nèi)含子也是circRNA來源之一［11］。

內(nèi)含子環(huán)化是指內(nèi)含子獨立環(huán)化形成環(huán)狀內(nèi)含子RNA（Circular intronic RNA，ciRNA），其主要存在于某些組織的細胞核中，含有臨近5'剪接位點的7個核苷酸C富集元件，具有少量的miRNA靶點［11］。Li等［26］發(fā)現(xiàn)外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA（Exon-intron circRNA or EIciRNA），即在環(huán)化外顯子中間保留有內(nèi)含子，但其發(fā)生機制尚未明確。

另外，RNA結(jié)合蛋白（RBPs）也調(diào)節(jié)了環(huán)狀RNA的形成，研究發(fā)現(xiàn)，在人類上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中存在數(shù)以百計的circRNA，并且這些circRNA中超過1/3受到選擇性剪切因子QKI的動態(tài)調(diào)節(jié)。其對circRNA豐度的影響是基于內(nèi)含子區(qū)QKI的結(jié)合位點。而且，增加QKI的結(jié)合位點能夠有效促進轉(zhuǎn)錄物中circRNA的形成，說明circRNA的合成受到一些細胞特異性機制的調(diào)節(jié)，揭示了在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中circRNA具有特異性的生物功能［23，27］。

4 環(huán)狀RNA的表達

研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)上認為只表達mRNA和lncRNA的基因同時也廣泛表達環(huán)狀RNA。這種基因表達的特點最初是在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)的，但分子生物學(xué)家很快發(fā)現(xiàn)其在所有真核生物中普遍存在。circRNA的表達豐度及其剪接異構(gòu)體的表達都具有細胞特異性，其表達量可能高于傳統(tǒng)的線性mRNA或lncRNA。circRNA在大腦中表達豐富且豐度隨著胎兒發(fā)育增加?？傊@些特性形成了circRNA順式和反式作用及其功能調(diào)控的基本問題［28］。2012年，Salzaman等［10］首次證實在人體細胞的基因表達程序中，環(huán)形RNA分子而非線性RNA分子是一個更普遍的特征。他們應(yīng)用一種新生物信息分析方法對15種不同類型細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了分析發(fā)現(xiàn)，circRNA在果蠅中廣泛存在，circRNA表達、circRNA基因線性轉(zhuǎn)錄本、剪切模式均呈細胞類型特異性。研究證實circRNA不僅僅普遍存在于各類生物，在同一生物體內(nèi)不同部位也廣泛分布；它們通常還具有組織或發(fā)育階段的表達特異性［29，30］。Abdelmohsen等［31］通過不同年齡段的獼猴骨骼肌的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了12 000個cirRNA，其中部分為高表達cirRNA；并分析了特定cirRNA在不同年齡組別呈特異分布，推測cirRNA與肌肉生長發(fā)育及衰老有關(guān)。針對豬不同發(fā)育段階（胚胎21 d、42 d、60 d、80 d和100 d）腦不同部位（前腦、皮質(zhì)層、腦干、海馬區(qū)、腦干、基地神經(jīng)節(jié)）的circRNA測序研究發(fā)現(xiàn)腦部circRNA表達呈動態(tài)模式，胚胎60 d時4 634個特異性circRNA高表達，與人、小鼠腦circRNA具有一定的保守性［32］。2013年，Memczak等［16］通過對人、小鼠和線蟲進行測序發(fā)現(xiàn)存在上萬種穩(wěn)定表達的circRNA，這些circRNA具有組織特異性及發(fā)育階段特異性；通過比對發(fā)現(xiàn)一個新的人的circRNA，為小腦變性相關(guān)蛋白2反義轉(zhuǎn)錄本CDR1as，具有63個與miR-7保守結(jié)合位點；在神經(jīng)組織中CDR1as可與miR-7結(jié)合。在斑馬魚中，人CDR1as表達可破壞中腦發(fā)育，且CDR1as與miR-7的結(jié)合能力比其他轉(zhuǎn)錄本高達10倍?！禖ell》子刊報道了哺乳動物大腦circRNA詳盡的表達譜，德國學(xué)者對人、小鼠和果蠅在對腦部不同區(qū)域、原代神經(jīng)元、神經(jīng)突觸的circRNA測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)上數(shù)千種circRNA，其廣泛分布且表達豐度高；circRNA神經(jīng)元分化時表達上調(diào)，且與RNA編輯酶ADAR1表達呈負相關(guān)；敲低ADAR1可導(dǎo)致circRNA表達升高［33］。Rajewsky［34］實驗室建立circRNA專用數(shù)據(jù)庫（http://circrna.org/），該數(shù)據(jù)收錄了人類、小鼠、線蟲及果蠅等circRNA信息及最新的circRNA研究成果。2016年，Dong等［35］在人類睪丸來源的精液血漿中發(fā)現(xiàn)大量全新的環(huán)狀RNA，共鑒定到15 996種circRNA，其中10 792種為首次發(fā)現(xiàn)和報道的，這些circRNA對應(yīng)的基因主要參與精子發(fā)生，精子運動和受精作用（表1）。

表1 近年來circRNAs鑒定研究部分代表性研究成果

5 環(huán)狀RNA的功能及其與疾病間關(guān)系

circRNA的生成過程決定了它對基因表達的巨大影響，進而影響了機體的發(fā)育和功能。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)circRNA在轉(zhuǎn)錄后水平具有很多重要的調(diào)控功能，包括circRNA調(diào)控可變剪切、作為ceRNA發(fā)揮miRNA海綿功能、可以與RNA結(jié)合蛋白（RBPs）及核糖核蛋白復(fù)合體（Ribonucleoprotein complex）結(jié)合，以避免這些因子發(fā)揮作用。Hansen等［30，37］發(fā)現(xiàn)miR-671能夠負調(diào)控小腦變性相關(guān)蛋白1（Cerebellar degeneration-related protein，CDR1），miR-671具有介導(dǎo)CDR1環(huán)化反義轉(zhuǎn)錄本的作用。研究人員利用全基因組分析方法和circRNA重演方法發(fā)現(xiàn)外顯子環(huán)化與側(cè)翼內(nèi)含子互補序列有著密切關(guān)系，外顯子環(huán)化受到側(cè)翼內(nèi)含子之間及內(nèi)含子內(nèi)部的RNA配對的競爭影響。RNA選擇性配對能夠?qū)е乱粋€基因選擇性的環(huán)化，從而可以產(chǎn)生多種circRNA轉(zhuǎn)錄本。該研究聚焦了內(nèi)含子的互補序列可以介導(dǎo)外顯子環(huán)化，生成的不同circRNA進一步增加了哺乳動物轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的復(fù)雜性［17］。還有研究表明，大腦中circRNA分子以高水平生成，并且許多來自具有重要功能的基因，說明環(huán)狀RNA在腦功能中發(fā)揮了重要作用。同時最近的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在老齡化的小鼠大腦中富集，而線性RNA分子變化不明顯，說明circRNA的富集行為不依賴所對應(yīng)的線性RNA。另外，腦circRNA能影響和調(diào)節(jié)突觸功能［23，38］。近期，有研究發(fā)現(xiàn)circPVT1具有抑制細胞衰老的作用，circPVT1可以競爭性結(jié)合let-7，抑制let-7調(diào)控的下游基因，包括IGF2BP1，KRAS和HMGA2最終抑制衰老進程［39］，另外circPVT1競爭性結(jié)合miR-125家族而影響細胞增殖指標(biāo)，最終促進了胃癌細胞增殖。circPVT1Genes雜志上發(fā)表的一項研究發(fā)現(xiàn)AD病人ciRS-7缺失導(dǎo)致miR-7活性不受調(diào)控，并最終導(dǎo)致泛素連接酶UBE2A的缺失［40］。

在研究circRNA結(jié)構(gòu)和功能的同時，研究人員還發(fā)現(xiàn)它們在動脈粥硬化、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、阮病毒疾病、糖尿病、腫瘤和癌癥等疾病發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用［23，41-48］。circRNA在結(jié)腸直腸癌（CRC）和胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）中表現(xiàn)出異常表達，并被用作一些疾病的診斷或預(yù)測性生物標(biāo)志物。通過研究circRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)circRNA可能與皮膚基底細胞癌的分子發(fā)病機制有關(guān)［49］。circRNA在皮膚鱗狀細胞癌（cSCC）中有差異表達且在腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用，主要通過miRNA結(jié)合元件（MRES）互補序列干擾cSCC相關(guān)miRNA作用，進行表觀遺傳學(xué)調(diào)控［50］。circRNA表達譜綜合分析顯示hsa_circ_0005075是一個新的環(huán)狀RNA生物標(biāo)記物，是一個潛在的肝癌標(biāo)志物，參與肝癌的發(fā)展［51］。還有報道顯示，外泌體中circRNA可能作為腫瘤標(biāo)志物，circ-KLDHC10在結(jié)腸癌中作為標(biāo)志物［52］。因此對circRNA進行研究具有重要的臨床意義：circRNA獨具的競爭性內(nèi)源（ceRNA）特征可為藥物開發(fā)提供新的思路；circRNA的組織特異性和穩(wěn)定性有可能使circRNA成為一種良好的生物標(biāo)志物；circRNA的研究為生命的進化提供新的研究方向［46］?？梢灶A(yù)見，在不久的將來它能夠在各種疾病的預(yù)防、診斷、治療中發(fā)揮非常重要的作用［53］。

6 結(jié)語

circRNA的研究還剛剛興起，但其重要性引起了國際上學(xué)者的高度重視，并逐漸揭開circRNA的面紗。circRNA的廣泛性，保守性及組織特異性等特質(zhì)，都預(yù)示著它可能成為一種新型的生物標(biāo)志物。circRNA參與了生物的生長發(fā)育、衰老、疾病等多種生命活動過程，在轉(zhuǎn)錄后水平具有調(diào)控基因表達的重要功能。對circRNA進行研究具有重要意義：circRNA獨具的競爭性內(nèi)源（ceRNA）特征可為藥物開發(fā)提供新的思路；circRNA的組織特異性和穩(wěn)定性有可能使circRNA成為一種良好的生物標(biāo)志物；circRNA的研究為生命的進化提供新的研究方向。目前在畜禽上關(guān)于circRNA鑒定及功能研究報道寥寥無幾。circRNA的世界仍有許多未知等待我們?nèi)ヌ剿?。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步，相信在未來幾年，會有大量的circRNA及其功能在疾病、動植物中的表達與生物學(xué)作用被研究者發(fā)現(xiàn)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Study Progress on Circular RNA

ZHANG Ying-yue1MA Yue-hui2ZHAO Qian-jun1
（Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

Circular RNA（circRNA）is a novel class of endogenous non-coding RNAs（ncRNA）with closed loop structure and is formed by alternative splicing from a precursor RNA（pre-mRNA）. Prior studies have discovered that circRNA widely and very stably exists in all eukaryotes. At present，the research of circRNA has become a new hotspot in the field of RNA research. It is found that circRNA accounts for a large proportion in transcripts，and some of the expressions are even higher than other transcripts. CircRNA plays a regulating role in gene expression，and an essential role in the process of biological development，such as miRNA sponges，endogenous RNAs and biomarkers，as well as critical role in the diagnosis and treatment of diseases. Some studies have revealed that circRNAs play key roles in the development of some diseases，including atherosclerosis，nerve system disorders，diabetes and cancers. In this paper，we review the research progress of circular RNA，including the characteristics of circRNA，the formation process，the expression，the relationship between circRNA and disease，as well as the function of circRNA. Moreover，we discuss the significance and existing problems in studying circRNA.

circRNA；non-coding RNA；alternative splicing；RNA sequencing；biological function；expression mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0009

2017-01-16

國家自然科學(xué)基金項目（31201765），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS01）

張瀠月，女，碩士研究生，主要從事動物遺傳資源分子評價；E-mail：305856679@qq.com

趙倩君，副研究員，研究方向：動物種質(zhì)資源；E-mail：zhaoqianjun@caas.cn