紫背天葵總黃酮分離純化工藝的研究

李巧云，洪小谷

（1.閩南師范大學(xué)成人教育學(xué)院，福建漳州 363000；2.漳州市環(huán)境監(jiān)測(cè)站，福建漳州 363000）

紫背天葵（Begonia fimbristipula），學(xué)名紫背菜，又稱紅鳳菜，此菜口感鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有充足的維生素群和礦物質(zhì)，經(jīng)常食用具有中醫(yī)食療保健的神奇療效，可清熱解毒、消炎消腫、止咳潤(rùn)燥[1]，近年來還發(fā)現(xiàn)其組成成分中含有具有生物活性的可以抗腫瘤以及惡性細(xì)胞增長(zhǎng)的黃酮類化合物[2]，能夠延緩衰老。目前提取和分離純化黃酮類化合物的工藝很多，AB-8 大孔樹脂具有良好的吸附性能，解吸方便，能夠避免無機(jī)物的影響，可循環(huán)再生使用，作為一種新型的分離技術(shù)[3-8]目前已被廣泛用于銀杏等多種植物黃酮類化合物的分離提純中，但在紫背天葵總黃酮的提取中還鮮見報(bào)道。通過研究靜態(tài)吸附中吸附的時(shí)間，樣液的pH 以及溶劑的體積分?jǐn)?shù)和溫度，解吸附中乙醇的體積分?jǐn)?shù)等單因素試驗(yàn)，得出大孔吸附樹脂對(duì)紫背天葵總黃酮的最佳分離純化條件；同時(shí)研究大孔樹脂對(duì)總黃酮樣液的解吸曲線，掌握黃酮類化合物的吸收區(qū)段，從而為將來對(duì)紫背天葵中黃酮的組分進(jìn)行性質(zhì)鑒定提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

紫背天葵：本地產(chǎn)，采自于漳州師范學(xué)院植物園內(nèi)；

主要試劑：亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純AR；蘆丁對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；AB-8 大孔吸附樹脂。

1.2 試驗(yàn)儀器

HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋、85-2 型恒溫磁力攪拌器：江蘇金壇江南儀器廠；752P 型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器；HH-4 型電動(dòng)粉碎機(jī)：天津泰斯特；SHB-III 型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科技；R307型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海生申科技；BSZ-100 型自動(dòng)部分收集器：鄭州南北儀器；BSⅡOS 型電子分析天平：賽多利斯；DHG-9053A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海成順；KH-100SP 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山超聲儀器；100-1000 ul/1-5 ml 微量可調(diào)單道移液器：芬蘭雷柏。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

紫背天葵全草洗凈，于80 ℃烘干，將已經(jīng)干燥的紫背天葵放入電動(dòng)粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，過40 目篩，得到干燥粉末。

2.2 紫背天葵黃酮類化合物提取方法

精確稱取10 g 的紫背天葵樣品粉末置于圓底燒瓶中，用300 mL 的70%乙醇溶液在60 ℃的水浴中浸提2 h，趁熱抽濾。依法多做3 次以制備更多的黃酮粗提液，合并濾液。將得到的濾液在65 ℃下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，所得到的濃縮液用70%乙醇定容至200 mL，得到紫背天葵黃酮類化合物粗提液。冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 紫背天葵黃酮類化合物測(cè)定方法

2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)品80 mg，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇微熱溶解，冷卻后轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中并定容至刻度，充分搖勻，得到0.8 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %NaNO22.0 mL，搖勻、放置6 min 后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 %AlNO32.0 mL，搖勻，放置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH 20 mL，最后加70%乙醇定容至刻度，充分搖勻，放置15 min，以空白試劑做參比液，用分光光度計(jì)在510 nm 處測(cè)定吸光度[20]，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。

2.3.2 總黃酮類化合物含量的測(cè)定

精密吸取粗提液5.0 mL，置于50 mL 容量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO22.0 mL，搖勻、放置6 min 后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%AlNO32.0 mL，搖勻，放置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH 20 mL，最后加70%乙醇定容至刻度，充分搖勻，放置15 min，以空白試劑做參比液，用分光光度計(jì)在510 nm 處測(cè)定吸光度[3]，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線所得回歸方程計(jì)算濃度，再根據(jù)公式（1）計(jì)算紫背天葵總黃酮的提取率[4]。

式中：C 為黃酮類化合物的質(zhì)量濃度，（mg/mL）；V1為原提取液體積，mL；D 為提取液稀釋的倍數(shù)（實(shí)驗(yàn)中D=125）；M 為提取用的紫背天葵粉末的質(zhì)量，g。C 可依據(jù)所測(cè)溶液的吸光度值A(chǔ)510，代入回歸方程算出其值。

2.4 大孔吸附樹脂的預(yù)處理及其性能指標(biāo)測(cè)定

2.4.1 樹脂預(yù)處理

稱取一定量的AB-8 大孔吸附樹脂，先用95%的乙醇浸泡24 h，然后用乙醇洗脫，收集部分洗出液，加水檢驗(yàn)，當(dāng)洗出液在加水時(shí)無白色混濁現(xiàn)象時(shí)可停止乙醇洗滌，接著用去離子水將大孔樹脂的乙醇洗盡，加入5%鹽酸，浸泡3 h，再用去離子水將大孔樹脂清洗，直至中性時(shí)停止，加入5 %氫氧化鈉溶液，浸泡3 h，同法洗至中性停止，過濾，注意盡量將去離子水濾干，預(yù)處理完畢。將處理好的大孔吸附樹脂至于真空泵內(nèi)抽氣，備用[5]。

2.4.2 靜態(tài)吸附率的測(cè)定

稱取已經(jīng)預(yù)處理完畢的大孔吸附樹脂2 g，置于100 mL 三角燒瓶中，接著加入30 mL 樣品粗提溶液，放置臺(tái)式恒溫振蕩器中，室溫下振蕩24 h，待其充分吸附后，過濾，按照2.3.2 方法，測(cè)定過濾后的濾液中總黃酮的濃度[6]，并根據(jù)下列公式（2）測(cè)定靜態(tài)吸附率。

式中：C1為吸附濃度，（mg/mL）；C2為吸附后剩余液濃度，（mg/mL）。

2.4.3 解靜態(tài)吸附的測(cè)定[7]

在靜態(tài)吸附的飽和大孔樹脂中，加入50 mL 95%乙醇溶液，放置臺(tái)式恒溫振蕩器中，室溫下振蕩24 h，待其充分解吸附后，過濾，按照2.3.2 方法，測(cè)定過濾后的濾液中總黃酮的濃度。并根據(jù)公式（3）計(jì)算洗脫率。

2.5 分離參數(shù)優(yōu)化研究

2.5.1 樹脂分離實(shí)驗(yàn)操作

稱取AB-8 大孔吸附樹脂100 g，用95%乙醇濕法裝柱，將樹脂全部裝入層析柱（40 mm×30 cm）中，接著準(zhǔn)確量取10 mL 紫背天葵黃酮粗提液，將提取液用大孔吸附樹脂的交換柱吸附，等待其完全吸附后用去離子水洗脫，接著再用95%的乙醇解吸，利用自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集，注意控制流速，每管收集3 mL 為宜，并將試管編號(hào)，按照以上步驟收集后，分別吸取1 mL 收集液，并測(cè)量它們的吸光度值。根據(jù)所測(cè)得的數(shù)據(jù)制作AB-8 大孔吸附樹脂柱層析的色譜圖，通過該圖譜我們還可以分析出紫背天葵中黃酮類物質(zhì)的種類。

2.5.2 單因素試驗(yàn)

分別改變靜態(tài)吸附的條件，即在其他條件不變的情況下，分別改變吸附的時(shí)間、樣液的pH 以及吸附時(shí)的溫度[8]，按照上述2.4.2 中的方法對(duì)紫背天葵中黃酮類化合物進(jìn)行吸附，考察它們對(duì)吸附效果的影響。得到最佳工藝參數(shù)，并根據(jù)公式（3），確定最優(yōu)洗脫率。

2.5.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響黃酮類化合物吸附效果的3 個(gè)因素，選取A：樣液的pH（5.0、6.0、7.0）、B：吸附溫度（20、25、30 ℃）、C：吸附時(shí)間（4、8、12 h）進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factor and level of orthogonal experiment

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品粗提液總黃酮的含量

根據(jù)試驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=10.782x+0.011 4（r2=0.998 5）計(jì)算樣品液濃度，結(jié)果在510 nm 下測(cè)得紫背天葵總黃酮粗提液的吸光度值為y=0.212，經(jīng)計(jì)算可得粗提液濃度x=0.018 65 mg/mL，所得的200 mL粗提液中黃酮的總濃度為0.932 4 mg/mL，相對(duì)紫背天葵樣品粉末黃酮含量為0.47%。

3.2 靜態(tài)吸附率的測(cè)定

根據(jù)試驗(yàn)2.4.2 及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算，濾液中黃酮類化合物的吸光度值y2=0.107，可計(jì)算吸附后黃酮的濃度C2=0.008 9 mg/mL，代入公式（2），可得出樣品溶液的吸附率為52.2%。

3.3 靜態(tài)解吸附的洗脫率

根據(jù)3.2 所得的結(jié)果以及2.4.3 的步驟，將充分解吸后所得的黃酮類化合物的吸光度值y=0.077 代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，經(jīng)換算成洗脫液黃酮的含量為0.006 1 mg/mL，代入公式（3），可得出樣品溶液的洗脫率為62.7%。

3.4 紫背天葵總黃酮的動(dòng)態(tài)研究以及動(dòng)態(tài)曲線

按照試驗(yàn)2.5.1 所述方法進(jìn)行試驗(yàn)，收集共39 支試管的解吸液，分別取1 mL 測(cè)定它們的吸光度值，在作出AB-8 柱層析的色譜圖，見圖1。

圖1 AB-8 柱層析色譜圖Fig.1 AB-8 column chromatography chromatograms

由圖1 可以看出，經(jīng)過AB-8 大孔樹脂吸附黃酮類化合物所得出的色譜分析圖只出現(xiàn)了一個(gè)吸收峰，這說明紫背天葵中黃酮的種類大致相同，故為將來進(jìn)一步鑒定紫背天葵黃酮的性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，無需再分開收集紫背天葵中的黃酮類物質(zhì)。

3.5 不同因素對(duì)紫背天葵總黃酮純化影響的研究

根據(jù)試驗(yàn)2.5.2 所述方法分別改變靜態(tài)吸附的條件，即在其他條件不變的情況下，分別改變吸附的時(shí)間、樣液的pH 以及吸附時(shí)的溫度，對(duì)紫背天葵中黃酮類化合物進(jìn)行吸附，考察它們對(duì)吸附效果的影響。得到最佳工藝參數(shù)。

3.5.1 吸附時(shí)間

在不改變樣液pH 和吸附溫度的情況下考察時(shí)間對(duì)吸附率的影響，考察1 h～10 h 內(nèi)所收集的各樣液的吸光度值，并制作出時(shí)間-吸光度值關(guān)系曲線，得到結(jié)果如圖2。

圖2 吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響Fig.2 Effect of aborsobing time on the absorbing capacity

由圖2 可以看出，在一定的時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值逐漸降低，說明黃酮被AB-8 大孔樹脂吸附之后濃度逐漸開始降低，樹脂的吸附率增加，但是到達(dá)一定的時(shí)間之后，吸附率就穩(wěn)定在一個(gè)狀態(tài)中不再增加，這是因?yàn)榇罂讟渲奈搅恳掩呌陲柡?，在這種情況下樹脂將不再吸附，吸附率就不再變化了。因此，我們可以認(rèn)為AB-8 大孔吸附樹脂吸附紫背天葵總黃酮的最佳時(shí)間應(yīng)控制在7 h～8 h。

3.5.2 原料液pH 對(duì)吸附率的影響

原樣液的pH 為6.3，我們用5 %的氫氧化鈉和1 mol/L的鹽酸將樣液的pH 分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0各30 mL，然后分別加入2 g AB-8 大孔吸附樹脂。置于震蕩器上24 h，過濾得到濾液，測(cè)定濾液中黃酮的吸光度值，并制作出pH 與吸光度值的關(guān)系曲線，得到結(jié)果見圖3。

由圖3 可以看出，樣液的pH 為6 的時(shí)候，吸附效果是最好的，這是因?yàn)楦鶕?jù)大孔樹脂的吸附原理，吸附過程中吸附介質(zhì)以分子狀態(tài)被吸附，保持好吸附介質(zhì)的分子狀態(tài)是保證良好吸附效果的基礎(chǔ)。在一般情況下，溶液為酸性時(shí)，吸附效果最好，但這個(gè)酸度僅限于弱酸，酸性太強(qiáng)時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致吸附物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化。

圖3 pH 對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of pH on the absorbing capacity

3.5.3 溫度對(duì)吸附量的影響

分別取原樣液30 mL 4 份，加入AB-8 大孔吸附樹脂2 g，在pH 保持6.3 的情況下置于恒溫震蕩器上振蕩24 h，溫度分別設(shè)置為20、25、30、35 ℃，24 h 后過濾出濾液，測(cè)定濾液中黃酮的吸光度值，并制作出溫度與吸光度值的關(guān)系曲線，得到結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對(duì)吸附率的影響Fig.4 Effect of temperature on the absorbing capacity

從圖4 我們看出，當(dāng)溫度在25 ℃時(shí)，大孔吸附樹脂吸附紫背天葵總黃酮的吸附量比其他3 個(gè)溫度的吸附量更高，且溫度適中，基本能夠保證黃酮的性質(zhì)不因溫度因素而發(fā)生變化，在實(shí)驗(yàn)中25 ℃接近室溫容易控制，故我們可以將AB-8 大孔吸附樹脂吸附紫背天葵總黃酮的溫度確定在25 ℃[8]。

3.6 紫背天葵總黃酮純化最佳工藝的研究

紫背天葵總黃酮純化最佳工藝的研究見表2。

由表2 結(jié)果可知，RB＜RA＜RC，即條件B（吸附溫度）對(duì)紫背天葵黃酮類化合物吸附效果的影響最大，A（pH）其次，影響最弱的是C（吸附時(shí)間）。因此可下結(jié)論，當(dāng)A2B2C3的情況下，即pH 為6，吸附溫度25 ℃、吸附時(shí)間12 h 時(shí)，AB-8 大孔樹脂紫對(duì)背天葵總黃酮的吸附率較高。但是由于單因素試驗(yàn)時(shí)，吸附時(shí)間8 h 和12 h 吸附效果差別不大，而正交實(shí)驗(yàn)表明吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響也最弱，為了節(jié)約時(shí)間和資源能效，我們還是將pH 為6，吸附溫度25 ℃、吸附時(shí)間8 h 確定為最佳純化的工藝條件。

表2 吸附條件的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

4 結(jié)論

1）采用AB-8 大孔吸附樹脂分離純化紫背天葵總黃酮，單因素試驗(yàn)研究了吸附時(shí)間、上樣液pH 以及吸附溫度對(duì)其吸附率的影響。單因素試驗(yàn)表明最適分離條件為：吸附時(shí)間7 h～8 h、樣液pH 6 和溫度25 ℃。

2）通過正交試驗(yàn)分析，確定分離純化紫背天葵總黃酮最佳工藝參數(shù)為：吸附時(shí)間8 h，樣液pH6，溫度25 ℃。在此條件下，樣品溶液吸附率為52.2%，洗脫率為62.7%。

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