離子交換色譜法分離純化胸腺肽α1的工藝研究

劉妍妍，劉茗飛，高薇，張麗萍

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.吉林大學生物與農業(yè)工程學院，吉林長春 130022）

離子交換色譜法分離純化胸腺肽α1的工藝研究

劉妍妍1，2，劉茗飛1，高薇1，張麗萍1，2

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.吉林大學生物與農業(yè)工程學院，吉林長春 130022）

摘 要：通過對胸腺肽α1的分離純化，提高胸腺肽α1的純度，確定簡單可行的純化工藝技術。將QAE Sephadex A-25和D208、D301、717等陰離子交換介質進行靜態(tài)吸附實驗，確定最適離子交換介質；通過L9（33）正交試驗對流速、填料高度及進樣濃度進行優(yōu)化，確定最佳分離條件。以QAE Sephadex A-25作為填料介質吸附胸腺肽α1，在流速60 cm/h，填料高度50 cm，進樣濃度8 mg/mL條件下，胸腺肽α1純化效果理想，經HPLC測定，得到純度達24.596 6 mg/mL的胸腺肽α1，質量分數達12.03%，比市場上銷售的胸腺肽中Tα1含量（質量分數0.6%～1.0%）高出近10倍。

關鍵詞：胸腺肽α1，離子交換色譜，分離純化

胸腺肽是胸腺組織上皮細胞分泌的分子量在10 000 u以下的多肽激素[1]，是一種重要的生物反應調節(jié)劑。它廣泛地存在于脊椎動物的組織中，例如牛、豬、羊、鼠以及人類，在它們的胸腺、脾、心臟、肝臟中分布，其中要屬胸腺中含量最高[2]。胸腺肽中活性最高的多肽為胸腺肽α1（thymosin α1）又簡稱Tα1，具有較高的免疫增強活性，同時還具有刺激血管內皮細胞遷移、促進血管生成和傷口愈合等作用，已用于乙型肝炎、丙型肝炎、惡性腫瘤以及免疫缺陷疾病等的臨床治療和研究中[3]。

目前，獲得高純度胸腺肽α1可以利用生物提取法、基因工程法、化學合成法三種途徑進行生產，其中基因工程法具有高效表達的技術難題，尚處在實驗室研究階段；化學合成法具有成本昂貴、污染環(huán)境等弊端；利用動物組織提取天然胸腺肽α1價格合理，無環(huán)境污染，臨床應用安全[4]。本實驗采用QAE Sephadex A-25對超聲波輔助提取的胸腺肽進行分離純化，以期可以摸索出一套分離純化胸腺肽α1的工藝技術，為今后工業(yè)化生產胸腺肽α1提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胸腺肽α1粗品：由黑龍江八一農墾大學食品學院實驗室提供[5]；乙腈：HPLC Grade.DIMA TECHNOLOGY INC；三氟乙酸：HPLC Grade，天津市科密歐化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲（Tris）：Ultrapure Grade，Chem Base；QAE Sephadex A-25：超細型，瑞典 Pharmacia公司；陰離子交換樹脂（D 301； 717；D208，大慶精化樹脂廠）；鹽酸（AR）：沈陽華東試劑廠；乙酸（AR）：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；氫氧化鈉（AR）：沈陽新興試劑廠；Tα1標準品（邁普新，生產批號081002，純度10%，四川成都地奧九泓制藥廠）。

TH梯度混合器：上海精科實業(yè)有限公司；DYY-10C電泳儀：北京市六一儀器廠；WD-9405B水平搖床：沃德生物醫(yī)學儀器分公司；Ф1.6 cm×20 cm、Ф1.6 cm×50 cm、Ф1.6 cm×30 cm Z型層析柱：上海精科實業(yè)有限公司；TU-1800紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；PB-10 Sartorius普及型pH計：德國賽多利斯股份公司；PC-2025 HPLC System（Lab Alliance）；250 mm×4.6 mm C18硅膠柱（Lab Instrument CO.LTD）。

1.2 方法

1.2.1 電導率的測定

采用電導計按照文獻[6]中附錄3規(guī)范操作直接測定。

1.2.2 吸附量的計算

吸附量的計算公式：

吸附劑對胸腺肽α1吸附量（mg/mL）=（吸附前胸腺肽α1含量/mg-吸附后胸腺肽α1含量/mg）/離子交換劑體積/mL

1.2.3 HPLC檢測

從各個洗脫峰中吸取20 μL進行HPLC測定。根據《ZGB2003-001胸腺肽溶液質量標準》規(guī)定，采用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatogram，HPLC）法確定胸腺肽α1的含量。

柱子類型：C18硅膠柱，300 A；

流動相A：體積分數為0.1%的三氟乙酸（TFA）；

流動相B：體積分數為0.1%的TFA和90%乙腈；

洗脫梯度：10%～30%流動相B；洗脫時間：50 min；流速：1 mL/min；檢測波長：214 nm。

1.2.4 胸腺肽α1標準曲線的繪制

取胸腺肽α1標準品，用超純水分別配制成質量濃度為 0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0 mg/mL 的 5 種標準溶液，在給定的色譜條件下，分別進樣20 μL進行HPLC檢測。每份平行進樣3次，取其平均值。以胸腺肽α1的峰面積值Y對質量濃度X/（g/L）繪制胸腺肽α1標準曲線，建立相應的回歸方程，并應用此方程進行實驗中胸腺肽 α1的測定[7]。

1.2.5 陰離子交換介質的選擇研究

實驗中分別選擇QAE-Sephadex A-25以及陰離子交換樹脂D208、D301、717作為分離純化胸腺肽α1的離子交換介質，通過實驗選出最合適的離子交換介質。

1.2.6 洗脫方式的選擇

1.2.6.1 階躍式洗脫

實驗采用 pH7.0，20 mmol/L Tris·HCl/10 mmol/L NaCl溶液、20 mmol/L Tris·HCl/30 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris·HCl/50 mmol/L NaCl溶液三種梯度濃度溶液進行洗脫，將所收集的洗脫峰進行含量的測定。

1.2.6.2 梯度洗脫

實驗采用 20 mmol/L Tris·HCl，pH7.0，0～50 mmol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，將所收集的洗脫峰進行含量的測定。

1.2.7 流速的優(yōu)化研究

實驗選用內徑為1.6 mm、柱高為30 cm的層析柱，設定 20、40、60、80、100、120、140、160 cm/h 等 8 個流速水平，根據不同流速下離子交換介質對原料液吸附程度的不同，檢測穿透曲線出現時流出液的OD值，采用Sigma Plot9.0作圖軟件對所得數據進行繪圖，根據圖像即可選出合適的流速。

1.2.8 填料高度的優(yōu)化研究

實驗選取的層析柱內徑為1.6 cm，將填料高度分別設定在 10、20、30、40、50 cm 5 個水平，設定流速在80 cm/h，找出填料高度與多肽吸附程度之間的關系。

1.2.9 正交試驗

試驗選取流速（cm/h）、填料高度（cm）、以及進樣濃度（mg/mL）3個因素作為考察對象，采用L9（33）正交試驗表，進行正交試驗。

2 結果與分析

2.1 胸腺肽α1標準曲線

2.1.1 胸腺肽α1標準品高效液相色譜圖

經高效液相色譜檢測，得到濃度為1.6 mg/mL的Tα1標準品的HPLC圖譜，見圖 1；胸腺肽α1標準品的保留時間為3.003 min，峰面積為91 069。

圖1 胸腺肽α1標準品高效液相圖譜Fig.1 Chromatogram of Tα1standard sample

2.1.2 胸腺肽α1標準曲線的建立

胸腺肽α1的峰值Y對胸腺肽α1標準品的濃度X（mg/mL）的標準曲線如圖2。

圖2 胸腺肽α1標準曲線Fig.2 Standard curve of Tα1

2.2 陰離子交換劑的初步篩選結果

通過公式計算得出陰離子交換劑QAE-Sephadex A-25以及陰離子交換樹脂D208、D301、717對胸腺肽α1的靜態(tài)吸附量見表1。

表1 陰離子交換劑靜態(tài)吸附量Table 1 Results of weak anion gel static absorption

QAE Sephadex A-25凝膠吸附量最大，因此選擇QAE Sephadex A-25凝膠介質為分離介質，并可將717陰離子交換樹脂作為工業(yè)化分離的備選介質。

2.3 洗脫方式的確定

階躍式洗脫結果見圖3所示。

由圖3可以看出，經過陰離子交換色譜分離的胸腺肽含有約23個吸收峰，這與胸腺肽資料中敘述的幾十種多肽吻合，但其中4、5、6三個吸收峰沒有明顯分開。

圖3 QAE Sephadex A-25梯度洗脫曲線Fig.3 The gradient elution curve of QAE Sephadex A-25

梯度洗脫結果見圖4。

圖4 QAE Sephadex A-25階躍式洗脫曲線Fig.4 The step elution curve of QAE Sephadex A-25

從圖4中梯度式洗脫層析圖譜可了解到，在30 mmol/LNaCl離子強度洗脫下，共洗脫出19個色譜峰，其中4、5、6三個吸收峰初步洗脫分開，從而確定階躍式洗脫方式將優(yōu)于梯度洗脫方式。同時，從層析圖譜中可以了解到胸腺肽粗品中直接分離出胸腺肽α1是有一定困難的，因此，將等電點沉淀所得樣品進行陰離子交換色譜分析，以期能夠得到比較純的胸腺肽α1。

2.4 流速的優(yōu)化結果

通過實驗得到洗脫速度與出現穿透峰后流出液中蛋白濃度的關系如圖5所示。

圖5 流速與交換后溶液蛋白濃度的關系Fig.5 The relationship between velocity and absorpted

由圖5可以看出，當流速在100 cm/h以下時，洗脫后的穿透液OD值比較低并且也比較穩(wěn)定，這說明樣品在流速為100 cm/h以下時得到了充分的吸附；當流速大于120 cm/h時，穿透液的OD值大幅度增加，這說明樣品中的多肽在流速高于120 cm/h時沒有得到充分吸收，造成樣品大量浪費。因此，實驗選擇流速低于100 cm/h。

同時，流速降低會導致洗脫峰面積增大，半峰寬變大，出現拖尾現象，所以流速也不可以過低，實驗選擇高于30 cm/h。

2.5 填料高度的優(yōu)化

在流速為80 cm/h時，填料高度與蛋白吸附程度的關系見圖6所示。

圖6 80 cm/h時填料高度與OD220nm之間的關系Fig.6 The relationship between column length and OD220nm at 80 cm/L

由圖6可以了解到，層析柱在流速為80 cm/h的條件下，隨著填料高度的升高OD值逐漸下降，即樣品中的多肽吸收的越來越充分；同時，OD值在50 cm的填料高度時并不穩(wěn)定，說明在此流速下層析柱的填料高度仍要加高，僅50 cm是不能滿足要求的，即在此流速下進行離子交換層析是不可取的。

那么確定流速為50 cm/h條件下，對填料高度與OD值的關系重新進行分析，結果見圖7所示。

圖7 50 cm/h時填料高度與OD220nm之間的關系Fig.7 The relationship between column length and OD220nmat 50 cm/h

由圖7可知，當層析柱流速在50 cm/h時，隨著填料高度的增加OD值在下降，說明樣品中的多肽吸附的越來越充分；在填料高度達到30 cm時，OD值變化趨于穩(wěn)定，說明在此時離子交換劑對樣品吸附的比較充分，所以，在流速為50 cm/h時，可確定填料高度為30 cm。

2.6 正交試驗結果

正交試驗結果，見表2。

表2 L9（33）正交試驗結果Table 2 Factors and Levels of Orthogonal experiment

對正交實驗評定指標中的胸腺肽α1含量進行極差分析，結果見表3。

表3 胸腺肽α1含量的極差分析Table 3 Variance analysis of Tα1

由表3中的R值的結果看出，因素A的R值最大，其次是B和C，D的R值最小。極差越大，反映該因素水平變動時，總指標變化越大，即該因素越重要。因此，影響胸腺肽α1含量的因素主次順序為：A＞B＞C，即流速＞填料高度＞進樣濃度。

對正交試驗評定指標中的胸腺肽α1含量進行方差分析，結果見表4。

表4方差分析結果顯示，此模型F值為20.31，Pr（0.0477）＜0.05，模型的 R-Square為 0.9838，說明此模型具有意義；實驗中3種因素對胸腺肽α1含量的影響程度各不相同，因素A（流速）的F值=54.33，Pr（0.018 1）＜0.05，說明在α=0.05時，因素A對胸腺肽α1含量的影響達到顯著水平，因素B、C對胸腺肽α1含量的影響不顯著。

表4 正交試驗方差分析表Table 4 ANOAN（analysis of variance）of items of regression equation on Tα1

將各因素對胸腺肽α1含量的影響趨勢作直觀圖，見圖8。

圖8 影響胸腺肽α1含量的效應曲線Fig.8 Effect curve of Tα1

由圖8選擇最佳工藝條件為A2B3C3組合，即流速確定為60 cm/h，填料高度為50 cm，進樣濃度為8 mg/mL來采用QAE Sephadex A-25凝膠分離純化胸腺肽α1。

2.7 驗證實驗

按照優(yōu)化的陰離子交換色譜對等胸腺肽α1粗品進行分離純化，實驗結果，見圖9。

圖9 QAE Sephadex A-25等電點沉淀的洗脫曲線Fig.9 The elution curve of isoelectric precipitation in QAE Sephadex A-25

由圖9可知，胸腺肽粗品經過等電點沉淀后，于QAE Sephadex A-25凝膠中同樣采用階躍式洗脫分離出3個洗脫峰，說明等電點沉淀除去大量的雜多肽，優(yōu)化了胸腺肽α1的分離純化工藝。

2.8 HPLC檢測結果與分析

于各個洗脫峰吸取20 μL進行HPLC測定，測定方法參見2.7.7洗脫峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的HPLC色譜圖分別見圖10、圖11和圖12。

圖10 洗脫峰I的高效液相色譜圖Fig.10 Chromatogranm for the sample of eluting peak I

圖11 洗脫峰ⅡⅢ的高效液相色譜圖Fig.11 Chromatogranm for the sample of eluting peakⅡ

圖12 洗脫峰Ⅲ的高效液相色譜圖Fig.12 Chromatogranm for the sample of eluting peakⅢ

洗脫峰Ⅰ的保留時間為2.816 min，峰面積為1 399 778，其胸腺肽α1含量高達24.596 6mg/mL，遠遠高出市場上所銷售的胸腺肽中Tα1含量（0.6%～1.0%）。

洗脫峰Ⅱ中Tα1的保留時間為3.093 min，峰面積為365 076，含量約為6.417 9 mg/mL。

洗脫峰Ⅲ中Tα1的保留時間為3.128 min，峰面積為207 480，含量約為3.649 0 mg/mL；由以上情況可以了解到，采用優(yōu)化的陰離子交換色譜對Tα1進行分離純化，效果較好，出現三個洗脫峰，經測定，洗脫峰Ⅰ中Tα1的含量達到24.596 6 mg/mL。

3 結論

采用QAE Sephadex A-25陰離子交換介質，pH 7.0、20 mmol/LTris·HCl緩沖液作為離子交換色譜的結合緩沖液（A 液），20 mmol/LTris·HCl，0～50 mmol/LNaCl作為洗脫緩沖液（B液）進行階躍式洗脫，流速60 cm/h，填料高度50cm，進樣濃度8mg/mL對胸腺肽α1純化，可以達到純度為24.596 mg/mL的胸腺肽α1制品。

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[1]沙瑩,潘爵南.新型免疫調節(jié)劑——胸腺肽α1[J].中國藥業(yè),2001,10(11):80-81

[2]Naylor PH,Friedman-Kien A,Hersh E,et al.Thymosin alpha 1 and thymosin beta 4 in serum:comparison of normal,cord.homosexual and AIDS serum[J].Int J Immunopharmacol,1986,8(7):667-676

[3]曹穎瑛.胸腺素α1的研究進展[J].國外醫(yī)學免疫學分冊,1999,22(1):10-11

[4]秦琦.胸腺肽的生產工藝和質量標準的建立[D].長春:吉林大學,2008

[5]劉茗飛,張麗萍.超聲波法提取胸腺肽的各影響因素分析[J].農產品加工,2008(5):4-8

[6]朱厚礎.蛋白質純化與鑒定實驗指南[M].北京:科學出版社,2000:247

[7]趙思明.食品科學與工程中的計算機應用[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:47-54

Studies on the Isolation and Purification of Thymosin α1by Ion-exchange Chromatography

LIU Yan-yan1，2， LIU Ming-fei1， GAO Wei1， ZHANG Li-ping1，2
（1.Department of Food Science， HLJ Bayi Agriculture University， Daqing 163319， Heilongjiang， China；2.Biological and Agricultural Engineering College， Changchun 130022， Jinlin，China）

Abstract：Through purifying thymosin α1and improve the purity of thymosin α1 in order to research a simple and feasible purification technology.The study chooses QAE Sephadex A-25 and D208，D301，717 ect.for static IV adsorption experiment through the anion exchange chromatography in order to determine the optimumion exchange media； The optimal experiment conditions of the eluent， eluting style， flow rate，height of media are studied and chooseL9（33）orthogonal experiment on optimizing the conditions of the velocity， height and the concentration.The study choosesHPLC and SDS-PAGE to identifying the thymosin α1. The experiment showed that theQAE Sephadex A-25 as a fillermedia adsorbing thymosin α1makes the best effect， the velocity is 60 cm/h， packing height is 50 cm，the concentration is 8 mg/mL，then the purification results is satisfactory.Determined by the HPLC，the purity of thymosin α1is 24.596 6 mg/mL， the mass percent is 12.03%.The method is accurate and feasible.The purity of thymosinα1is 10 times higher than the commercial thymosin α1 products （themass percent is 0.6%to 1.0%）.

Key words：Thymosin α1； ion-exchange chromatography； isolation and purification

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.12.006

黑龍江省科技攻關項目（NOGB 06B0403-3）

劉妍妍（1979—），女（漢），講師，碩士，研究方向：畜產品加工。

2012-09-10