發(fā)酵型飲料酒中生物胺研究進展

李志軍，欒同青，鐘其頂，孟鎮(zhèn)，熊正河

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；2.全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100027）

生物胺是一類含氮低分子量堿性有機化合物，存在于多種食物中，尤其是發(fā)酵香腸、葡萄酒、啤酒和黃酒等發(fā)酵加工食品[1]。生物胺是生成荷爾蒙、核酸、蛋白質(zhì)等重要生命成分的前體物質(zhì)，其中腐胺、精胺、亞精胺和尸胺等是生物活性細胞必不可少的組成部分，在調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成及生物膜穩(wěn)定性方面起著重要作用[2]；同時，腐胺和尸胺是生成致癌物質(zhì)和亞硝基化合物的前體物質(zhì)[3-4]，組胺、酪胺等會引起頭痛和消化問題，當(dāng)人體攝入過量的生物胺時，就會引起諸如頭痛、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的還會危及生命。

生物胺中以組胺對人體健康危害最大[5]。人體內(nèi)存在單胺氧化酶，可分解體內(nèi)生物胺，而酒精會抑制單胺氧化酶的活性[6]，從而提高人體對生物胺的敏感性，降低了組胺產(chǎn)生危害作用的劑量，因此，發(fā)酵型飲料酒中生物胺安全性尤其是組胺限量問題受到高度重視。部分國家已制定了嚴(yán)格的葡萄酒中組胺限量：如澳大利亞、匈牙利和瑞士不得高于10 mg/L，法國不得高于8 mg/L，比利時不得高于5 mg/L～6 mg/L，荷蘭不高于3 mg/L，德國不得高于2 mg/L[7-8]。

1 發(fā)酵型飲料酒中生物胺研究

1.1 葡萄酒中生物胺研究進展

Bauza 等[9]研究表明，釀酒葡萄的果皮和果肉中存在腐胺等生物胺，當(dāng)將葡萄果皮、果肉同時壓榨發(fā)酵葡萄酒時，葡萄中存在的腐胺等生物胺會部分地進入葡萄酒中。酒精發(fā)酵結(jié)束之后，幾乎所有紅葡萄酒和部分白葡萄酒都需要進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）。在MLF 中，如果含有攜帶氨基酸脫羧酶基因的乳酸菌，那么這種乳酸菌不僅能夠分解蘋果酸，而且還可以作用于酒中的氨基酸使其脫羧形成生物胺[10-14]。若葡萄酒在酒精發(fā)酵結(jié)束后與酵母酒腳一起貯存，酵母自溶釋放的游離氨基酸能夠被具有氨基酸脫羧酶基因的微生物水解和脫羧，因此帶酒腳貯存的葡萄酒中生物胺的含量通常會較高[13，15]?？梢姡咸丫浦械纳锇分饕獊碜栽?、釀造過程和貯存過程。

研究[2，16-19]表明，葡萄酒中含有苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺等生物胺，其中組胺、酪胺和腐胺為葡萄酒中主要的生物胺，在經(jīng)過MLF 后，這三種生物胺比其他生物胺的含量明顯要高。其他生物胺，如苯乙胺和尸胺，在釀酒過程中有所降解[1]。表1為部分國家葡萄酒中生物胺的種類及含量水平。

表1 部分國家葡萄酒中生物胺種類及含量水平Table 1 The content of biogenic amines in wine in some countries

目前，針對葡萄酒中生物胺，主要通過接種無氨基酸脫羧酶活性的菌株進行MLF[13-20]和及時終止MLF等措施降低葡萄酒中的生物胺[15]。

1.2 啤酒中生物胺的研究進展

根據(jù)啤酒中生物胺的來源，可將它們分為3 類：第一類來自原料，如麥芽中含有鯡精胺、腐胺、精胺和亞精胺等，酒花中含有酪胺、2-苯乙胺和多元胺等生物胺；第二類產(chǎn)生于糖化過程，如酪胺、鯡精胺和尸胺等；第三類在發(fā)酵過程中產(chǎn)生，如酪胺和色胺等。研究表明[21-23]，啤酒中的生物胺與原料質(zhì)量、釀造工藝等密切相關(guān)。

表2 部分國家啤酒中生物胺種類及含量水平Table 2 The content of biogenic amines in beer in some countries

研究[2，16，22-27]顯示，啤酒中存在苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、胍丁胺、丙胺、吡哆胺和色胺等多種生物胺，其中酪胺和尸胺的含量較高。表2 為部分國家啤酒中的生物胺種類及含量水平。

表3 三種釀造酒中生物胺的種類及含量水平Table 3 The content of biogenic amines in three fermented alcohoblic beverages

研究表明，加強衛(wèi)生管理和在發(fā)酵過程中添加適量的抑制劑等措施也可以達到降低啤酒中生物胺含量的目的[20-29]。也有研究者[28]提出對麥汁中的氨基酸進行限量可以降低啤酒中生物胺的含量。

1.3 黃酒中生物胺研究進展

由于黃酒的釀造地區(qū)和發(fā)酵方法存在差異，所以不同黃酒中生物胺的種類有很大不同，黃酒中發(fā)現(xiàn)的生物胺主要有尸胺、腐胺、組胺、酪胺、精胺、亞精胺、苯乙胺、羥苯乙醇胺和色胺等[6、30-31]。陸永梅等[6]對中國4個黃酒產(chǎn)區(qū)的14 種黃酒進行了檢測。結(jié)果顯示黃酒中含有組胺、尸胺、酪胺、精胺和亞精胺等5 種生物胺，其含量比其他釀造酒（啤酒和葡萄酒）明顯偏高。葡萄酒、啤酒和黃酒中的生物胺種類及含量水平見表3。

黃酒中生物胺含量明顯高于啤酒和葡萄酒的原因可能主要是黃酒中的氨基酸含量明顯高于其他釀造酒，這為生物胺的形成提供了大量的前體物質(zhì)。黃酒中含有豐富的氨基酸，它與黃酒質(zhì)量和風(fēng)味密切相關(guān)。黃酒中的氨基酸，一是來自原料（包括米漿水）、糖化發(fā)酵劑等配料中的蛋白質(zhì)分解；二是來自酵母、霉菌等微生物自溶等。據(jù)研究者對黃酒中氨基酸的分析測定表明：黃酒中含有21 種氨基酸，其中4 種是未知氨基酸，8 種是人體必需的氨基酸[32]。表4 比較了三種釀造酒中氨基酸的含量水平。相關(guān)報道。

表4 釀造酒中氨基酸的含量水平Table 4 The content of amion acids in fermented alcohoblic beverages

黃酒釀造是一個開放式的過程，容易感染雜菌，特別是在制作的酒曲里微生物種類繁雜，易感染具有氨基酸脫羧酶活性的微生物，其次，在煎酒過程中若沒有做到完全滅菌，可能會在貯存期間形成生物胺，降低黃酒品質(zhì)，可能會對消費者健康帶來潛在危害。目前尚無對黃酒中生物胺控制措施研究的

2 發(fā)酵型飲料酒中生物胺檢測方法的研究

目前，生物胺的檢測方法主要有反相高效液相色譜（RP-HPLC）法[6-7，19，25，30，33-41]，毛細管電泳（CE）[42]法，離子色譜（IC）法[43]，薄層色譜（TLC）法[44]，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法[45]，生物傳感器（Biosensor）法[46]和氣質(zhì)聯(lián)用色譜（GC-MS）法[47-48]等，其中，以RPHPLC 法最為常用。

RP-HPLC 具有分析速度快、檢測靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確的特點，是目前發(fā)酵型飲料酒中生物胺含量分析測定的主要手段。由于生物胺分子中缺乏發(fā)色基團，在采用RP-HPLC 方法測定時，為了提高檢測的靈敏度，需要采用柱前或柱后衍生技術(shù)，以單檢測器進行檢測。由于柱后衍生所需的儀器設(shè)備昂貴，投資大，所以研究者多選擇柱前衍生法。目前，食品中生物胺的衍生試劑主要有丹磺酰氯（Dns-Cl）、鄰苯二甲醛（OPA）、苯甲酰氯（Benzoyl Chloride）[49]、咔唑乙酰氯（AQC）、二硝基苯甲酰氯（Dabs-Cl）、3，5-二硝基-4-氯-三氟甲基苯（CNBF）、9-芴基甲基-氯甲酸酯（FMOC-Cl）[50]和苯基異硫氰酸鹽（PITC）[51]等。使用衍生劑可以提高檢測靈敏度，但其也具有一定的局限性，例如Benzoyl Chloride 和PITC 衍生物不產(chǎn)生熒光，只能用靈敏度較低的紫外檢測器；FMOC-Cl 會產(chǎn)生從單胺到多胺的多重產(chǎn)物，對測定復(fù)雜基質(zhì)的樣品會產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾；Dns-Cl 不僅可以與生物胺反應(yīng)，還可以與酚、氨基酸和一些糖類反應(yīng)，且衍生反應(yīng)時間較長；OPA 的衍生時間短，但是衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定。衍生試劑的選擇以衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性好、雜質(zhì)少、衍生過程簡單為原則。發(fā)酵型飲料酒成分復(fù)雜，可能含有氨基酸、多酚類及非極性物質(zhì)等，這些物質(zhì)會對生物胺的分離和定量產(chǎn)生干擾，并可能堵塞色譜柱，因此，在樣品進入儀器分析前，往往需要采用固相萃取（SPE）法或液-液萃?。↙LE）法對其進行前處理，以改善分離和分析效果。目前，對于發(fā)酵型飲料酒中生物胺檢測的RPHPLC 方法中，研究者最常用的衍生試劑是Dns-Cl 和OPA，前處理至少采用0.45 μm 濾膜過濾，檢測器一般采用熒光檢測器或紫外檢測器，色譜柱一般采用C18柱。詳見表5。

表5 發(fā)酵型飲料酒中常見的RP-HPLC 測定生物胺方法Table 5 Methods for determination biogenic amines in fermentsd alcohoblic beverages by RP-HPLC

續(xù)表5 發(fā)酵型飲料酒中常見的RP-HPLC 測定生物胺方法Continue table 5 Methods for determination biogenic amines in fermentsd alcohoblic beverages by RP-HPLC

3 結(jié)論

發(fā)酵型飲料酒中的生物胺主要來自原料和發(fā)酵釀造過程。尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺等是葡萄酒、啤酒和黃酒等發(fā)酵型飲料酒中的主要生物胺，其中，黃酒中生物胺的檢出含量最高。在生物胺檢測方法中，RP-HPLC 法仍是目前最為簡便、穩(wěn)定、成熟可靠的測定方法。生物胺相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和控制技術(shù)措施的研究與制定，是有效控制發(fā)酵型飲料酒中生物胺，達到提高發(fā)酵型飲料酒質(zhì)量安全的目的有效手段。

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