基于QuEChERS法提取液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定新會陳皮中的9 種真菌毒素和農(nóng)藥殘留

彭曉俊,曾麗珠,伍長春,梁偉華

(1.新會出入境檢驗檢疫局,廣東 江門 529100;2.陽江出入境檢驗檢疫局,廣東 陽江 529500)

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基于QuEChERS法提取液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定新會陳皮中的9 種真菌毒素和農(nóng)藥殘留

彭曉俊1*,曾麗珠2,伍長春1,梁偉華1

(1.新會出入境檢驗檢疫局,廣東 江門 529100;2.陽江出入境檢驗檢疫局,廣東 陽江 529500)

建立了QuEChERS-改性多壁碳納米管提取凈化結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同時檢測新會陳皮中6 種真菌毒素和3 種農(nóng)藥殘留的分析方法，并對影響提取、凈化、檢測效率的因素進行了優(yōu)化。以乙腈-水(80∶20)提取樣品，適量改性多壁碳納米管凈化后，凈化液直接用HPLC-MS/MS進行測定，選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式，基質(zhì)匹配標準溶液外標法定量。在優(yōu)化實驗條件下，9 種目標化合物在各自線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.983 8～0.998 2，檢出限(S/N=3)為0.18～10 μg/kg。在低、中、高3個加標水平的平均回收率為72.4%～106%，相對標準偏差為2.2%～7.4%。該法準確、靈敏度高﹑操作簡單﹑快速，可滿足新會陳皮中上述9 種化合物同時測定的要求，應(yīng)用于真菌毒素和農(nóng)藥殘留的快速篩查和確證，結(jié)果滿意。

QuEChERS；改性多壁碳納米管；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)；真菌毒素；農(nóng)藥殘留；新會陳皮

陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，新會是陳皮的道地產(chǎn)區(qū)，新會陳皮為廣東十大地道中藥材之一，是“廣東三寶”(陳皮、老姜、禾稈草)的第一寶和清廷貢品，而經(jīng)年陳藏的新會陳皮更是珍品。2016 年新會陳皮種植面積共6.5 萬畝，陳皮總產(chǎn)量預計達7 000 噸，行業(yè)產(chǎn)值近30 億元，但新會陳皮面臨的食品安全風險十分嚴峻。陳皮在加工儲存過程中，由于受溫度濕度等影響，容易霉變而產(chǎn)生真菌，真菌代謝產(chǎn)生有毒的真菌毒素，真菌毒素能損壞人的肝腎功能、致癌、致畸并誘發(fā)免疫抑制性疾病[1]。在這些代謝物中，黃曲霉毒素類、赭曲霉毒素類、玉米赤霉烯酮對人體健康危害尤為巨大。農(nóng)作物種植過程中引入的農(nóng)藥殘留，通過食物鏈進入人體，進而危害人類健康，同樣是導致食品安全突發(fā)事件頻發(fā)的主要原因。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是應(yīng)用最為廣泛的除草劑，滅多威是一種廣譜性氨基甲酸酯類殺蟲劑，毒死蜱則是最常用的殺蟲劑，這3 種農(nóng)藥高效、廣譜，具有擊倒速度快、作用范圍廣等特點，在我國使用廣泛[2]。因此，由真菌毒素、農(nóng)藥殘留產(chǎn)生的健康風險問題日益受到人們的關(guān)注。

目前，真菌毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[3-5]、薄層色譜法[6]、液相色譜法[7-9]和液質(zhì)聯(lián)用法[10-14]等，但前3種方法的選擇性較差，只能檢測單一種類的真菌毒素。農(nóng)藥的定量檢測一般采用氣相色譜法[15-16]、氣質(zhì)聯(lián)用法[17-18]?，F(xiàn)有的真菌毒素、農(nóng)藥殘留檢測方法相對較為獨立，真菌毒素和農(nóng)藥殘留不能同時檢測，無法滿足食品安全突發(fā)事件檢測時間短、檢測目標組分多的快速處置要求。近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS/MS)在檢測方面的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，采用選擇離子監(jiān)測技術(shù)，可大大提高檢測的靈敏度和準確性，已被越來越多地應(yīng)用于高通量分析，但常規(guī)前處理方法步驟繁瑣、有機試劑消耗量大，對操作人員技能要求高。新會陳皮含有揮發(fā)油、黃酮化合物、有機酸等化學成分，還有大量色素、脂肪、糖等生化成分，用傳統(tǒng)的液液萃取、索氏抽提、固相萃取等前處理方法，普遍存在基質(zhì)干擾嚴重、步驟繁瑣、重現(xiàn)性差且有機溶劑消耗量大等缺點。2003年，Anastassiades等[19]建立了QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)新型樣品前處理方法，QuEChERS可以根據(jù)樣品基質(zhì)和待測物的特性，選擇合適的有機提取溶劑和凈化填料，具有快捷、簡便、高效、環(huán)保等優(yōu)點。QuEChERS前處理方法結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用測定陳皮中真菌毒素、農(nóng)藥殘留的方法尚未見報道。1991 年，日本電鏡專家Iijima[20]發(fā)現(xiàn)了多壁碳納米管(MWNTs)，但未處理的MWNTs表面缺少官能基團，疏水性強、不溶不熔、易纏結(jié)團聚，影響了其作為吸附劑應(yīng)用。本文通過對MWNTs進行衍生化化學修飾，用強氧化性酸對MWNTs進行酸處理，使其表面產(chǎn)生一定量的羥基、羧基等含氧活性官能基團，有效提高了改性MWNTs在溶液介質(zhì)中的分散性能和對有機化合物的吸附性能，加之改性MWNTs準一維的中空管結(jié)構(gòu)和高的比表面積，因此在吸附方面具有優(yōu)異的性能。本研究利用改性MWNTs在吸附方面具有的優(yōu)異性能去除樣品中的干擾，采用QuEChERS提取、改性MWNTs凈化、液質(zhì)聯(lián)用測定，建立了新會陳皮中6 種真菌毒素和3 種農(nóng)藥殘留的快速、準確、簡便分析方法。相關(guān)研究能夠為樣品的快速篩查提供可靠的技術(shù)支持，將其應(yīng)用于新會陳皮食品安全突發(fā)事件的快速應(yīng)急處置工作，可整體提升應(yīng)急處置工作效率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT 高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；API 3200質(zhì)譜儀(美國ABsciex公司)；H-800-1 型透射電子顯微鏡(日本日立公司)；Nexus 670 型傅立葉變換紅外光譜掃描儀(美國Thermo公司)；2-16 型通用臺式高速離心機(德國Sigma公司)；DZF-6050 型真空干燥機(上海精密儀表公司)；KQ 2200DB 型超聲振蕩器(昆山超聲儀器有限公司)；LAB DANCER 渦旋混合器(德國IKA公司)；DN-12W 氮吹儀(上海比郎公司)；Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；50 mm×0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜(美國Millipore公司)。

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、滅多威(Methomyl)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)標準品均購自美國Sigma公司；甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；甲酸、乙酸銨(優(yōu)級純，上海安譜公司)；MWNTs填料(純度>95%，直徑10～20 nm，長度300～800 nm，深圳納米港有限公司)；Florisil填料(80～100 目，上海博勢公司)；PSA填料(平均粒度45 μm，孔體積0.8 m3/g，山東奧秘公司)；硅膠(60～100目，青島海洋化工)；實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Shimadzu C18(150 mm×2.1 mm×3.5 μm)；流速：0.20 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A為5 mmol/L 乙酸銨水溶液(含1%甲酸)，B 為乙腈；梯度洗脫程序：0～2 min，10%B；2～20 min，10%～80%B；20～26 min，10%B。

1.2.2 質(zhì)譜分析條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；碰撞氣壓力：60 kPa；氣簾氣壓力：250 kPa；霧化氣壓力：550 kPa；加熱輔助氣壓力：550 kPa；MRM參數(shù)見表1。

表1 9種化合物的串聯(lián)質(zhì)譜檢測參數(shù)

*quantitative ion

1.3 MWNTs改性

稱取50 g MWNTs置于500 mL燒瓶中，加入50 mL濃硫酸，超聲30 min，再向燒瓶中加入30 mL濃硝酸，超聲30 min，靜置，用吸管吸除上層混酸清液，然后加入1 000 mL水稀釋，稀釋液過0.22 μm的聚四氟乙烯微孔濾膜，水洗至濾液pH值為7.0，所得黑色固體經(jīng)真空烘箱50 ℃干燥即得被氧化的改性MWNTs。

1.4 樣品處理

稱取粉碎的新會陳皮2.00 g于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈-水(80∶20，體積比，下同)，振蕩1 min，再加入0.6 g改性MWNTs，振蕩1 min，超聲10 min，5 000 r/min離心5 min，吸取上層清液過0.22 μm有機相濾膜，供上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 MWNTs表面改性

MWNTs獨特的中空管結(jié)構(gòu)以及高比表面積使之具有作為凈化吸附劑的優(yōu)異性能。但未改性的MWNTs由于表面缺少活性官能基團，限制了其在吸附領(lǐng)域的應(yīng)用，因此須對MWNTs表面進行氧化改性，使其表面產(chǎn)生一定量的羧基、羥基等活性官能基團。本研究中氧化改性前后的透射電鏡照片(TEM)見圖1。由圖1可見，氧化改性后所得MWNTs分散均勻，有一定的長徑比，長度分布均勻，說明本研究所采用的氧化改性方法效果好。氧化前后MWNTs的紅外光譜見圖2，可觀察到氧化后的MWNTs在3 414 cm-1處出現(xiàn)較寬的吸收峰，該吸收峰由羥基伸縮振動所引起，在1 704 cm-1處的吸收峰羧基中的羰基伸縮振動所引起，這些結(jié)果可以說明強酸氧化后MWNTs的表面產(chǎn)生了羥基和羧基官能基團。

圖1 未經(jīng)氧化(A)及混酸氧化后(B)所得MWNTs的TEM照片

Fig.1 TEM images of MWNTs of raw untreated(A) and treated(B) with a mixture acid by oxidation

圖2 未經(jīng)氧化(a)及混酸氧化后(b)所得紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of MWNTs of raw untreated(a) and treated(b) with a mixture acid by oxidation

2.2 提取溶液的選擇

將目標化合物從樣品中有效提取是多殘留分析必須解決的首要問題，樣品提取一般采用有機溶劑加水作為提取溶液，提取液含水可以濕潤基質(zhì)，增強有機溶劑的滲透能力，便于有機溶劑的滲入和萃取，從而提高對目標化合物的提取效率。本研究的目標化合物為脂溶性物質(zhì)，溶于乙腈、乙醚和氯仿等有機溶劑，但乙醚、氯仿等有機試劑毒性大，而乙腈能有效沉淀蛋白質(zhì)和脂肪，適用性廣，因此真菌毒素、農(nóng)藥檢測一般選擇乙腈-水作為提取溶液。本研究以2,4-D、滅多威、AFB1和ZEN作為考察物，以回收率作為考察指標，在新會陳皮空白樣品中添加25 μg/kg混標，考察了乙腈-水體積比分別為100∶0，90∶10，80∶20，70∶30時的回收率。結(jié)果顯示，當乙腈-水比例為80∶20時提取效果最好。因此，實驗選用乙腈-水(80∶20)作為提取溶液。

2.3 凈化吸附劑的選擇

新會陳皮基質(zhì)復雜，為了消除雜質(zhì)干擾，本研究對改性MWNTs，F(xiàn)lorisil，PSA，硅膠4種吸附劑的凈化作用進行了比較。在空白新會陳皮中添加一定量的混合標準溶液，分別采用改性MWNTs，F(xiàn)lorisil，PSA和硅膠吸附劑進行凈化，以2,4-D、滅多威、AFB1和ZEN的回收率作為考察指標。結(jié)果表明，F(xiàn)lorisil能有效地吸附極性化合物，但凈化液呈淺黃色，PSA能有效去除提取液中的有機酸、脂肪酸、糖類，但去除生物堿、色素、維生素、黃酮化合物等的效果不佳，用Florisil和PSA作凈化吸附劑，雜質(zhì)對目標化合物有干擾；硅膠對蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等雜質(zhì)有較高的吸附量，但也能牢固吸附目標化合物，4種化合物的回收率低。改性MWNTs可有效除去樣品中的水溶性和脂溶性雜質(zhì)，凈化液無色，雜質(zhì)背景對目標化合物檢測無影響且回收率最高。此外，改性MWNTs能在廣泛的pH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，保證了凈化效果及方法的通用性，因此本研究采用改性MWNTs作為凈化吸附劑。

考察了改性MWNTs吸附劑用量分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g時對目標化合物回收率的影響。結(jié)果顯示，隨著吸附劑用量增加，目標化合物的回收率增大，這是由于真菌毒素和農(nóng)藥含π電子少，雜質(zhì)與吸附劑能形成更強的π-π吸附而減少了對目標化合物的干擾。當吸附劑用量為0.6 g時回收率最高，繼續(xù)增加吸附劑用量，目標化合物的回收率無明顯變化，因此，選擇吸附劑的最佳用量為0.6 g。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制9 種真菌毒素、農(nóng)藥混合標準溶液，用蠕動泵以10 μL/min的流速連續(xù)注射，在正離子模式下進行一級母離子全掃描，得到目標化合物的分子離子峰，優(yōu)化去簇電壓、霧化氣、氣簾氣等參數(shù)。根據(jù)歐盟2002/657/EC《質(zhì)譜分析方法鑒定點數(shù)》指令要求，在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個以上的子離子，打碎目標分子離子峰進行二級質(zhì)譜掃描(子離子掃描)，采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，對碰撞能、碰撞室出口電壓等參數(shù)進行優(yōu)化，最終每種目標化合物分別選擇1 個定量離子外標法定量，2 個定性離子和豐度比為定性依據(jù)，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖3 9 種化合物的基質(zhì)效應(yīng)Fig.3 Matrix effects of nine compounds

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)指樣品中被分析物以外的組分對分析過程及結(jié)果準確性的影響和干擾。不同真菌毒素、農(nóng)藥在同一基質(zhì)中具有不同的基質(zhì)效應(yīng)，同一真菌毒素、農(nóng)藥在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)也不同，同時基質(zhì)效應(yīng)還與濃度具有一定的關(guān)系，隨著濃度增加，基質(zhì)效應(yīng)逐漸減弱。本實驗對新會陳皮的基質(zhì)效應(yīng)進行了研究，樣品基質(zhì)效應(yīng)采用標準曲線測定法，即配制2 組標準曲線，第1 組、第2 組分別用純有機溶劑、基質(zhì)空白提取液配制混合標準溶液，分別繪制有機溶劑標準曲線和基質(zhì)匹配標準曲線，采用基質(zhì)匹配標準曲線斜率和有機溶劑標準曲線斜率之比(K)來評價基質(zhì)效應(yīng)：若K值介于0.9～1.1之間，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，K大于1.1時為基質(zhì)增強效應(yīng)，小于0.9則是基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示：以新會陳皮作為基質(zhì)時，AFG2，AFG1，AFB2和AFB1為基質(zhì)減弱效應(yīng)，2,4-D和ZEN表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)，其他3 種化合物無明顯的基質(zhì)效應(yīng)(見圖3)。為提高定量的準確性，本實驗采用基質(zhì)匹配標準溶液(即以空白的新會陳皮凈化液配制標準溶液制作校正曲線)校正方法進行定量分析和計算，對基質(zhì)效應(yīng)進行補償。

2.6 線性范圍與檢出限

以空白新會陳皮基質(zhì)提取液為溶液，根據(jù)9種化合物的響應(yīng)強弱，配制不同質(zhì)量濃度的混合標準溶液，在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下進行測定，以定量離子的儀器響應(yīng)峰面積(y)對各目標化合物的濃度(x)進行線性回歸，9 種目標化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。由表可見目標化合物在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.983 8～0.998 2，以3 倍信噪比(S/N=3)計算方法檢出限(LOD)為0.18～10 μg/kg，混合標準溶液的總離子流圖見圖4。

圖4 混合標準溶液(A)、新會陳皮(B)與新會陳皮添加標準品(C)的總離子流圖

Fig.4 TIC chromatograms of mixed standard solution(A),a xinhui dried orange peel(B) and a xinhui dried orange peel spiked with standards(C) the peak numbers(1-9) denoted were as the same as those in Table 1

2.7 回收率與精密度

為了評價方法的適用性，在上述最優(yōu)條件下，取新會陳皮空白樣品，按低、中、高3個濃度水平分別添加混合標準液，每個濃度水平重復6 次考察方法精密度，結(jié)果見表2。各目標化合物的加標回收率為72.4%～106%，相對標準偏差(RSD)為2.2%～7.4%。方法的準確度高、穩(wěn)定性好，可滿足痕量分析的要求。

表2 方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、平均回收率及相對標準偏差(n=6)

(續(xù)表2)

No．CompoundLinearrange(μg/L)rLOD(μg/kg)Spiked(μg/kg)RecoveryR/%RSDsr/%3Chlorpyrifos1 0～1000 99822 55 0，10，5096 4，101，1025 8，6 3，2 24AFG20 10～200 99630 180 50，1 0，5 0101，96 3，1067 4，5 8，3 95AFG10 10～200 99410 240 50，1 0，5 072 4，91 2，92 63 9，6 6，4 56AFB20 10～200 99240 200 50，1 0，5 085 6，92 4，93 45 6，6 2，6 07AFB10 10～200 99120 210 50，1 0，5 092 7，88 3，89 56 2，7 1，5 68OTA5 0～5000 99631025，50，25083 8，89 7，96 16 2，6 2，5 89ZEN5 0～5000 99249 725，50，25092 4，99 5，1034 2，5 3，7 2

2.8 實際樣品的分析

采用本文建立的方法對300余份日常送檢的新會陳皮進行檢測，以實驗室空白、平行樣和樣品加標進行質(zhì)量控制，其中6 份樣本檢出2,4-D(8.9～12 μg/kg)，3 份樣本檢出OTA(26.8～95.5 μg/kg)，其余樣品未檢出真菌毒素和農(nóng)藥。

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，以改性MWNTs作為凈化劑，將QuEChERS凈化法與HPLC-MS/MS結(jié)合可用于新會陳皮中真菌毒素和農(nóng)藥殘留的檢測。方法的加標回收率為72.4%～106%，RSD為2.2%～7.4%，檢出限為0.18～10 μg/kg，方法前處理步驟簡便快速，結(jié)果準確，檢出限滿足國內(nèi)外標準的限量要求。此外，該方法能同時完成真菌毒素和農(nóng)藥殘留2 類不同組分的檢測，為食品安全提供了技術(shù)保障，具有一定的推廣價值。

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PENG Xiao-jun1*,ZENG Li-zhu2,WU Chang-chun1,LIANG Wei-hua1

(1.Xinhui Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Jiangmen 529100,China;2.Yangjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yangjiang 529500,China)

An analytical method based on QuEChERS with modified multiwalled carbon nanotubes(MWNTs) as adsorbent was developed.The determination of 6 mycotoxins and 3 pesticides residues,including 2,4-D,methomyl,chlorpyrifos,AFG2,AFG1,AFB2,AFB1,OTA and ZEN in xinhui dried orange peel was carried out by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).The factors affecting the extraction，purification and detection efficiency were optimized，and the optimal conditions were as the following：the samples were extracted with acetonitrile-water(80∶20) mixed solution，and purified by QuEChERS method with modified MWNTs as adsorbent.The separation was performed on a Shimadzu C18(150 mm×2.1 mm×3.5 μm) column,then determined by LC-MS/MS under multiple reaction monitoring(MRM) mode and quantified by external standard method with the matrix-matched standards solution.Under the optimized conditions,the calibration curves of 9 compounds were linear in the respective concentration ranges with correlation coefficients of 0.983 8-0.998 2.The detection limits(S/N=3) were in the range of 0.18-10 μg/kg.The recoveries at low,medium and high spiked levels ranged from 72.4% to 106%,with relative standard deviations of 2.2%-7.4%.With the advantages of accuracy,high sensitivity，easy operation and rapidness,the method was suitable for the simultaneous determination of mycotoxins and pesticide in xinhui dried orange peel,and was applied in the rapid screening of toxic and harmful substances in foods with satisfactory results.

QuEChERS；modified multiwalled carbon nanotubes；liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)；mycotoxins；pesticide residue；xinhui dried orange peel

2017-01-09；

2017-02-13

國家質(zhì)檢總局科技項目(2016IK066 );江門市科技項目(20161408 )

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.006

O657.63；S852.44

A

1004-4957(2017)06-0738-06

*通訊作者：彭曉俊,碩士,高級工程師,研究方向:食品安全,Tel:0750-6312076,E-mail:pxj2129@163.com