液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿液中的泛酸

張小濤，章云飛，侯宏衛(wèi)，陳 歡，劉 勇，王 安，胡清源*

(1.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南 鄭州 450001；2．中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)院 應(yīng)用技術(shù)所，安徽 合肥 230031；3.河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

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液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿液中的泛酸

張小濤1,2，章云飛3，侯宏衛(wèi)1*，陳 歡1，劉 勇2，王 安2，胡清源1,2*

(1.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南 鄭州 450001；2．中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)院 應(yīng)用技術(shù)所，安徽 合肥 230031；3.河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

該文建立了檢測尿液中泛酸含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法，尿液經(jīng)過離心、稀釋后，采用ACPUITY UPLC SS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱進行分離，電噴霧正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式進行檢測，方法的線性關(guān)系良好(r=0.999 3)，方法檢出限為0.46 ng/mL，回收率為87.9%～95.3%，相對標準偏差(RSD)為2.5%～13.0%。該方法具有靈敏度高、分析時間短等特點，可用于尿液中泛酸含量的分析。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；尿液；泛酸；生物監(jiān)測

泛酸又稱維生素B5、遍多酸,是一種水溶性維生素,幾乎存在于所有活細胞中。泛酸是生物機體正常生理代謝所必需的營養(yǎng)素，是輔酶A(CoA)的前體，而CoA則是泛酸發(fā)揮功能的生物活性形式[1]，含碳架物質(zhì)產(chǎn)生能量及許多細胞結(jié)構(gòu)的形成均需泛酸參與，攝食不足或生理狀態(tài)的改變均可引起泛酸缺乏[2]。泛酸缺乏可使需要CoA的反應(yīng)受到抑制，主要影響脂肪酸代謝，使脂肪酸β-氧化受到抑制，進而導(dǎo)致高血脂等，嚴重者可產(chǎn)生腦部損害[3]。另外，泛酸還具有抗脂質(zhì)過氧化作用，對遭受脂質(zhì)過氧化損傷的細胞和大鼠具有很好的保護作用，可能是通過CoA形式清除自由基或CoA促進磷脂合成，從而促進修復(fù)[4]。攝入體內(nèi)的過量的泛酸會隨尿液排出，且泛酸的攝入量和尿液中的排泄量之間存在一定的相關(guān)性[5]，因此尿液中泛酸的含量可以作為評價泛酸攝入的有效營養(yǎng)指標。

目前，尿液中泛酸含量的測試方法主要有高效液相色譜熒光檢測法(HPLC-FL)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(LC-MS或LC-MS/MS)，如Fukuwatari等[6]采用同位素反向離子對柱后衍生化的方法測定了尿液中的泛酸含量，但該方法需使用離子對試劑及柱后衍生化，前處理相對繁瑣；Heudi等[7]建立了尿液中泛酸含量的液相色譜-質(zhì)譜檢測方法，方法簡單，但靈敏度較低；最近，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(LC-MS/MS)被廣泛用于食品[8-10]和血清[11]中泛酸含量的測定，Gosetti等[12]利用LC-MS/MS法分析橄欖油中8種多酚和泛酸，該方法靈敏度較高，其中泛酸的檢出限為0.3 μg/L，說明LC-MS/MS方法比HPLC和LC-MS方法更適于泛酸的定量分析，目前未見采用LC-MS/MS測定尿液中泛酸含量的報道。本文建立了LC-MS/MS測定尿液中泛酸含量的方法，并利用建立的方法對喉癌志愿者和健康志愿者尿液中的泛酸含量進行定量分析。相比已有方法，本研究靈敏度較高，適用于尿液中泛酸含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200快速液相色譜儀(包括G1367D 自動進樣器、G1312B 二元溶劑泵、G1316B柱溫箱)(安捷倫科技有限公司)；AB Sciex 5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

泛酸(純度為95%，武漢易泰科技有限公司上海分公司)；甲酸(純度大于96%，Sigma-Aldrich公司)；乙腈(色譜純，CINC高純?nèi)軇┯邢薰?；實驗用水采用Milli-Q純水儀過濾。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取10 mg泛酸于10 mL容量瓶中，加入0.1%甲酸水溶液定容，混合均勻，即得泛酸的儲備液。取儲備液逐級稀釋，即得標準溶液和工作溶液。

1.3 樣品前處理

尿液在室溫下解凍、離心后，移取100 μL于10 mL的容量瓶中，用0.1%的甲酸溶液定容，混合均勻后，移取約 1 mL放入1.8 mL的色譜瓶中，待LC-MS/MS進行分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：所有樣品均采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)進行分離，色譜柱溫度為35 ℃;流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈；進樣量為5 μL；流速為200 μL/min。梯度條件：0～1 min，5%B；1～5 min，5%～100%B；5～6 min，100%B，6～6.3 min，100%～5%B；6.3～8 min，5%B。

質(zhì)譜條件：采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，離子源為電噴霧離子源，掃描方式為正離子，電噴霧電壓為 5 500 V,碰撞氣：9 psi,氣簾氣：40 psi，輔助加熱氣：30 psi，溫度：500 ℃，射入電壓為10 V，駐留時間為100 ms，所采用的定性和定量離子對的質(zhì)荷比分別為m/z220.3→90.1和m/z220.3→202.2。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所用數(shù)據(jù)采用Analyst 1.5.1進行分析，T檢驗采用SPSS 20.0進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵，在電噴霧正離子模式下，以10 μL/min的速度向質(zhì)譜中注入1 μg/mL泛酸標準溶液，泛酸的母離子形式有[M+H]+和[M+Na]+兩種，且[M+Na]+的響應(yīng)強于[M+H]+，因此在標準品中加入了0.1%的甲酸，根據(jù)電離平衡原理，甲酸的加入會使溶液中[M+H]+離子的響應(yīng)明顯增強，且遠超過[M+Na]+，得到泛酸的母離子質(zhì)荷比為m/z220.3，然后采用產(chǎn)物離子掃描的方式尋找泛酸的子離子，當(dāng)去簇電壓為90 V時，泛酸的子離子質(zhì)荷比分別為m/z90.1和m/z202.2，即所使用的定性和定量離子對質(zhì)荷比分別為m/z220.3→90.1和m/z220.3→202.2。進一步對定量和定性離子對的碰撞能量進行優(yōu)化，獲得最佳碰撞能量分別為18.2 eV和20.4 eV 。優(yōu)化的質(zhì)譜條件見“1.4”。

圖1 標準溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of standard solution

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于泛酸的極性較強，在常規(guī)C18色譜柱上的保留比較弱，因此選取Waters的ACPUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱對尿液樣本進行分離，并對色譜柱溫度和流動相比例進行優(yōu)化。選擇色譜柱溫度為35 ℃，流動相為0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈，流速為200 μL/min，采用“1.4”中的梯度洗脫條件，泛酸標準溶液的色譜圖如圖1所示。由圖1可見，泛酸在Waters的ACPUITY UPLC HSS T3色譜柱上有較好的保留，且峰形尖銳對稱，其保留時間為2.94 min。

2.3 方法學(xué)研究

在優(yōu)化條件下，將標準工作溶液分別稀釋成質(zhì)量濃度為3.6，6，30，60，120，240，360 ng/mL的工作溶液，以泛酸的濃度(x,mg/mL)為橫坐標，對應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標，繪制泛酸的標準曲線，標準曲線方程為y=3.84×103x+7.71×103，其線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 3。以3倍和10倍信噪比(S/N)分別計算方法的檢出限和定量下限，得到方法的檢出限為0.46 ng/mL，定量下限為1.54 ng/mL。

表1 方法的回收率與精密度(n=6)

選取5個尿液樣本混合均勻，測得其泛酸含量為72.35 ng/mL，然后分別向其中加入低、中、高(12.00，180.0，240.0 ng/mL) 3個濃度水平的泛酸標準溶液，每個濃度平行制樣6個，采用LC-MS/MS進行檢測，計算方法的回收率。結(jié)果顯示，3種加標水平下的回收率分別為95.3%，88.9%，87.9%；相對標準偏差分別為13.0%，2.8%，2.5%，可以滿足分析要求。

選取低、中、高3個水平(6,60，240 ng/mL)分別做溶劑和尿液的加標回收實驗，然后根據(jù)目標分析物在溶劑和尿液中的峰面積來計算基質(zhì)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在尿液中均存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，低、中、高3個濃度水平的基質(zhì)抑制分別為33.3%，28.7%和21.3%。

圖2 尿液中泛酸含量的箱線圖Fig.2 The box plot of urinary pantothenic acid

2.4 方法應(yīng)用

利用建立的 LC-MS/MS方法對26個健康志愿者和33個喉癌志愿者尿液中泛酸的濃度進行分析(圖2)，測得健康志愿者尿液中泛酸的濃度為0.21～18.5 μg/mL，平均濃度為8.71 μg/mL；喉癌志愿者尿液中泛酸的濃度為1.49～20.1 μg/mL，平均濃度為8.97 μg/mL。采用T檢驗對兩組樣本之間的差異顯著性進行了檢驗，發(fā)現(xiàn)泛酸在喉癌志愿者和健康志愿者之間無明顯差異(P>0.05)，說明喉癌對于尿液中的泛酸的含量影響不大。

3 結(jié) 論

本文建立了LC-MS/MS測定尿液中泛酸含量的分析方法，方法具有靈敏度高、分析時間短等特點。利用建立的方法對26個健康志愿者和33個喉癌志愿者尿液中泛酸的濃度進行了分析，結(jié)果表明喉癌志愿者尿液中泛酸的平均含量和健康志愿者之間無顯著性差異。

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Determination of Pantothenic Acid in Human Urine by Liquid Chromatography- Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Xiao-tao1,2,ZHANG Yun-fei3,HOU Hong-wei1*,CHEN Huan1,LIU Yong2,WANG An2,HU Qing-yuan1,2*

(1.China National Tobacco Quality Supervision & Test Center,Zhengzhou 450001,China;2.Institute of Applied Technology,Hefei Institutes of Physical Science,Chinese Academy of Sciences,Hefei 230031,China; 2.Henan Tumor Hospital,Zhengzhou 450008,China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS)method for the determination of pantothenic acid in urine was developed and validated.After centrifugation and dilution,the sample was separated on an ACPUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm) column produced by the Waters corporation,and ionized in electro spray positive ion mode,then detected using multi-reaction monitoring mode.The calibration curve has a good linear range with a correlation coefficient(r) of 0.999 3.The limit of detection is 0.46 ng/mL,the recoveries are in the range of 87.9%-95.3%,and the RSDs are in the range of 2.5%-13.0%.The method has the advantages of high sensitivity and short analysis time,and could be used to analyze pantothenic acid in human urine.

liquid chromatography tandem mass spectrometry;urine;pantothenic acid;biomonitoring

2017-01-19;

2017-02-26

國家自然科學(xué)基金項目(21277174)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.019

O656.63；Q563

A

1004-4957(2017)06-0809-04

*通訊作者：侯宏衛(wèi)，博士，研究員，研究方向：煙草質(zhì)量監(jiān)督與檢驗、吸煙與健康研究，Tel:0371-67672727,E-mail：qsfctc@163.com 胡清源，博士，研究員，研究方向：煙草質(zhì)量監(jiān)督與檢驗、吸煙與健康研究，Tel:0371-67672601,E-mail：huqy1965@163.com