新多聚糖碳酸氫鹽腹膜透析液對人腹膜間皮細胞凋亡及纖維化相關(guān)因子的影響

胡 波 龔文玉 尹良紅 祝 琳

新多聚糖碳酸氫鹽腹膜透析液對人腹膜間皮細胞凋亡及纖維化相關(guān)因子的影響

胡 波1龔文玉1尹良紅1祝 琳2

目的：比較新研制的多聚糖碳酸氫鹽腹膜透析液(PDF)與常用乳酸鹽PDF對人腹膜間皮細胞(HPMC)凋亡及間質(zhì)纖維化相關(guān)因子的影響。 方法：體外培養(yǎng)HPMC細胞，使用新型PDF與不同葡萄糖濃度的傳統(tǒng)乳酸鹽PDF(1.5%、2.5%、4.25%)處理細胞，通過實時熒光定量PCR法檢測細胞凋亡因子Bax、胱天蛋白酶3(Caspase-3)及Bcl-2、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、纖維連接蛋白(FN)的mRNA表達量，ELISA法測定細胞分泌TGF-β1量，免疫印跡法檢測細胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3、抑制凋亡蛋白Bcl-2和FN的表達量。 結(jié)果：不同PDF刺激HPMC細胞一定時間后，1.5%、2.5%、4.25%傳統(tǒng)PDF中葡萄糖濃度越高，Bax、Caspase-3、TGF-β1和FN增高越明顯，抑制凋亡因子Bcl-2下降越顯著,而新型PDF影響較小。含2.5%、4.25%葡萄糖的PDF刺激后，纖維化相關(guān)因子TGF-β1、FN明顯高于陰性對照組和新型PDF組(均P<0.05)。 結(jié)論：新型多聚糖碳酸氫鹽PDF對腹膜間皮細胞凋亡信號活化低于傳統(tǒng)乳酸鹽PDF，其腹膜間皮細胞纖維化程度低，有很好的臨床應(yīng)用前景。

腹膜透析液 腹膜間皮細胞 細胞凋亡 腹膜纖維化

腹膜透析(PD)是終末期腎病(ESRD)患者有效的治療方法之一。目前國內(nèi)市面上在售的腹膜透析液(PDF)以葡萄糖為溶劑的，包括1.5%、2.5%和4.25%三種濃度，并以乳酸鹽作為緩沖堿。乳酸鹽吸收進入體內(nèi)后必須經(jīng)過肝臟代謝為碳酸氫根才能發(fā)揮糾正代謝性酸中毒的生理作用，因此不適合用于肝臟功能障礙患者。生理性較理想的緩沖堿基為碳酸氫鹽，乳酸鹽和醋酸鹽都是非生理性緩沖堿。人腹膜間皮細胞(HPMC)是腹膜組織中最主要的功能細胞和結(jié)構(gòu)細胞，HPMC在腹膜纖維化過程中起著非常重要的作用。在腹膜纖維化早期，我們可以觀察到肥大的腹膜間皮細胞呈現(xiàn)細胞早衰的特征[1]。發(fā)生衰老的間皮細胞將慢慢出現(xiàn)凋亡或死亡，可引起腹膜間皮細胞的脫落，同時腹膜間皮細胞過多的凋亡可導(dǎo)致腹膜細胞外基質(zhì)增生，從而導(dǎo)致腹膜抵御纖維化的能力下降，最終因腹膜過早出現(xiàn)纖維化引起超濾衰竭。研發(fā)新型的減少HPMC細胞凋亡及纖維化的PDF成為目前的研究熱點。

在目前眾多凋亡信號的研究中，胱天蛋白酶(Caspase)家族、Bax及Bcl-2蛋白家族是目前最受關(guān)注的三種凋亡調(diào)控基因[2-3]。Bax、Caspase是凋亡基因，Bcl-2是凋亡抑制基因,Bax和Bcl-2是目前已知的一對重要調(diào)控基因，且在凋亡調(diào)控過程中的功能是相互對立的。大量臨床和基礎(chǔ)研究顯示，長期暴露在非生物相容性的PDF中，在大量細胞因子和炎癥因子的共同作用下可導(dǎo)致腹膜發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)，包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和纖維連接蛋白(FN)[4-6]，可導(dǎo)致腹膜纖維化病變的發(fā)生，而且這種病變以FN沉積為特征[7]。

本文通過比較新研制的多聚糖碳酸氫鹽PDF與常用乳酸鹽PDF對HPMC凋亡及間質(zhì)纖維化相關(guān)因子的影響，為研制新型PDF提供實驗依據(jù)。

實驗材料和方法

主要試劑 M199培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；100×鏈霉素和青霉素(美國Invitrogen公司)；胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白(美國Sigma公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(美國Sigma-Aldrich公司)；RNA提取試劑Trizol (美國Invitrogen公司)，引物由上海生工公司合成；SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) kit(大連寶生物公司)；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(大連寶生物公司)；human TGF-β1預(yù)包被ELISA kit(北京達科為公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)；BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天公司)；Caspase-3、Bax、Bcl-2、FN和β-tubulin單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗(美國Cell Signaling Technology公司)。新型PDF(本實驗室研制)、傳統(tǒng)PDF(廣州百特醫(yī)療用品有限公司)成分見表1。

表1 腹膜透析液(PDF)的成分

*：葡萄糖濃度分別為1.5%、2.5%、4.25%

HPMC的分離培養(yǎng)和鑒定 充分征得患者知情同意后，取無腎病患者腹部手術(shù)時大網(wǎng)膜切除標(biāo)本，摘除血管和脂肪組織，用無菌的PBS(pH=7.3)清洗網(wǎng)膜3次，然后將其剪成碎塊，按文獻方法分離獲得HPMC，然后用含10 % (v/v)胎牛血清，青霉素(100 U/ml)，鏈霉素(100 μg/ml)，氫化可的松(0.4 μg/ml)，L-谷氨酰胺(2 mmol/L)的M199完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HPMC。調(diào)整細胞密度為1×105/ml，滴管吹打均勻，接種到0.1%明膠包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細胞生長1～2周融合至單層時，用PBS洗培養(yǎng)瓶2次，加1 ml含EDTA的胰酶在37℃消化10～15 min，然后加3 ml含10 %胎牛血清的M199培養(yǎng)基終止消化，將細胞懸液收集于離心管，4℃ 200 ×g離心5 min，再用含10 %胎牛血清M199重懸細胞并調(diào)整細胞數(shù)為1×105/ml，接種到培養(yǎng)瓶中。傳代細胞經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，免疫組化鑒定抗細胞角蛋白抗體陽性，抗波形蛋白染色陽性，抗VIII因子抗體陰性，抗白細胞CD45抗體染色陰性，已鑒定的第3代HPMC用于實驗。

實時熒光定量PCR檢測HPMC凋亡和分化相關(guān)蛋白mRNA表達 取HPMC以1×105/ml接種于6孔板，每孔含培養(yǎng)基2 ml。細胞分為五組：(1)對照組(M199培養(yǎng)基)；(2)7.5%新PDF組；(3)1.5%PDF組；(4)2.5%PDF組；(5)4.25%PDF組，后三組為含不同葡萄糖濃度的傳統(tǒng)透析液。干預(yù)作用6 h。Real time PCR法檢測凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3、Bcl-2及纖維化相關(guān)基因TGF-β1、FN的相對表達量。

qPCR實驗步驟：抽提總RNA，測總RNA濃度和檢測其完整性，去除基因組DNA。打開Bio-Rad CFX Connect儀器蓋，放入樣品，開始運行程序，反應(yīng)程序為：(1)預(yù)變性94℃ 2 min，(2)變性94℃ 30s，(3)退火58℃ 30s，(4)延伸72℃ 30s，(5)讀板；第(5)步完成后又回到第(2)步，循環(huán)39次。繪制溶解曲線，95℃ 15s，然后從60℃向95℃每0.5℃升溫，時間間隔5 s，記錄一次熒光值。運行完畢后，取出樣品，按關(guān)閉Bio-Rad CFX Manager 3.0軟件、PCR儀電源開關(guān)?；虮磉_的相對定量用2-ΔΔCt法分析。

表2 所需引物

Bcl-2:B淋巴細胞瘤2基因;Bax:Bcl-2相關(guān)x蛋白質(zhì);Caspase-3:胱天蛋白酶3；TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長因子β1；FN：纖維連接蛋白；β-actin:β肌動蛋白

酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定細胞培養(yǎng)液中TGF-β1蛋白質(zhì)含量 細胞分組同上，不同PDF干預(yù)24h、48h后，收集培養(yǎng)細胞的上清，利用雙抗體夾心法檢測共培養(yǎng)體系中TGF-β1的蛋白水平。實驗開始前按照標(biāo)簽說明書配置所需試劑；加樣，用密封條密封孔板，室溫孵育2h；倒棄孔內(nèi)液體，加洗滌液，重復(fù)3次；加稀釋好的檢測抗體，密封孔板，室溫孵育2h；洗板，重復(fù)3次；每孔加100 μl鏈霉親和素-HRP，密封孔板，輕輕振蕩混勻，室溫孵育30 min；洗板，重復(fù)3次；每孔加入 100 μl的過氧化酶底物(TMB)，避光孵育10～20 min；每孔加入 100 μL終止液終止反應(yīng)，溶液顏色會從藍色變?yōu)辄S色。10 min內(nèi)用450 nm(參考波長630 nm)測OD值。

Western blot法鑒定不同PDF對HPMC凋亡和轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白的影響 實驗分組同上，不同PDF處理細胞24 h，制備蛋白樣品，然后用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax，Caspase-3，Bcl-2及轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白FN的表達量。

加入適量細胞裂解液后，收集蛋白樣品，繼續(xù)試驗或凍于-80℃?zhèn)溆谩⒄斩姿?Bicinchoninic acid，BCA )試劑盒(碧云天)試劑盒說明書進行蛋白定量檢測。Western blotting法分析蛋白樣品，首先配制SDS-聚丙稀酰胺凝膠，蛋白上樣，打開電泳儀電源，溴酚藍距膠下緣沿約0.5 cm處(45 min左右)停止。將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，電轉(zhuǎn)移完畢后，將膜浸沒于封閉液中緩慢搖蕩1 h。加入稀釋好的一抗，4℃慢搖過夜，取出膜用PBST浸洗三次。加入二抗，在搖床上室溫輕搖1 h，倒掉二抗用PBST浸洗膜三次。將A液和B液按1∶ 1體積配制成ECL反應(yīng)底物，作用2 min后吸去發(fā)光液，將膜用透明無色塑料薄膜包裹后置于暗盒。在暗室中，將X光片置于膜上，暗盒夾緊后曝光適當(dāng)時間，曝光后的膠片在顯影液中顯影。FluorChem8000成像儀(AlphaInnotech)拍攝顯影結(jié)果，最后用AlphaEaseFC軟件進行灰度分析。目的蛋白灰度值除以內(nèi)參蛋白灰度值，比值即為所測蛋白的相對含量。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0進行統(tǒng)計分析。計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或者One-Way ANOVA分析，組內(nèi)比較使用配對樣本t檢驗，以a=0.05作為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

qPCR檢測Bax，Caspase-3，Bcl-2，TGF-β1，F(xiàn)N基因的表達水平 凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2和轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白TGF-β1、FN的RNA相對表達量結(jié)果見圖1。與對照組比較，2.5%和4.25% PDF組的凋亡基因Bax、Caspase-3的mRNA表達量顯著增加(P<0.01)，凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表達量顯著減少(P<0.01)，有一定的葡萄糖劑量依賴性。7.5% 新型PDF組Bax、Caspase-3的mRNA表達量與2.5%和4.25%PDF組比較顯著減少(P<0.01)，而Bcl-2的mRNA表達量明顯增加(P<0.05)，結(jié)果表明新型PDF能有效減弱透析液引起的HPMC凋亡相關(guān)基因的活化。

圖1 不同PDF對HPMC凋亡和轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的影響PDF：腹膜透析液；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子β1；FN：纖維連接蛋白；直方圖為各個基因mRNA的相對表達量，以對照組為參照；n=3，*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

7.5%新型 PDF組TGF-β1、FN的mRNA表達量與對照組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。1.5%、2.5%、4.25% PDF組TGF-β1、FN的mRNA表達量呈葡萄糖劑量依賴性的增加，2.5%、4.25%葡萄糖濃度PDF的TGF-β1、FN相對表達量較新型PDF顯著上升，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果表明新型PDF對HPMC細胞纖維化相關(guān)基因激活能力低。

ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中TGF-β1蛋白表達量 不同PDF處理HPMC 24h和48h后，細胞分泌TGF-β1的蛋白量結(jié)果如圖2所示，2.5%和4.25% PDF作用24 h時，TGF-β1表達量顯著高于對照組，與7.5%新型PDF組比也明顯升高(P<0.05)。作用48h時，1.5%、2.5%、4.25% PDF呈現(xiàn)遞增式趨勢的上調(diào)TGF-β1，且表達量顯著高于7.5%新型PDF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明新型PDF對腹膜間皮細胞的轉(zhuǎn)分化激活較小。

圖2 PDF作用24h(A)、48h(B)后TGF-β1蛋白分泌量分析直方圖PDF：腹膜透析液；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子β1；n=3，*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

Western blot檢測Bax，Caspase-3，Bcl-2，F(xiàn)N的蛋白表達水平 免疫印跡法分析凋亡相關(guān)蛋白Bax，Caspase-3，Bcl-2，及纖維連接蛋白FN表達量及灰度分析結(jié)果見圖3。與對照組比較，傳統(tǒng)PDF組Bax、Caspase-3、FN的蛋白表達量呈葡萄糖劑量依賴性的顯著增加(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達量顯著減少(P<0.01)。與對照組比較，7.5%新型PDF組Bax、Caspase-3、Bcl-2、FN的蛋白表達無差異性(P>0.05)。7.5% 新型 PDF組Bax、Caspase-3、FN的蛋白表達量明顯低于傳統(tǒng)PDF組(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達量顯著高于傳統(tǒng)PDF組(P<0.01)。免疫印跡分析結(jié)果與基因水平結(jié)果相符，表明新型PDF對HPMC細胞凋亡蛋白Bax、caspase-3的活化較小，使凋亡抑制蛋白Bcl-2保持正常表達水平，新型PDF有利于防止PD引起HPMC凋亡和纖維化的激活。

圖3 免疫印跡法分析凋亡和分化相關(guān)蛋白Caspase-3:胱天蛋白酶3；PDF：腹膜透析液； FN：纖維連接蛋白；β-tubulin:β微管蛋白；A：Bax、Caspase-3、Bcl-2凋亡蛋白的顯影圖和灰度分析直方圖；B：FN蛋白的顯影圖和灰度分析直方圖，n=3，**:P<0.01;***:P<0.001

討 論

腹膜纖維化是導(dǎo)致PD超濾衰竭的重要原因之一，本研究及既往的很多研究均表明，傳統(tǒng)乳酸鹽PDF尤其是高葡萄糖濃度乳酸鹽PDF可導(dǎo)致HPMC分泌產(chǎn)生大量致腹膜纖維化因子，逐漸導(dǎo)致腹膜纖維化及腹膜超濾衰竭的發(fā)生[8]。腹膜間皮細胞的生理功能主要為防御腹腔局部炎癥發(fā)生，促進溶質(zhì)轉(zhuǎn)運、超濾體內(nèi)多余水分，同時HPMC在預(yù)防腹膜纖維化的方面也發(fā)揮著非常重要的作用[9-10]。鑒于目前市面上PDF生物相容性較差，研發(fā)一種生物相容性較高的更合乎生理狀態(tài)的PDF成為目前的研究熱點。生物相容性高的PDF可減少腹膜間皮細胞的損傷，促進其增殖修復(fù)，從而提高PD質(zhì)量和延長PD時間[11]。

早在90年代初，多聚糖PDF已在國外臨床上出現(xiàn)，目前發(fā)達國家常用的多聚糖透析液為艾考糊精透析液。艾考糊精是水溶性葡萄糖聚合物，分子量大，超濾能力強，改善容量平衡，尤其適用于腹膜高轉(zhuǎn)運和超濾功能較差的患者；因其超濾過強容易損傷腹膜功能，并仍以乳酸鹽為緩沖堿，生物相容性欠佳。本實驗室研制的新型PDF在支鏈玉米淀粉中加入鹽酸后水解得到多聚糖，緩沖劑為碳酸氫鹽，其pH值可存在于正常生理范圍內(nèi)，增加其生物相容性。多聚糖及離子成分與碳酸氫鹽分別置于雙腔袋的各腔，作用于HPMC細胞時才混合，避免形成碳酸鈣沉淀。

Boulanger等[12]通過使用不同濃度的葡萄糖透析液培養(yǎng)HPMC，發(fā)現(xiàn)HPMC的凋亡率與透析液葡萄糖濃度成正比[11-12]。本研究亦發(fā)現(xiàn)加入高糖PDF后，HPMC凋亡因子Bax、Caspase-3的mRNA及蛋白表達水平顯著高于對照組，抑制凋亡因子Bcl-2的mRNA及蛋白表達水平顯著低于對照組，表明高糖PDF可能激活腹膜間皮細胞凋亡信號。

研究顯示傳統(tǒng)PDF組較對照組細胞凋亡因子Bax、Caspase-3表達增多，抑制凋亡因子Bcl-2表達降低[13]。本實驗室研制的新型PDF與傳統(tǒng)葡萄糖乳酸鹽PDF(1.5%，2.5%，4.25%)相比，細胞凋亡因子Bax、Caspase-3表達顯著減少，抑制凋亡因子Bcl-2表達顯著增多。新型PDF可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2的比值，維持細胞線粒體膜的通透性和結(jié)構(gòu)完整，抑制細胞色素C釋放，調(diào)節(jié)凋亡效應(yīng)分子如Caspase-3等的活性，達到抑制腹膜間皮細胞凋亡的作用及減少腹膜細胞外基質(zhì)增生和纖維化的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度葡萄糖PDF作用下，HPMC的TGF-β1、FN的mRNA和蛋白質(zhì)表達量較對照組明顯增加，表明高濃度葡萄糖PDF能誘導(dǎo)HPMC纖維化相關(guān)因子表達，從而誘導(dǎo)腹膜纖維化的發(fā)生。而使用新型PDF后，F(xiàn)N的mRNA表達量顯著降低，提示新型PDF具有潛在抑制HPMC纖維化的作用。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明相比傳統(tǒng)葡萄糖乳酸鹽PDF，新型多聚糖碳酸氫鹽PDF對腹膜間皮細胞凋亡信號活化低，其腹膜間皮細胞纖維化程度低，為臨床新型PDF研發(fā)提供了新的理論依據(jù)，有很好的臨床應(yīng)用前景，其具體作用機制有待進一步研究。

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(本文編輯 律 舟)

The effect of the new polysaccharide bicarbonate peritoneal dialysis fluid on apoptosis and fibrosis of peritoneal mesothelial cells

HUBo1,GONGWenyu1,YINLianghong1，ZHULing2

1DepartmentofNephrology,TheFirstAffiliatedHospitalofJINANUniversity,Guangzhou510630,China2DepartmentofOutpatient,TheFirstAffiliatedHospitalofJINANUniversity,Guangzhou510630,China

ZHULing(E-mail:hubo26@foxmail.com)

Objective：To compare the influence of new polysaccharide bicarbonate peritoneal dialysis fluids (PDF) on the human peritoneal mesothelial cells (HPMC) apoptosis and interstitial fibrosis factors. Methodology：Human peritoneal mesothelial cells (HPMC) were cultured in vitro，then treated with the new PDF and traditional PDF with different concentration of glucose (1.5%,2.5%,4.25%). Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of apoptotic factors Bax,Caspase-3 and apoptosis inhibition factor Bcl-2,TGF-β1 and FN. ELISA determined the secretion of TGF-β1 expression,western blot was used to detect apoptosis protein Bax,Caspase-3,apoptosis inhibition proteins Bcl-2 and FN. Results：After a certain time of stimulation on HPMC,the higher the glucose concentration (1.5%、2.5%、4.25%) of traditional PDF,Bax,Caspase-3,TGF-β1,FN increased more significantly,apoptosis inhibition factor Bcl-2 decreased more significantly. After stimulation with 2.5%,4.25% PDF,fibrosis related factor TGF-β1 and FN were much higher than that of the negative control group and new PDF group (P<0.05). Conclusion：The new polysaccharide bicarbonate peritoneal dialysis fluid is superior to the traditional peritoneal dialysis fluid,its effect on the apoptosis protein of peritoneal mesothelial cells is weaker than that of the traditional peritoneal dialysis fluid,peritoneal mesothelial cell fibrosis degree is aslo lower,which has good prospects for clinical application.

peritoneal dialysis fluid peritoneal mesothelial cells apoptosis peritoneal fibrosis

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.01.008

廣東高校工程技術(shù)研究(開發(fā))中心計劃(GCZX-A1104)

1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎臟內(nèi)科(廣州，510630)，2門診部

祝 琳(E-mail:hubo26@foxmail.com)

2016-08-22

? 2017年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有