黃芪提取物抑制胃癌細(xì)胞對(duì)腹膜間皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

那 迪，姜成鋼，徐 昊，徐 巖，王振寧，徐惠綿

腹膜轉(zhuǎn)移是影響胃癌手術(shù)預(yù)后的重要原因之一，是否轉(zhuǎn)移直接關(guān)系術(shù)后生存率［1］。腹膜轉(zhuǎn)移會(huì)顯著加劇胃癌晚期的進(jìn)程及惡化程度，然而轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不十分明晰。腹膜為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供了所需的炎性介質(zhì)，在癌腹膜轉(zhuǎn)移早期，由癌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間皮細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子作用于間皮細(xì)胞，使間皮細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)功能上發(fā)生改變，為腹膜轉(zhuǎn)移提供“土壤”［2］。間皮細(xì)胞通過(guò)抵御腫瘤釋放的因子來(lái)阻止腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)［3］。在對(duì)癌細(xì)胞浸潤(rùn)間皮細(xì)胞的研究中，Buck等把Walker 256癌細(xì)胞接種到間皮細(xì)胞受損的小鼠腹腔內(nèi)后，觀察到癌細(xì)胞在受損區(qū)域迅速種植生長(zhǎng)，而間皮細(xì)胞完好的小鼠卻很少發(fā)生轉(zhuǎn)移［4］。推測(cè)胃癌細(xì)胞可以破壞腹膜間皮細(xì)胞，從而形成腹膜轉(zhuǎn)移，而黃芪具有抗腫瘤作用［5］，可間接保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞?；谏鲜黾僭O(shè)，筆者擬建立胃癌細(xì)胞對(duì)腹膜間皮細(xì)胞的損傷模型，并檢測(cè)黃芪對(duì)腹膜間皮的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 試劑:黃芪提取液購(gòu)自正大青春寶公司;MTT、33258染料購(gòu)自Sigma公司;FCS、DMEM、PI均購(gòu)自Biosharp公司。細(xì)胞系:人胃癌細(xì)胞株MKN45由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室提供。人腹膜間皮細(xì)胞系由中南大學(xué)湘雅二院彭佑銘教授饋贈(zèng)(細(xì)胞株由法國(guó)巴黎TENON醫(yī)院Pierre RONCO教授建立)。

1.2 方法

1.2.1 光鏡下人腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 人腹膜間皮細(xì)胞系用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，至生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期分3組:對(duì)照組為只加DMEM培養(yǎng)液的間皮細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)組1為間皮細(xì)胞加胃癌MKN45細(xì)胞上清;實(shí)驗(yàn)組2為間皮細(xì)胞加胃癌MKN45細(xì)胞上清與黃芪提取液共培養(yǎng)。光鏡下觀察作用24 h后腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 MTT檢測(cè)黃芪作用后人腹膜間皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 分組同上。分別于共培養(yǎng)12、24、48 h后加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩 10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè) 490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸收度，檢測(cè)間皮細(xì)胞存活率，并繪制生長(zhǎng)曲線。存活率=實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 分組同上，培養(yǎng)24、48 h后用0.25%胰蛋白酶適度消化細(xì)胞，離心，分別制備各組單細(xì)胞懸液。移入新的1.5 mL離心管中，4℃ 500×g，離心5 min，形成細(xì)胞團(tuán)。小心移去上清液，冰預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，保證每管細(xì)胞數(shù)至少106個(gè)細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察間皮細(xì)胞凋亡情況 將蓋玻片置于6孔板底，間皮細(xì)胞(1×106/孔)接種過(guò)夜，分組同上。黃芪提取液濃度為100 μg/mL，作用24 h，PBS洗2次，加入固定液(甲醇與冰乙酸的體積比為3∶1)固定15 min，PBS洗2次，加Hoechst 33258熒光染料(0.5 mL)，37℃避光孵育20 min，熒光顯微鏡下觀察，照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，應(yīng)用Student's t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 對(duì)照組間皮細(xì)胞呈多邊形，排列完整，連續(xù)單層鋪路石樣特征(圖1A)。而接觸胃癌上清后的間皮細(xì)胞變小，形狀不規(guī)則，細(xì)胞連接松散，有的區(qū)域細(xì)胞大面積脫落形成暴露區(qū)(圖1B)。胃癌上清與黃芪提取液共培養(yǎng)組可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)目較單純胃癌上清組增多，較致密，偶見(jiàn)細(xì)胞脫落，未見(jiàn)大面積裸露區(qū)(圖1C)。

圖1 光鏡下腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

2.2 MTT檢測(cè)黃芪對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2于24、48 h間皮細(xì)胞存活率分別為47.32%、19.81%，67.25%、34.11%。各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)胃癌上清單獨(dú)或聯(lián)合黃芪作用下間皮細(xì)胞存活率比較

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃芪提取液培養(yǎng)的間皮細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞上清的抵御作用 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2在24、48 h凋亡率分別為12.45% ±7.42%、24.96% ±9.17%，54.10% ±14.19%、82.70% ±31.22%，38.20% ±4.23%、52.20% ±7.54%。兩組在各時(shí)間點(diǎn)的凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)胃癌上清單獨(dú)或聯(lián)合黃芪提取液作用下間皮細(xì)胞凋亡率比較(%)

2.4 Hoechst 33258熒光染色觀察間皮細(xì)胞凋亡在胃癌上清作用24 h后間皮細(xì)胞發(fā)生明顯改變，間皮細(xì)胞大量脫落，可見(jiàn)核溶解、碎裂、核固縮等凋亡特征(圖3A)。黃芪提取液與胃癌上清共同作用24 h后，比胃癌上清單獨(dú)作用組凋亡的細(xì)胞量明顯減少，間皮細(xì)胞排列規(guī)則，偶見(jiàn)凋亡特征(圖3B)。

圖3 Hoechst 33258熒光染色觀察間皮細(xì)胞凋亡變化(熒光顯微鏡×200)

3 討論

研究表明，胃癌細(xì)胞可以通過(guò)對(duì)間皮細(xì)胞的破壞來(lái)達(dá)到腹膜轉(zhuǎn)移的目的，Paget提出了“種子-土壤”學(xué)說(shuō)，即腹膜成為胃癌細(xì)胞種植適宜的“土壤”［6-7］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞上清作用間皮細(xì)胞后，間皮細(xì)胞體積變小，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞連接松散，甚至出現(xiàn)大面積脫落。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胃癌上清作用后，間皮細(xì)胞存活率顯著下降，說(shuō)明胃癌細(xì)胞具有抑制間皮細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)其凋亡作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)繼而發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡率在胃癌上清作用前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明間皮細(xì)胞凋亡在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中廣泛存在。Hoechst 33258熒光染色從形態(tài)學(xué)顯示，胃癌上清作用后間皮細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡特征，如核固縮、核溶解、核碎裂，甚至細(xì)胞大片缺失，出現(xiàn)“真空區(qū)”。

黃芪有對(duì)抗毒素B1誘發(fā)癌變的作用，可增加環(huán)磷酰胺CTX抗癌活性，并促進(jìn)因CTX所致機(jī)體造血功能損傷的恢復(fù)。黃芪總黃酮TFA可降解細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物生成，阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，防止細(xì)胞損傷和致突變，從而發(fā)揮抗癌作用。王曉瑜等［8］報(bào)道，黃芪提取液可通過(guò)調(diào)節(jié)花生四烯酸系統(tǒng)的代謝而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，防御腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性等機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤作用?；谝陨侠碚?，本研究將黃芪提取液與胃癌上清共培養(yǎng)，作用于間皮細(xì)胞，觀察其通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞作用而對(duì)間皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

光鏡觀察到黃芪提取物與胃癌細(xì)胞上清共同作用間皮細(xì)胞后，間皮細(xì)胞體積比正常間皮細(xì)胞稍變小，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞連接比較緊密，少量細(xì)胞缺失，但未出現(xiàn)大面積脫落區(qū)，比胃癌上清作用組改善明顯。MTT實(shí)驗(yàn)中，胃癌上清組與間皮細(xì)胞組存活率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明黃芪可抑制胃癌細(xì)胞對(duì)間皮細(xì)胞的破壞，起到保護(hù)作用。流式細(xì)胞檢測(cè)中，胃癌上清組及共培養(yǎng)組24、48 h凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明黃芪可保護(hù)間皮細(xì)胞呈時(shí)間依賴性。共培養(yǎng)組未出現(xiàn)特征性凋亡改變，只是細(xì)胞數(shù)較正常組稍減少，但未見(jiàn)裸露區(qū)，從形態(tài)學(xué)直觀說(shuō)明黃芪具有抑制腫瘤的促凋亡作用，為臨床用藥提供依據(jù)。本研究首次證明黃芪能夠保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞，間接證明其具有抑制胃癌細(xì)胞的促凋亡作用，在未來(lái)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的治療與預(yù)防中應(yīng)用前景廣闊，其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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