生酮飲食對癲癇大鼠海馬的保護作用及機制研究

蔣艷 王寶輝 賈濛濛 盧裕強 裘濤 章正祥 侯群

生酮飲食對癲癇大鼠海馬的保護作用及機制研究

蔣艷 王寶輝 賈濛濛 盧裕強 裘濤 章正祥 侯群

目的 探討生酮飲食（KD）對戊四氮（PTZ）點燃大鼠海馬損傷及哺乳動物雷帕霉素鈀蛋白（mTOR）通路表達的作用機制。方法 將55只雄性SD大鼠隔日腹腔注射PTZ制作癲癇動物模型直至完全點燃，另5只大鼠（空白對照組）腹腔注射0.9%氯化鈉溶液。完全點燃后的44只大鼠隨機分成4組，即正常食物（ND）+PTZ組、ND+PTZ+雷帕霉素（RAP）組、KD+PTZ組、KD+PTZ+RAP組，每組11只，均予側(cè)腦室置管并再次給予隔日腹腔注射PTZ，共5次；其中ND+PTZ+RAP組、KD+PTZ+RAP組給藥前30min側(cè)腦室注射RAP，ND+PTZ組、KD+PTZ組予以等量人工腦脊液。觀察并比較5組大鼠癲癇發(fā)作等級，海馬區(qū)神經(jīng)元密度，海馬區(qū)pS6、S6、pAkt、Akt、pAMPK、AMPK的表達（采用Western blot法檢測）。結(jié)果 KD+PTZ組大鼠癲癇發(fā)作等級明顯低于ND+PTZ組（P＜0.01）；KD+PTZ+RAP組發(fā)作等級明顯低于ND+PTZ組及ND+PTZ+RAP組（均P＜0.05）。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度：KD+PTZ組明顯大于ND+PTZ組（P＜0.05），KD+PTZ+RAP組大于ND+PTZ+RAP組（P＜0.05），ND+PTZ+RAP組大于ND+PTZ組（P＜0.05）。與空白對照組相比，ND+PTZ組pS6/S6、pAkt/Akt蛋白表達增加（均P＜0.05），其余4組pAMPK/AMPK蛋白表達均增高（均P＜0.05）；與ND+PTZ組相比，KD+PTZ組pS6/S6、pAkt/Ak蛋白表達均降低（均P＜0.05），pAMPK/AMPK蛋白表達增高（P＜0.05）；與ND+PTZ組相比，ND+PTZ+RAP組pS6/S6、pAkt/Akt蛋白表達均明顯降低（均P＜0.05）；與KD+PTZ組相比，KD+PTZ+RAP組pS6/S6、pAkt/Akt蛋白表達明顯降低（均P＜0.05）；與ND+PTZ+RAP組相比，KD+PTZ+RAP組pS6/S6蛋白表達明顯下降（P＜0.05），pAMPK/AMPK增高（P＜0.05）。結(jié)論 KD具有抗癲癇發(fā)作、減少神經(jīng)元丟失的作用，這種保護作用可能與其對mTOR通路的抑制有關(guān)，且其上游可能通過抑制Akt通路的磷酸化、激活A(yù)MPK通路的磷酸化來調(diào)節(jié)mTOR通路。

生酮飲食 哺乳動物雷帕霉素鈀蛋白信號通路 癲癇 海馬 神經(jīng)保護

生酮飲食（KD）是一種“高脂肪、低碳水化合物、適量蛋白”的飲食方案，目前用于治療難治性癲癇，但相關(guān)作用機制尚未清楚。學(xué)者推測KD對癲癇的神經(jīng)保護主要體現(xiàn)在減少癲癇發(fā)作的“外源性”干預(yù)以及通過“內(nèi)源性”信號通路調(diào)節(jié)作用來修復(fù)癲癇發(fā)作所破壞的正常神經(jīng)環(huán)路。哺乳動物雷帕霉素鈀蛋白（mTOR）通路是一個在生理和病理狀態(tài)下發(fā)揮不同作用的重要信號通路，在癲癇的發(fā)生中起著重要的作用，是KD“內(nèi)源性”神經(jīng)保護機制的重要通路。本研究選擇雄性SD大鼠，分別在戊四氮（PTZ）點燃后給予正常食物（ND）與KD，觀察并比較兩組大鼠癲癇發(fā)作的嚴重程度、海馬神經(jīng)元密度，檢測mTOR及其上游調(diào)控通路的關(guān)鍵蛋白表達，并與給予mTOR通路抑制劑雷帕霉素（RAP）的大鼠進行比較，以探討KD對癲癇大鼠海馬的保護作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 選擇出生后42d（P42）雄性SD大鼠，體重260～280g（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，清潔級Ⅱ級）；ND（Slac－M01大鼠繁殖料，上海斯萊克公司提供），KD（4∶1配比，商品名：ketoCal，上海Nutricia公司提供）。主要儀器：恒溫冰凍切片機（HM550，上海Microm公司），普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），立體定位儀（512600，美國Stoelting公司）；側(cè)腦室給藥套管（62003，深圳瑞沃德公司），Western blot裝置（上海Bio－Rad公司）。主要試劑：PTZ（#P6500，上海Sigma－Aldrich公司），雷帕霉素（#37094，上海Sigma－Aldrich公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司），pAkt（Ser473）兔單克隆抗體（#9271，1∶1 000，美國CST公司），Akt兔單克隆抗體（#4691，1∶1 000，美國CST公司），pAMPK（Thr172）兔單克隆抗體（#2535，1∶1 000，美國CST公司），AMPK兔單克隆抗體（#5831，1：1 000，美國CST公司），pS6（Ser240/244）兔單克隆抗體（#2215，1∶1 000，美國CST公司），S6兔單克隆抗體（#2217，1∶1 000，美國CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模 60只大鼠喂ND，隨機選5只為空白對照組（0.9%氯化鈉溶液，腹腔注射，1次/48h）；其余55只大鼠予PTZ點燃（35mg/kg，腹腔注射，1次/48h），每次注射后放入透明觀察箱20min，根據(jù)Racine發(fā)作等級評定標準[1]評價：無變化為0級，眨眼為1級，點頭為2級，單肢陣攣為3級，雙肢陣攣伴站立為4級，雙肢陣攣伴站立、倒地為5級。大鼠連續(xù)3次發(fā)作等級為4級及以上則為“被完全點燃”。一旦完全點燃，停止繼續(xù)注射PTZ，注射16次以上未完全點燃者不納入本實驗。共有44只大鼠完全點燃，隨機分為4組，即ND+PTZ組（喂ND）、ND+PTZ+RAP組（喂ND）、KD+PTZ組（喂KD）、KD+PTZ+RAP組（喂KD），每組11只。

1.2.2 側(cè)腦室置管給藥 空白對照組、ND+PTZ組、ND+ PTZ+RAP組、KD+PTZ組、KD+PTZ+RAP組予戊巴比妥鈉麻醉并固定于立體定位儀上，根據(jù)大鼠腦圖譜[2]，將腦室給藥套管插入右側(cè)側(cè)腦室（前囟后0.8mm，右側(cè)旁開1.5mm，深度3.8mm）并通過牙科水泥固定于顱骨，術(shù)后大鼠休養(yǎng)10d。空白對照組繼續(xù)予隔日腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其余4組繼續(xù)予隔日腹腔注射35mg/kg PTZ，共5次；觀察5組大鼠癲癇發(fā)作情況。通過PE管將側(cè)腦室套管連于微量注射泵，ND+PTZ+RAP組、KD+ PTZ+RAP組每次PTZ腹腔給藥前0.5h，將mTOR通路抑制劑RAP 5μl（濃度4ng/μl）緩慢泵入側(cè)腦室，空白對照組、ND+PTZ組、KD+PTZ組側(cè)腦室泵入等量人工腦脊液。

1.2.3 海馬神經(jīng)元計數(shù) 每組取5只大鼠行尼氏染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)元。行為學(xué)實驗結(jié)束后予過量水合氯醛麻醉，以100ml PBS液、200ml 4%多聚甲醛溶液依次灌注后立即取腦，置入4℃4%多聚甲醛過夜，置于30%磷酸蔗糖溶液1～2d至標本沉底。行冠狀冷凍切片（厚10μm），每個腦組織從前囟向后3.0、3.2、3.4、3.6、3.8mm各取一張。用0.1%焦油紫染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CAl、CA3及DG區(qū)錐體細胞形態(tài)，計算單位面積下完整的錐體細胞數(shù)。

1.2.4 mTOR通路相關(guān)蛋白表達檢測 每組取5只大鼠，末次PTZ給藥后2h使用過量水合氯醛麻醉后直接斷頭，快速取右側(cè)海馬置入液氮速凍。Western blot時將組織剪碎，加入100μl預(yù)冷的裂解液、適量10%蛋白酶抑制劑Cocktail和磷酸酶抑制劑，冰上勻漿及離心后取上清液行總蛋白定量。將上清液與6×上樣緩沖液混合后，沸水浴加熱5min，離心取上清液。于4℃凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移lh至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉溶液4℃封閉過夜，加入一抗體室溫孵育2h，TFBS洗膜3次，每次10min；加入HRP標記的2抗，室溫孵育膜2h，TBS洗膜4次，每次15min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。所有計量資料符合正態(tài)分布，用表示。癲癇發(fā)作等級采用多組重復(fù)測量資料的雙因素方差分析（Two-way ANOVA），兩兩比較采用Bonferroni法；海馬神經(jīng)元密度和Western blot結(jié)果采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t法。

2 結(jié)果

2.1 KD對癲癇發(fā)作的影響 完全點燃后繼續(xù)予PTZ，KD+PTZ組癲癇發(fā)作等級低于ND+PTZ組（P＜0.05）；KD+ PTZ+RAP組發(fā)作等級分別低于ND+PTZ組、ND+PTZ+ RAP組（均P＜0.05）；ND+PTZ+RAP組與ND+PTZ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；KD+PTZ+RAP組與KD+ PTZ組比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

2.2 KD對海馬區(qū)神經(jīng)元密度的影響 海馬CA1區(qū)代表性尼氏染色結(jié)果見圖2。4組大鼠點燃后海馬CA1、CA3及DG區(qū)神經(jīng)元較空白對照組均有不同程度的丟失（均P＜0.05），CA1區(qū)：KD+PTZ組神經(jīng)元密度大于ND+PTZ組（P＜0.01），KD+PTZ+RAP組神經(jīng)元密度大于ND+PTZ+RAP組（P＜0.05），ND+PTZ+RAP組神經(jīng)元密度大于ND+PTZ組（P＜0.05），KD+PTZ+RAP組與KD+PTZ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CA3、DG區(qū)點燃后4組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

圖1 5組大鼠點燃繼續(xù)予PTZ的發(fā)作等級

表1 5組大鼠海馬CA1、CA3及DG區(qū)神經(jīng)元密度比較（個/mm2）

圖2 5組大鼠海馬CA1區(qū)光學(xué)顯微鏡下所見（a：空白對照；b：ND+PTZ；c：ND+PTZ+RAP；d：KD+PTZ；e：KD+PTZ+RAP；尼氏染色，×40）

2.3 KD對mTOR通路的影響 與空白對照組相比，ND+PTZ組pS6/S6蛋白表達明顯增加（P＜0.05），提示癲癇發(fā)作可激活mTOR通路。與ND+PTZ組相比，KD+ PTZ組pS6/S6蛋白表達降低（P＜0.05），提示KD可激活mTOR通路。加入RAP后，與空白對照組相比，KD+PTZ+RAP組、ND+PTZ+RAP組pS6/S6蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）；KD+PTZ+RAP組較KD+PTZ組明顯降低（P＜0.05）；ND+PTZ+RAP組較ND+PTZ組明顯降低（P＜0.05）；KD+PTZ+RAP組較ND+PTZ+RAP組明顯降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 5組大鼠海馬組織pS6/S6蛋白表達（a：Western blot電泳圖；b：空白對照組、ND+PTZ組、KD+PTZ組、ND+PTZ+RAP組、KD+PTZ+RAP組相對表達量分別為 1.00±0.09、1.18±0.05、1.00±0.42、0.79±0.06和0.45±0.04）

與空白對照組相比，ND+PTZ組pAkt/Akt蛋白表達明顯增高（P＜0.05），提示癲癇發(fā)作可激活A(yù)kt通路的磷酸化。與ND+PTZ組相比，KD+PTZ組pAkt/Akt蛋白表達明顯降低（P＜0.05），提示KD可抑制Akt磷酸化。加入RAP后Akt磷酸化進一步被抑制，KD+PTZ+RAP組pAkt/Akt蛋白表達較KD+PTZ組明顯降低（P＜0.05），ND+PTZ+RAP組較ND+PTZ組明顯降低（P＜0.05）；KD+PTZ+RAP組與ND+PTZ+RAP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 5組大鼠海馬組織pAkt/Akt蛋白表達（a：Western blot電泳圖；b：空白對照組、ND+PTZ組、KD+PTZ組、ND+PTZ+RAP組、KD+PTZ+RAP組相對表達量分別為 1.00±0.09、1.20±0.06、0.92±0.05、0.74±0.07和0.61±0.46）

與空白對照組相比，其余4組大鼠點燃后pAMPK/ AMPK蛋白表達均明顯增高（均P＜0.05），提示癲癇發(fā)作可激活A(yù)MPK通路磷酸化。與ND+PTZ組相比，KD+ PTZ組pAMPK/AMPK蛋白表達增高（P＜0.05），提示KD可激活A(yù)MPK通路。加入RAP后，KD+PTZ+RAP組pAMPK/AMPK蛋白表達較ND+PTZ+RAP組增高（P＜0.05）；KD+PTZ+RAP組與KD+PTZ組、ND+PTZ+RAP組與ND+PTZ組分別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖5。

圖5 5組大鼠海馬組織pAMPK/AMPK蛋白表達（a：Western blot電泳圖；b：空白對照組、ND+PTZ組、KD+PTZ組、ND+PTZ+RAP組、KD+PTZ+RAP組相對表達量分別為1.00±0.08、1.35±0.12、1.69±0.07、1.57±0.10和1.94±1.43）

3 討論

本研究結(jié)果顯示KD可降低完全點燃大鼠的癲癇發(fā)作等級，提示KD有抗癲癇發(fā)作作用；這與Hansen等[3]研究結(jié)果一致。癲癇發(fā)作可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，而KD能減少點燃大鼠CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失；該結(jié)果與筆者前期在慢性杏仁核點燃模型中發(fā)現(xiàn)KD減少海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失相一致[4]，亦支持前期“在PTZ模型中發(fā)現(xiàn)KD對認知的保護作用”的研究結(jié)果[1]。

在生理情況下，mTOR信號通路上游調(diào)節(jié)因子主要包括機體營養(yǎng)、能量狀態(tài)、生長因子和應(yīng)激等[5]；在病理情況（創(chuàng)傷性腦損傷、缺氧、應(yīng)激等）下，mTOR信號通路被激活，下游多條通路被激活，可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)突觸可塑性及神經(jīng)元存活[6-7]。目前在多種與癲癇高度相關(guān)的疾病（結(jié)節(jié)性硬化、局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良等）中觀察到mTOR信號通路發(fā)生改變，并在多種癲癇動物模型中證實該信號通路激活具有促進癲癇形成的作用[8-10]。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)在急性PTZ給藥模型中急性發(fā)作后數(shù)小時內(nèi)mTOR通路激活，而慢性期無效。在KA模型中，mTOR通路激活呈雙時相。本研究顯示完全點燃大鼠末次PTZ給藥后2h海馬mTOR通路關(guān)鍵蛋白pS6的表達增加，提示mTOR通路被激活；KD+PTZ組海馬pS6表達低于ND+PTZ組，提示KD抑制了部分mTOR通路的激活。以上結(jié)果與McDaniel等[12]在KA模型中的研究結(jié)果相一致。KD是一種能量及營養(yǎng)狀況相對缺乏的飲食，它能降低胰島素水平，對mTOR通路具有抑制。本研究同時檢測了上游Akt、AMPK兩條主要可能影響mTOR通路的調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)pAkt在癲癇發(fā)作后增高，給予KD后pAkt的增高被抑制，可見pAkt與pS6的變化趨勢一致，提示pAkt在KD抑制mTOR通路的過程中起到正調(diào)控mTOR通路的作用。pAMPK在顱內(nèi)的表達存在爭議，McDaniel等[12]研究發(fā)現(xiàn)在生理狀態(tài)下KD僅增加肝臟pAMPK，對腦內(nèi)pAMPK無影響，但Genzer等[13]發(fā)現(xiàn)給予KD后腦內(nèi)pAMPK增加了約40%。本研究結(jié)果顯示在PTZ點燃這一病理狀態(tài)下，海馬的pAMPK在發(fā)作后增高，推測其目的是促進細胞內(nèi)ATP的供應(yīng)，這種增高可能與癲癇發(fā)作引起大量的能量消耗有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示給予KD后pAMPK進一步增加，這與Jeon等[14]在小鼠KA模型中發(fā)現(xiàn)KD下調(diào)pAM PK相反，筆者推測pAMPK的激活可能具有雙重作用，即Jeon等[14]在給KA前就給予KD，反映的是pAMPK在KD的抗癲癇形成過程中的改變，此時pAMPK的增高是一種有害因素，予KD來抑制AMPK磷酸化，從而起到神經(jīng)保護的作用；然而本研究先將大鼠點燃，再給予KD，測定的是pAMPK在KD的抗癲癇發(fā)作中的表達，此時pAMPK的增高是一種保護作用，它能有效負調(diào)控mTOR通路，減少下游的細胞死亡，起到神經(jīng)保護作用。

由于PAP的劑量、動物模型及研究方法不同，目前對RAP通過抑制mTOR通路影響癲癇發(fā)作和癲癇發(fā)生的研究結(jié)果存在差異。Zeng等[10]在KA模型中發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作早期給予RAP能有效抑制神經(jīng)元死亡，從而抑制癲癇的發(fā)生；晚期給予RAP雖阻斷mTOR的慢性激活，減少苔蘚纖維發(fā)芽，但對減少神經(jīng)元死亡無效。Guo等[15]認為RAP預(yù)先處理可能比RAP后處理更能有效地保護神經(jīng)元，且RAP預(yù)先處理并非通過直接影響神經(jīng)元的興奮性起作用。本研究比較了KD和RAP后處理對癲癇發(fā)作及海馬神經(jīng)元的影響，發(fā)現(xiàn)KD可抑制癲癇發(fā)作，對海馬神經(jīng)元有保護作用，RAP后處理對ND組神經(jīng)元數(shù)量亦有保護作用，但RAP是否參與KD對海馬神經(jīng)元的保護效應(yīng)仍缺乏直接的依據(jù)，且RAP對ND、KD癲癇發(fā)作均無直接作用，故KD可能在減少癲癇損傷方面較RAP更有優(yōu)勢。

綜上所述，本研究顯示KD在戊四氮點燃模型中具有抗癲癇發(fā)作、抗神經(jīng)元丟失的保護作用，可能與其對mTOR通路的抑制有關(guān)，且其上游可能通過抑制Akt通路的磷酸化及激活A(yù)MPK通路的磷酸化來調(diào)節(jié)mTOR通路。

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Ketogenic diet attenuates hippocampus injury in pentylenetetrazol-kindled seizure and its relation to mammalian target of rapamycin pathway suppression in rats

JIANG Yan,WANG Baohui,JIA Mengmeng,et al.Department of Neurology,Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310006,China

Ketogenic dietmTOR signaling pathway Seizure Hippocampus Neuroprotection

2016-11-02）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.12.2016-1784

國家自然科學(xué)基金項目（81301113、81302938）；浙江省自然科學(xué)基金項目（LY16H270002）

310006 杭州，浙江省中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（蔣艷、賈濛濛、盧裕強、裘濤、章正祥、侯群），中心實驗室（王寶輝）

侯群，E-mail：houqun168@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of ketogenic diet on hippocampus injury in pentylenetetrazol-kindled seizure and its relation to mammalian target of rapamycine(mTOR)pathway in rats. Methods The PTZ-kindled seizure model was induced by intra-ventricular infusion of 35mg/kg pentylenetetrazol(PTZ)in male Sprague-Dawley(SD)rats.Forty four rats, in which the seizure was fully kindled,were divided into 4 groups with 11 rats in each group.Rats in ND+PTZ and ND+PTZ+RAP groups were fed with normal diet,while those in KD+PTZ and KD+PTZ+RAP were fed with ketogenic diet.The mTOR pathway inhibitor rapamycin(RAP)was given to rats in ND+PTZ+RAP and KD+PTZ+RAP groups by intra-ventricular infusion 30min before PTZ injection.The seizure stages and the neuron in hippocampal CA1,CA3 and DG regions were counted.And the expressions of pS6,S6,pAkt,Akt,pAMPK and AMPK were detected by Western blot. Results The seizure stage of the kindled rats in the KD+PTZ group was lower than that of ND+PTZ group significantly(P＜0.05).The stages of KD+PTZ+RAP group were lower than those of ND+PTZ and ND+PTZ+RAP groups significantly(P＜0.05).The density of neuron in hippocampal CA1 subarea in KD+PTZ group was higher than ND+PTZ group significantly(P＜0.05),and the density of KD+PTZ+RAP was higher than ND+PTZ+RAP group(P＜0.05).Additionally,the density of ND+PTZ+RAP was higher than ND+PTZ(P＜0.05).Western blot result shows that the expression of phosphor-S6 to total S6(pS6/S6)and phosphor-Akt to total Akt(pAkt/Akt)was increased in ND+PTZ group compared to control(P＜0.05).The expression levels of phosphor-AMPK to total AMPK (pAMPK/AMPK)in all kindledgroups were higher than those of non-kindled control groups(P＜0.05).Compared to the ND+PTZ group,the expression levels of pS6/S6 and pAkt/Akt were decreased (P＜0.05),while the pAMPK/AMPK was increased in KD+PTZ group (P＜0.05). Compared to the KD+PTZ group,the expression of pS6/S6 and pAkt/Akt in KD+PTZ+RAP group were decreased(P＜0.05). Similarly,compared to the ND+PTZ group,the expression of pS6/S6 and pAkt/Akt in ND+PTZ+RAP group was also significantly decreased (P＜0.05).Moreover,compared to ND+PTZ+RAP,the expression level of pS6/S6 in KD+PTZ+RAP group was decreased significantly(P＜0.05),while the expression level of pAMPK/AMPK was increased(P＜0.05). Conclusion Our study indicated that ketogenic diet has the anti-seizure and neuronal protective effect in PTZ kindled rat model,which may be related to the mTOR pathway suppression.Moreover,the mTOR pathway is modulated by both the inhibition of Akt and activation of AMPK pathway.