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      原花青素對Glu-Asn體系中丙烯酰胺的抑制作用研究

      2017-06-23 11:59:47周夢舟關(guān)亞飛
      食品工業(yè)科技 2017年11期
      關(guān)鍵詞:蓮房抗氧化性丙烯酰胺

      丁 城,周夢舟,關(guān)亞飛,吳 茜,*

      (1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430068;2.武漢市華測檢測技術(shù)有限公司,湖北武漢 430068)

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      原花青素對Glu-Asn體系中丙烯酰胺的抑制作用研究

      丁 城1,周夢舟1,關(guān)亞飛2,吳 茜1,*

      (1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430068;2.武漢市華測檢測技術(shù)有限公司,湖北武漢 430068)

      本文選取荔枝原花青素(LPPC)和蓮房原花青素(LSPC)進行丙烯酰胺抑制作用的研究。實驗發(fā)現(xiàn)兩種原花青素的濃度-抑制率關(guān)系均呈非線性關(guān)系,當(dāng)LPPC和LSPC的添加量分別0.5 mg·mL-1和0.1 mg·mL-1時,丙烯酰胺的抑制率達到最大,分別為53.01%±5.62%和76.60%±3.20%;同時也探討了體系中抗氧化性、色度和類黑精含量與抑制率的關(guān)系。結(jié)果表明體系抗氧化性越大,丙烯酰胺的抑制率就越高;白度越大,丙烯酰胺抑制率就越大;類黑精含量越大,丙烯酰胺的抑制率反而越低??傮w來說,原花青素能顯著地抑制丙烯酰胺的形成。

      原花青素,荔枝原花青素,蓮房原花青素,丙烯酰胺

      1994年,國際癌癥研究署(International Agency for Research on Cancer,IARC)就將丙烯酰胺列為2A組“人類可能的致癌物”[1]。丙烯酰胺具有較強的滲透性,可通過呼吸道、消化道以及皮膚和黏膜等快速進入人體內(nèi)引起中毒[2]。動物實驗和長期暴露量實驗表明,它主要具有神經(jīng)毒性[3]、生殖毒性[4]、遺傳毒性[5]以及致畸性等。

      國際上關(guān)于丙烯酰胺的抑制方法,已經(jīng)有了較為系統(tǒng)的研究。Pedreschi等發(fā)現(xiàn)薯條在熱燙之前于1.0%的食鹽溶液中浸泡可顯著的降低丙烯酰胺含量[6];Cheng等探討了六種水果(蘋果、藍莓、山竹、龍眼、白心火龍果和紅心火龍果)提取物對Glu-Asn體系中丙烯酰胺的形成的影響,發(fā)現(xiàn)蘋果提取物能顯著抑制丙烯酰胺的形成[7];Kotsiou等人發(fā)現(xiàn)在Glu-Asn體系中添加牛至酚酸提取物可以降低49%的丙烯酰胺含量,而橄欖油酚酸提取物增加了48%的丙烯酰胺含量[8];此外,Zhang的研究證實了屬于天然產(chǎn)物提取物的竹葉黃酮和綠茶提取物能夠顯著的降低Glu-Asn體系中丙烯酰胺的形成[9]。

      19世紀末人們研究發(fā)現(xiàn)許多高等植物的葉、果、花內(nèi)的無色物質(zhì)在酸作用下生成紅色的產(chǎn)物,從而解開了原花青素的研究序幕。凌智群等人發(fā)現(xiàn)蓮房原花青素(procyanidin of lotus seedpod,LSPC)和荔枝原花青素(procyanidin of litchi pericarp,LPPC)為成熟的蓮房花托和荔枝皮中主要成分,并且成功將其分離。從中分離了蓮房原花青素(procyanidin of lotus seedpod,LSPC)和荔枝原花青素(procyanidin of litchi pericarp,LPPC)為它們的主要成分,同時證明了它們具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能[10-11]。

      LSPC和LPPC對丙烯酰胺的抑制作用并無報道,因此,本文以LSPC和LPPC為研究對象,探討原花青素對丙烯酰胺的抑制作用,結(jié)合濃度—抑制率關(guān)系,確定最佳添加劑量水平,然而美拉德反應(yīng)中的產(chǎn)物類黑精與丙烯酰胺的生成具有一定關(guān)系,因此本文也研究抗氧化性、類黑精含量以及色度與抑制率的關(guān)系和原花青素對體系丙烯酰胺生成的抑制作用。

      1 材料與方法

      荔枝原花青素(99.56%)和蓮房原花青素(100.89%,以標(biāo)準(zhǔn)品葡萄籽原花青素濃度為參照,用鹽酸正丁醇法測定荔枝原花青素和蓮房原花青素含量) 實驗室自己提取;丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(>99.9%) 德國Dr.E公司;D-(±)-水合葡萄糖、L-水合天門冬酰胺、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、正己烷:國藥集團化學(xué)試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽、2,4,6-三(2-吡啶基)-S-三嗪(TPTZ) 美國Sigma公司;竹葉抗氧化物 浙江大學(xué)生物工程和食品科學(xué)學(xué)院提供 島津LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司;SupercleanTMENVITM-18固相萃取小柱(3 mL:美國Superclean公司;Waters Atlantis? T3色譜柱 美國Waters公司;0.22 μm水系針筒式微孔濾膜過濾器:上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司;Milli-Q水純化系統(tǒng) 法國Millipore公司;CR-400色彩色差計 日本柯尼卡美能達公司;UV-2000型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司等。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 荔枝原花青素和蓮房原花青素提取 參考文獻[12-13],荔枝原花青素:將粉碎后的荔枝皮,按照料液比1∶20(w/v)加入80%乙醇,在溫度50 ℃下,提取120 min,提取3次,將提取液過濾后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇;蓮房原花青素:將粉碎后的蓮房,加入果膠酶和纖維素酶進行酶解反應(yīng),然后用65%乙醇,在55 ℃下,提取120 min,抽濾得提取液,在50 ℃下,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙醇蒸出。

      1.2.2 葡萄糖-天門冬酰胺(Glu-Asn)模擬體系的建立 配制pH8.0的0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(Na2HPO4∶NaH2PO4=94.7∶5.3),繼續(xù)用緩沖液分別配制0.2 mol·L-1的Asn溶液和0.2 mol·L-1的Glu溶液置于4 ℃冰箱備用。采用逐級稀釋法用緩沖液分別配制濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg·mL-1的荔枝原花青素(LPPC)和蓮房原花青素(LSPC)水溶液置于4 ℃冰箱備用,同時配制0.02 mg·mL-1的AOB溶液于4 ℃冰箱備用。向不銹鋼密封試管中分別加入500 μL Asn溶液和500 μL Glu溶液構(gòu)成0.1 mol·L-1等摩爾比的Glu-Asn模擬體系,設(shè)置空白對照組和原花青素實驗組,在實驗組向體系中分別加入相應(yīng)濃度的原花青素溶液,在對照組中加入相同體積的緩沖液,密封置入180 ℃恒溫油浴鍋中反應(yīng)30 min后取出,迅速置于冰浴阻止其繼續(xù)反應(yīng),各實驗重復(fù)三次。將反應(yīng)產(chǎn)物補足至10 mL,置于離心管中于4 ℃、11000 r/min下離心20 min,取2 mL上層清液過固相萃取柱(固相萃取柱事先用2 mL甲醇與2 mL水進行活化),棄去前2 mL收集后3 mL,過0.22 μm濾膜后進行高效液相色譜的測定,測條件為:流動相為甲醇∶0.1%甲酸水溶液=5∶95,流速1.0 mL·min-1,柱溫:30 ℃,檢測波長:205 nm。

      1.2.3 模擬體系終產(chǎn)物的抗氧化性的測定

      1.2.3.1 DPPH法測定抗氧化性 根據(jù)實驗所設(shè)計的濃度加入適量的Trolox溶液,用水補足至1 mL,在各試管中加入4 mL的DPPH·(50 mg·L-1,甲醇溶解)溶液,渦旋混勻后靜置1 h,于520 nm波長下測定吸光度,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性范圍為0~0.4 mmol·L-1。樣品測定時,準(zhǔn)確量取0.2 mL樣液測定,空白組加入等量的水溶液。以Trolox等價抗氧化能力(TEAC)來表示反應(yīng)終產(chǎn)物清除DPPH·的能力,μmol trolox/mL。

      接車后,首先詢問車主,得知該車為偶發(fā)性故障,曾經(jīng)在一家修理廠更換過點火線圈、火花塞,曾經(jīng)還因為漏油拆卸過發(fā)動機進行漏油處理。此故障多發(fā)生在正常行駛過程中,在更換點火線圈、火花塞后有所好轉(zhuǎn),但時間不長,又會出現(xiàn)發(fā)動機抖動、加速無力的現(xiàn)象,且發(fā)動機故障燈被點亮。

      1.2.3.2 FRAP法測定抗氧化性 配制40 mmol·L-1的鹽酸溶液、10 mmol·L-1的TPTZ溶液和300 mmol·L-1的醋酸鹽緩沖溶液(3.1 g冰醋酸納加16 mL冰醋酸加水定容至1 L)。向燒杯中依次加入上述三種溶液,體積比為1∶1∶10,配制成鐵離子還原能力(FRAP)反應(yīng)液備用。根據(jù)實驗所設(shè)計的濃度加入適量的Trolox溶液,用水補足至0.5 mL,加入4.5 mL反應(yīng)液渦旋靜置2 h,于595 nm波長下檢測吸光度,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性范圍為0~0.2 mmol·L-1。樣品測定時,準(zhǔn)確量取50 μL樣液測定,空白組加入等量的水溶液。以Trolox等價抗氧化能力(TEAC)來表示反應(yīng)終產(chǎn)物的鐵還原能力,μmol trolox/mL。

      1.2.3.3 ABTS法測定抗氧化性 配制7 mmol·L-1的ABTS和2.45 mmol·L-1的高硫酸鉀混合貯液,室溫黑暗中放置12~16 h,使ABTS+·達到氧化穩(wěn)定狀態(tài)。根據(jù)實驗所設(shè)計的濃度加入適量的Trolox溶液,用水補足至1 mL,加入4 mL反應(yīng)液渦旋靜置20 min,于730 nm波長下檢測吸光度,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性范圍為0~0.2 mmol·L-1。樣品測定時,準(zhǔn)確量取0.1 mL樣液測定,空白組加入等量的水溶液。以Trolox等價抗氧化能力(TEAC)來表示反應(yīng)終產(chǎn)物清除ABTS+·能力,μmol Trolox/mL。

      1.2.4 模擬體系終產(chǎn)物色度的測定 將反應(yīng)產(chǎn)物定容至10 mL,取一定量裝入石英比色皿,密封至無氣泡。以A4白紙作為本底,將比色皿水平放置,手持色差計垂直測定,記下L*、a*、b*值,并通過下述公式計算白度(WI)。每組實驗重復(fù)三次。

      1.2.5 模擬體系終產(chǎn)物類黑精含量的測定 將反應(yīng)產(chǎn)物用水稀釋10倍后,采用紫外分光光度計在470 nm下測定吸光度,通過Lambert-Beer定律計算樣品中類黑精的含量,其中類黑精的比例系數(shù)取282 L·mol-1·cm-1[14]。每組實驗重復(fù)三次。

      其中:C:類黑精的含量(mmol·L-1)A:吸光度;V:樣品定容體積(mL);E:類黑精的摩爾消光系數(shù)(282 L·mol-1·cm-1);b:比色皿寬度(cm)。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

      2 結(jié)果與分析

      2.1 原花青素抑制Glu-Asn體系中丙烯酰胺的量效關(guān)系

      將100 μL的各濃度原花青素溶液加入到1.0 mL體系中,故原花青素最終反應(yīng)濃度為實驗設(shè)計添加濃度的1/10。LSPC和LPPC對Glu-Asn體系中丙烯酰胺的濃度-抑制關(guān)系如圖1所示。結(jié)果表明:2種原花青素對丙烯酰胺的濃度-抑制率均呈非線性變化,這可能的一種原因是原花青素作為一種天然提取物,在長時間高溫加熱過程中本身的性質(zhì)也會發(fā)生變化,使其抑制作用發(fā)生改變[15];還有一種原因是原花青素作為一種抗氧化劑,其也符合抗氧化悖論,即濃度增大到一定程度時,抗氧化能力反而減小,因此對丙烯酰胺的抑制能力也隨之減小[16]。實驗中陽性對照物AOB(竹葉抗氧化物)能夠有效的抑制丙烯酰胺的產(chǎn)生[9],且與原花青素以及對照組均存在顯著性差異。抑制率如圖2所示,當(dāng)LSPC添加濃度為0.1 mg·mL-1時,抑制率達到最大,為76.60%±3.20%;LPPC添加濃度為0.5 mg·mL-1時,抑制率達到最大,為53.01%±5.62%。

      圖1 體系中丙烯酰胺的含量與LPPC和LSPC添加量的關(guān)系(n=3)Fig.1 Contents of acrylamide in reaction system by different addition levels of LPPC and LSPC(n=3)注:Con為空白對照組;PC為陽性對照組,不同的字母代表顯著性差異,p<0.05,圖6同。

      圖2 體系中丙烯酰胺的抑制率與LPPC和LSPC添加量的關(guān)系(n=3)Fig.2 Inhibition ratio of acrylamide in reaction system by different addition levels of LPPC and LSPC(n=3)

      2.2 原花青素對丙烯酰胺的抑制作用與體系中抗氧化性的關(guān)系

      選取三種方法測定體系中的抗氧化性。評價方法為以相應(yīng)的空白組的TEAC作為基準(zhǔn),計算2種原花青素在不同的添加劑量下反應(yīng)終產(chǎn)物TEAC的差值。三種測定方法的標(biāo)曲見圖3。DPPH·、FRAP、ABTS+·的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999。樣品的三組抑制率-ΔTEAC關(guān)系曲線如圖4所示。三種曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.8969(抑制率-ΔTEACDPPH)、0.9458(抑制率-ΔTEACFRAP)和0.9213(抑制率-ΔTEACABTS)。FRAP測定方法的相關(guān)系數(shù)最高,三種方法總體而言差別不大。這說明體系中丙烯酰胺生成量與抗氧性有密切關(guān)系,抗氧化性強,有利于原花青素抑制丙烯酰胺產(chǎn)生。從兩者的數(shù)值關(guān)系來看,體系中的抗氧化性降低,丙烯酰胺的抑制率逐漸下降。從反應(yīng)現(xiàn)象來看,丙烯酰胺在得到抑制的同時,反應(yīng)體系的顏色變淺,推測可能是美拉德反應(yīng)中類黑精的含量發(fā)生了變化,從而導(dǎo)致體系顏色的變化[17]。

      圖3 DPPH·、FRAP和ABTS+·標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)Fig.3 Standard curve and correlation coefficient of DPPH·,F(xiàn)RAP and ABTS+·

      圖4 原花青素對丙烯酰胺的抑制作用與模擬體系中抗氧化活性體系的關(guān)系Fig.4 Correlation between the effect of procyanidins on the reduction of acrylamide and the antioxidant properties of model注:AA為丙烯酰胺。

      2.3 原花青素對丙烯酰胺的抑制作用與體系中色度的關(guān)系

      表1 Glu-Asn模擬體系中荔枝原花青素添加濃度與色度的關(guān)系Table 1 Relationship between concentration of LPPC and chroma in Glu-Asn system

      原花青素對丙烯酰胺的抑制作用與色度的關(guān)系通過測定值L*、a*、b*和計算出的白度值WI表示,結(jié)果如表1(LPPC)和表2(LSPC)所示。實驗數(shù)值中,L*代表溶液顏色的亮度;a*代表紅綠,正值(+)越大,顏色越紅,負值(-)越小,顏色越綠;b*代表黃藍,正值(+)越大,顏色越黃,負值(-)越小,顏色越藍。隨著原花青素濃度的增大,兩組實驗中,L*值都逐漸變大,顏色越來越亮;a*逐漸減小,顏色由紅色慢慢轉(zhuǎn)向綠色;b*值逐漸減小,顏色由黃色慢慢轉(zhuǎn)向藍色,最終總體上而言,整個溶液的白度慢慢變深,即由深色慢慢轉(zhuǎn)為淺色。

      表2 Glu-Asn模擬體系中蓮房原花青素添加濃度與色度的關(guān)系Table 2 Relationship between concentration of LSPC and chroma in Glu-Asn system

      這也從側(cè)面說明了美拉德反應(yīng)中類黑精含量可能慢慢由高變低(扣除了原花青素顏色值)。當(dāng)LPPC添加濃度為0.5 mg·mL-1時丙烯酰胺抑制率最大,此時反應(yīng)體系的白度和空白組有顯著性差異(p<0.05),LSPC添加濃度為0.1 mg·mL-1時丙烯酰胺抑制率最大,此時反應(yīng)體系的白度和空白組也具有顯著性差異(p<0.05),結(jié)果表明丙烯酰胺的含量對白度有一定影響,體系中丙烯酰胺的含量下降,白度增加。

      圖5 葡萄糖/天門冬酰胺體系中AA抑制率與白度的關(guān)系Fig.5 The relationship between inhibition ratios of acrylamide and WI in Glu/Asn system注:A:LPPC,B:LSPC。

      同時由圖5可以看出,兩組實驗中丙烯酰胺抑制率與白度均成一定的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)分別為0.8359(LPPC)和0.9391(LSPC),LSPC組的線性關(guān)系要好于LPPC組,兩組走勢一致,均隨著白度增加抑制率變大。

      2.4 原花青素對丙烯酰胺的抑制作用與體系中類黑精含量的關(guān)系

      由圖6可以看出:隨著兩種原花青素添加濃度的增大,體系中類黑精的含量呈降低趨勢,LPPC組中0.05、0.5、1.0 mg·mL-1組與對照組有顯著性差異(p<0.05),LSPC組中0.1、0.5、1.0 mg·mL-1組與對照組有顯著性差異(p<0.05)。同時丙烯酰胺抑制率對類黑精含量的關(guān)系曲線如圖7所示。2種曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.7353和0.8489。

      圖6 原花青素的添加濃度與模擬體系中類黑精生成量的關(guān)系(n=3)Fig.6 Correlation between the concentrations of procyanidins and melanoidins contents in model system(n=3)

      圖7 原花青素對丙烯酰胺的抑制與模擬體系中類黑精含量之間的關(guān)系Fig.7 Correlation between the effect of procyanidins on the reduction of acrylamide and the melanoidins contents in model system注:(A)LPPC-類黑精關(guān)系曲線;(B)LSPC-類黑精關(guān)系曲線。

      3 結(jié)論

      丙烯酰胺的形成機理主要為還原糖和天門冬酰胺等氨基酸通過美拉德反應(yīng)(主要是Strecker反應(yīng))產(chǎn)生丙烯酰胺,其中Shiff堿(Shiff base):N-葡基胺是作為丙烯酰胺生成的主要前提物質(zhì)。在形成N-葡基胺的過程中伴隨著氧化還原反應(yīng)的進行,故理論上添加一定量的抗氧化劑可以抑制丙烯酰胺的生成。原花青素屬于多酚類物質(zhì),其多羥基結(jié)構(gòu)使其具備了很好的抗氧化、抗炎等功效。實驗結(jié)果表明:丙烯酰胺的生成情況與原花青素的添加含量有著密切的關(guān)系。兩者的濃度-抑制率關(guān)系都為非線性關(guān)系,當(dāng)添加含量在0.001~0.1 mg·mL-1時,丙烯酰胺的抑制率隨著LSPC含量的增大而升高,但當(dāng)繼續(xù)增加濃度時,丙烯酰胺的抑制率反而變小,LSPC的最大抑制率(76.60%)大于LPPC的最大抑制率(53.01%)。

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      Effect of the procyanidins of acrylamide inhibition in glucose-asparagine model system

      DING Cheng1,ZHOU Meng-zhou1,GUAN Ya-fei2,WU Qian1,*

      (1.Hubei University of Technology,Bioengineering and Food College,Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hhubei,Hubei Uuniversity of Technology,Wuhan 430068,China; 2.Measurement Testing Technology Co.,LTD.,Wuhan 430068,China)

      Procyanidin of litchi pericarp(LPPC)and procyanidin of lotus seedpod(LSPC)was chosen to study the inhibition of acrylamide in the model system. The result showed that two kinds of procyanidins concentration-inhibition rate relationships were nonlinear changes. Acrylamide inhibition rate reached the maximum of 53.01%±5.62% and 76.60%±3.20%,when the add amount of LPPC and LSPC were 0.5 mg·mL-1and 0.1 mg·mL-1. At the same time,the relationship between antioxidant systems,color and black fine class content and inhibition rate was also discussed. The stronger the antioxidant activity and whiteness of antioxidant systems,the better the acrylamide inhibition rate. In contrast,the higher the content of melanoidin,while the lower the inhibition rate of crylamide. It can be concluded that procyanidine significantly decreased the incidence of acrylamide.

      procyanidin;LPPC;LSPC;acrylamide

      2016-10-28

      丁城(1991-),男,碩士研究生,研究方向:食品微生物和發(fā)酵,E-mail:chaoren.hg@foxmail.com。

      *通訊作者:吳茜(1988-),女,博士,講師,研究方向:天然產(chǎn)物及食品生物技術(shù),E-mail:wuqianhugong@163.com。

      國家重點研發(fā)項目子課題項目(2016YFD0400701-05)。

      TS201.1

      A

      1002-0306(2017)11-0116-06

      10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.014

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