高純度Nisin的制備及工業(yè)生產(chǎn)條件的優(yōu)化

陳藝強(qiáng),李光進(jìn),金陳斌,許 峰,葉 艇,洪超群

(浙江新銀象生物工程有限公司,浙江臺(tái)州 317200)

?

高純度Nisin的制備及工業(yè)生產(chǎn)條件的優(yōu)化

陳藝強(qiáng),李光進(jìn),金陳斌,許 峰,葉 艇,洪超群

(浙江新銀象生物工程有限公司,浙江臺(tái)州 317200)

研究了一種制備高純度Nisin的方法。該方法采用弱酸性離子交換樹脂D113對(duì)Nisin濃縮液進(jìn)行靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)解吸,然后將解吸液進(jìn)行鹽析、抽濾、烘干、粉碎即得高純度Nisin。結(jié)果表明pH為6,吸附時(shí)間為90 min,解吸劑為1 mol/L、V鹽酸/V乙醇=1.25的鹽酸乙醇溶液,解吸速率為1 BV/h,鹽析所用氯化鈉濃度為23%為最佳條件,獲得的Nisin效價(jià)可達(dá)34000 IU/mg,收率達(dá)到67.45%,具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

高純度,乳酸鏈球菌素,離子交換

乳酸鏈球菌素又為乳酸鏈球菌肽,是一種由34個(gè)氨基酸殘基組成的抗菌肽[1],對(duì)Gram陽(yáng)性菌有抑制作用,被認(rèn)為是一種天然的,高效的食品防腐劑而廣泛應(yīng)用于各類食品[2-3]。但是目前市場(chǎng)上銷售的都是純度較低的乳酸鏈球菌素鹽制劑,效價(jià)約為1000 IU/mg,雜質(zhì)較多且鹽含量高,對(duì)食品風(fēng)味有一定的影響。而高純度乳酸鏈球菌素可用于解決此類問(wèn)題,例如高純?nèi)樗徭溓蚓貞?yīng)用于燕窩,海參,濃縮果汁等[4-5]。此外還可用于醫(yī)藥領(lǐng)域的研究。例如治療奶牛乳房炎[6],進(jìn)一步純化可用于頭、頸部鱗狀細(xì)胞癌癥的研究[7-8]。有關(guān)高純度Nisin制備的專利及文獻(xiàn)過(guò)去均有報(bào)導(dǎo)[9-11],但純度不是很高,嚴(yán)宇媛等人的工藝中Nisin效價(jià)只有28000 IU/mg,或者收率較低,葉萬(wàn)榮等人的工藝收率只有30%,成本較高,不適合工業(yè)生產(chǎn)。本文研究的高純度Nisin制備工藝在以期在保證純度的同時(shí)保證較高的收率,適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Nisin標(biāo)準(zhǔn)品(sigma),Nisin濃縮液 浙江新銀象生物工程有限公司，由發(fā)酵液過(guò)濾后濃縮而成;離子交換樹脂110,D 113,122 安徽三星樹脂科技有限公司;D M130,HZ-8,D61樹脂 上海華震科技有限公司;乙醇 分析純,杭州高晶精細(xì)化工有限公司;鹽酸 分析純,浙江中星化工試劑有限公司;氯化鈉 分析純,西隴化工股份有限公司;蒸餾水等試劑。

SHZ-88A水浴恒溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;DHG-9070A型恒溫干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BT 100-2J型蠕動(dòng)泵 longer pump;層析柱 5.3 cm×70 cm;DFY-300搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.2 靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)

1.2.1 樹脂的篩選 準(zhǔn)確量取預(yù)處理好的6種樹脂各10 mL分別倒入250 mL錐形瓶中(其中110,D113,122均轉(zhuǎn)為鈉型樹脂),加入pH為3的Nisin濃縮液50 mL,25 ℃下將錐形瓶置于振蕩頻率為60 r/min的搖床吸附4 h。然后抽濾,用蒸餾水洗滌樹脂,濾液取樣檢測(cè)。然后將樹脂加入到100 mL濃度為1 mol/L的鹽酸乙醇溶液中在相同條件下解吸。4 h后抽濾,取解吸液檢測(cè)。并按如下公式計(jì)算吸附量,吸附率,解吸率[12]。

式(1)

式(2)

式(3)

收率(%)=吸附解吸收率×鹽析收率

式(4)

其中:C0為初始溶液中Nisin濃度;CP為吸附平衡時(shí)溶液中Nisin的濃度;m為樹脂的質(zhì)量;V為吸附液體積;Cj為解吸液中Nisin的濃度;Vj為解吸液體積。

1.2.2 吸附pH的影響 分別取4 L效價(jià)為100000 IU/mL左右的Nisin濃縮液6份,分別加入800 mL D113樹脂,于常溫下各自在pH為3、4、5、6、7、8下進(jìn)行攪拌吸附。1.5 h后取樣檢測(cè)殘液中Nisin含量并計(jì)算吸附率。吸附完全后,分別上柱,動(dòng)態(tài)解吸。解吸液鹽析、抽濾、烘干、粉碎并檢測(cè)成品效價(jià)。

1.2.3 吸附時(shí)間的影響 分別取4 L效價(jià)約為100000 IU/mL左右的 Nisin濃縮液5份,加入800 mL D113樹脂,常溫下在pH6時(shí)分別攪拌15、30、45、60、90 min。分別取樣檢測(cè)殘液中Nisin效價(jià)。

1.2.4 解吸劑配比實(shí)驗(yàn) 計(jì)算并量取不同濃度的鹽酸與乙醇分別按體積比4∶1，2∶1，1.5∶1，1.25∶1，1.2∶1，1.1∶1，1∶1，1∶1.1，1∶1.3比例配成最終濃度為1 mol/L的鹽酸乙醇溶液,采用動(dòng)態(tài)解吸法對(duì)已吸附好樹脂進(jìn)行解吸,解吸時(shí)流速為1.0 BV/h,分別收集解吸液,檢測(cè)并記錄解吸收率。解吸液鹽析、抽濾、烘干粉碎并檢測(cè)成品效價(jià)。

1.2.5 解吸流速的影響 將V鹽酸/V乙醇=1.25的解吸劑分別以0.5,0.75,1.0,1.25,1.5 BV/h流速進(jìn)行解吸,分別收集解吸液,檢測(cè)并記錄解吸收率。吸液鹽析、抽濾、烘干粉碎并檢測(cè)成品效價(jià)。

1.2.6 吸附pH,解吸劑配比,解析流速的正交實(shí)驗(yàn) 考慮到吸附時(shí)間的交互作用較小,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上分別以吸附pH,解吸劑配比,解吸流速進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),因素水平如表1所示,分別以效價(jià)和收率為指標(biāo),得出高純度Nisin制備的最佳工藝條件。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3 鹽析實(shí)驗(yàn)

在最佳條件下吸附解吸,然后將解吸液分別加入15%、20%、23%、25%、27%、30%的氯化鈉鹽析,攪拌2 h。然后靜置12 h、抽濾、烘干、粉碎檢測(cè)效價(jià)并計(jì)算鹽析收率。

1.4 檢測(cè)方法

液體濃度與Nisin成品均采用GB1886.231-2016中的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂篩選結(jié)果

不同樹脂結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可以看出弱酸性樹脂的吸附量均大于強(qiáng)酸性樹脂的吸附量,這可能是由于Nisin以離子形式存在時(shí),強(qiáng)酸性樹脂吸附氫離子的能力要大于Nisin。而弱酸性陽(yáng)離子樹脂由于轉(zhuǎn)為鈉型之后,其對(duì)鈉離子的吸附選擇性要小于Nisin。從而造成它們的吸附容量差別很大。大孔吸附樹脂DM130由于其物理吸附性能以及依靠其孔徑大小而具有選擇性,其吸附量介于強(qiáng)酸性樹脂和弱酸性樹脂之間,理論上我們可以根據(jù)孔徑的大小選擇一種更為合適的樹脂,但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大孔樹脂解吸液中的雜質(zhì)含量并沒(méi)有降低,起不到除雜質(zhì)的作用,而離子交換樹脂能明顯降低雜質(zhì)的含量。弱酸性陽(yáng)離子樹脂中又以D113的吸附解吸性能較優(yōu),因?yàn)槠浼鎮(zhèn)浯罂讟渲奈阶饔煤碗x子交換能力,綜合以上因素考慮,選擇D113作為合適的吸附樹脂。

表2 樹脂的吸附解吸性能參數(shù)Table 2 Performance parameters of resin adsorption and desorption

2.2 吸附pH的影響

從圖1中看出隨著pH升高,效價(jià)不斷的升高,呈遞增狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH在4～5之間的時(shí)候有大量絮狀析出,絮狀物經(jīng)調(diào)pH重新溶解后檢測(cè)到里面含有部分Nisin。

圖1 吸附pH與效價(jià)、收率關(guān)系圖Fig.1 Relationship of adsorption pH,yield and potency

此絮狀物經(jīng)烘干稱量后發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量遠(yuǎn)大于相同效價(jià)的Nisin重量,推測(cè)其為雜蛋白,此pH區(qū)間為雜蛋白的等電點(diǎn)區(qū)間。而Nisin的等電點(diǎn)在9.5左右[13],當(dāng)pH超過(guò)5時(shí)雜蛋白以陰離子形式存在,不被樹脂吸附,相反Nisin卻能繼續(xù)被樹脂吸附。因此，當(dāng)pH3時(shí),樹脂的選擇性很差，而pH從3升至4時(shí)其效價(jià)差別較大，同時(shí)由于Nisin的穩(wěn)定性受pH影響[14],當(dāng)pH大于6時(shí),其收率急劇下跌,綜合考慮pH6作為吸附pH比較合理。

2.3 吸附時(shí)間的影響

考慮到吸附時(shí)間對(duì)成品效價(jià)影響不大,主要考察了其對(duì)吸附殘液效價(jià)的影響。結(jié)果如圖2所示。吸附時(shí)間為15 min時(shí),將近85%的Nisin已被吸附,之后延長(zhǎng)吸附時(shí)間,吸附速度明顯降低,90 min時(shí)溶液中的Nisin已被吸附完全。表明90 min作為最佳吸附時(shí)間較合理。

圖2 吸附殘液效價(jià)-時(shí)間圖Fig.2 Time profile of adsorption raffinate potency

2.4 解吸劑配比對(duì)高純度Nisin收率的影響

單純采用酸水或者乙醇均不能很好地將吸附在樹脂中的Nisin解吸下來(lái)。本文采用酸水與乙醇的混合溶液進(jìn)行解吸,解吸效果如圖3所示。V鹽酸/V乙醇比例在1附近時(shí),其收率較高,都在85%以上,比例為1.25時(shí)達(dá)到最高95.93%,比例大于1.25或小于0.91時(shí)均收率下降明顯。可能是D113具備離子交換和大孔樹脂的物理吸附能力,鹽酸比例的升高,氫離子濃度增大,從而使Nisin更多的被交換下來(lái),但同時(shí)又考慮到乙醇對(duì)大孔樹脂的解吸能力,所以其比例過(guò)高或者過(guò)低均不利于解吸。同時(shí)V鹽酸/V乙醇比例小于1.25時(shí)其效價(jià)較高,均在35000 IU/mL左右,比例大于1.25時(shí)效價(jià)下降明顯。效價(jià)隨著鹽酸用量的加大呈下降趨勢(shì),可能是雜質(zhì)所帶電荷與Nisin相同,但其吸附能力較Nisin更強(qiáng)。考慮到效價(jià)與收率的因素,V鹽酸/V乙醇=1.25是較為合適的解吸劑配比。

圖3 解吸劑配比與收率、效價(jià)關(guān)系圖Fig.3 Relationship of desorption rate,yield and potency

2.5 解吸流速對(duì)高純度Nisin收率的影響

分別以0.5,0.75,1.0,1.25,1.5 BV/h流速進(jìn)行解吸,結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出解吸速率對(duì)收率以及效價(jià)的影響并不是很大,但是在解吸速率為1.0 BV/h時(shí)收率為最高達(dá)到93.3%。

圖4 Nisin解吸流速、收率、效價(jià)關(guān)系圖Fig.4 Relationship of desorption flow,yield and potency

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

考慮到多因素的交互關(guān)系,設(shè)計(jì)了相關(guān)的正交實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,對(duì)效價(jià)來(lái)說(shuō)極差最大的是B,因素主次順序?yàn)锽>C>A,最優(yōu)組合為B1C2A3。對(duì)收率來(lái)說(shuō)因素主次順序?yàn)锽>A>C,最優(yōu)組合為B1C2A2。考慮到A因素在兩個(gè)指標(biāo)中的主次順序,我們選擇B1C2A2作為最佳組合,即吸附pH為6,解吸劑比例V鹽酸/V乙醇為1.25∶1,解吸流速為1.0 BV/h作為最佳工藝條件,此時(shí),效價(jià)為35105 IU/mg,收率為90.79%。

表3 吸附,解吸正交實(shí)驗(yàn)表Table 3 Orthogonal experiment table of Adsorption and desorption

2.7 鹽析實(shí)驗(yàn)

在以上正交實(shí)驗(yàn)最佳條件下吸附解吸,然后在解吸液中分別加入15%、20%、23%、25%、27%、30%的氯化鈉進(jìn)行鹽析,鹽析結(jié)果如圖5所示。鹽析成品效價(jià)隨著氯化鈉的加入量呈下降趨勢(shì),鹽析收率隨氯化鈉的用量呈上升趨勢(shì),當(dāng)氯化鈉的用量大于23%時(shí),收率變化不大,在23%時(shí)收率達(dá)到74.29%左右?？偸章蕿?0.79%×74.29%=67.45%,且此時(shí)Nisin效價(jià)達(dá)到34180 IU/mg,考慮到工業(yè)生產(chǎn)對(duì)收率的需求,選擇濃度為23%的氯化鈉來(lái)進(jìn)行鹽析。

圖5 不同氯化鈉濃度鹽析圖Fig.5 Effect of different NaCl concentration in salting out process

3 結(jié)論與討論

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,影響Nisin純度的主要因素有樹脂吸附時(shí)的pH、吸附劑配比、解吸速度以及鹽析時(shí)氯化鈉的用量,而這些因素均會(huì)影響到成品的收率,既考慮到純度要求,同時(shí)又考慮到工業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益,所以本實(shí)驗(yàn)選擇的工藝條件是:樹脂采用D113弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂,吸附pH為6,吸附時(shí)間90 min,解吸劑比例V鹽酸/V乙醇為1.25∶1,解吸流速為1.0 BV/h,23%的氯化鈉進(jìn)行鹽析。此工藝可獲得效價(jià)大于34000 IU/mg的Nisin粉,同時(shí)總收率能達(dá)到67.45%。獲得的Nisin可進(jìn)一步提純以用于醫(yī)藥領(lǐng)域,未來(lái)市場(chǎng)及其可觀。

[1]郭本恒.功能性乳制品[M].中國(guó)輕工業(yè)出版社,2001:332-346.

[2]張玉華,孟一.天然食品防腐劑-nisin的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2003,24(2):109-110.

[3]石小瓊,饒華明,張映斌，等.天然食品保鮮防腐劑nisin在豆腐保鮮上的研究應(yīng)用[J].食品添加劑,2004,11:130-131.

[4]朱露露,農(nóng)邵莊,李江闊，等. 兩種生物保鮮液對(duì)鮮活海參貯藏品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè),2015,36(6):128-132.

[5]夏云梯,潘立華,朱克美. 乳酸鏈球菌素(Nisin)的特性及在果汁欽料中的應(yīng)用[J].飲料工業(yè),2000,3(4):14-15.

[6]吳俊強(qiáng),曹立婷,胡松華. 乳酸鏈球菌素治療奶牛乳房炎效果觀察[C].獸醫(yī)臨床學(xué)術(shù)會(huì),2008:397-400.

[7]Pachiyappan Kamarajan,Takayuki Hayami,Bibiana Matte,et al. Nisin ZP,a Bacteriocin and Food Preservative,Inhibits Head and Neck Cancer Tumorigenesis and Prolongs Survival[J].PLOS ONE,2015 10(7):e0131008.

[8]Jae M. Shin,Islam Ateia,Jefrey R. Paulus,et al. Antimicrobial nisin acts against saliva derived multi-species biofilms without cytotoxicity to human oral cells[J]. Frontiers in Microbiology,2015,6:617.

[9]葉萬(wàn)榮,陳劍,許峰，等.一種高純度乳酸鏈球菌素的制備方法:中國(guó),101701034 B[P].2012-06-06.

[10]嚴(yán)宇媛,趙波,趙文杰，等. 一種高純度乳酸鏈球菌素的制備方法:中國(guó),102199200 B[P].2014-05-07.

[11]劉立毅,寧方紅,徐環(huán)昕，等.乳酸鏈球菌素Z純化脫色小試工藝研究[J].離子交換與吸附,2014,30(5):429-437.

[12]劉立毅,寧方紅,徐環(huán)昕，等.吸附樹脂對(duì)發(fā)酵上清液中nisin Z的吸附研究[J].中國(guó)調(diào)味品,2014(39):7-11.

[13]Yuan-Ching Tai,Pranav Joshi,Joseph McGuire,et al. Nisin adsorption to hydrophobic surfaces coated with the PEO-PPO-PEO triblock surfactant Pluronic ? F108[J]. NIH Public AccessAuthor Manuscript,2008 June 1;322(1):112-118.

[14]賈士儒.生物防腐劑[M].中國(guó)輕工業(yè)出版社,2009:34-35.

Preparation of high- purity Nisin and the optimization of industrial scale production conditions

CHEN Yi-qiang,LI Guang-jin,JIN Chen-bin,XU Feng,YE Ting,HONG Chao-Qun

(Zhe Jiang Silver-Elephant Bio-Engineering Company,Taizhou 317200,China)

In this study,a new method of preparation high-purity Nisin preparation was researched. The method adopted static adsorption and dynamic desorption of Nisin concentrated solution at a weak acidic ion exchange resin D113.The subsequent production process included salting out,suction filtration,drying and crushing to obtain high-purity Nisin. The results showed that the optimum condition was pH6,adsorption time 90 min,CDesorption agent=1 mol/L,VHCl/VEtOHl=1.25,desorption rate 1 BV/h,CNaCl=23% in salting out. The potency of Nisin attained through this procedure was 34000 IU/mg,total yield reached 67.45%.The method has bright prospect in industrial application.

high-purity;Nisin;ion exchange

2016-12-29

陳藝強(qiáng)(1966-),男,本科,工程師,研究方向:發(fā)酵產(chǎn)品工藝優(yōu)化,E-mail:chenyiq8668@163.com。

TS202

A

1002-0306(2017)11-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.045