凡納濱對蝦黏著斑激酶基因克隆與合并感染條件下的免疫應答

王 剛，孫成波,2

( 1．廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524025；2.廣東高校熱帶海產(chǎn)無脊椎動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524025 )

凡納濱對蝦黏著斑激酶基因克隆與合并感染條件下的免疫應答

王 剛1，孫成波1,2

( 1．廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524025；2.廣東高校熱帶海產(chǎn)無脊椎動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524025 )

采用RACE技術(shù)克隆凡納濱對蝦黏著斑激酶基因，利用相關軟件工具拼接、比對其序列，構(gòu)建進化樹，同時利用熒光定量技術(shù)分析了該基因的組織分布和合并感染下的免疫應答。試驗結(jié)果顯示，凡納濱對蝦黏著斑激酶基因 cDNA序列全長4919 bp，ORF片段長3036 bp，編碼1012個氨基酸。凡納濱對蝦黏著斑激酶基因具有蛋白激酶特征結(jié)構(gòu)域PTK和C端的對蝦黏著結(jié)構(gòu)域。熒光定量結(jié)果表明，凡納濱對蝦黏著斑激酶基因表達無組織特異性，眼部表達量最高，肌肉中表達量最低，可以被副溶血弧菌與白斑綜合癥病毒以及二者的合并感染誘導表達，表達量先升再降，整個試驗過程中合并感染組斑激酶表達量總是高于白斑綜合癥病毒單獨感染組。酶活測定結(jié)果表明，合并感染組酸性磷酸酶活力變化最活躍；試驗后期，弧菌單獨感染組堿性磷酸酶活力始終高于合并感染組，合并感染組過氧化物酶活力總是高于白斑綜合癥病毒單獨感染組；整個試驗過程中，弧菌單獨感染組超氧化物歧化酶活力始終高于其他兩個感染組。

凡納濱對蝦；副溶血弧菌；白斑綜合癥病毒；黏著斑激酶；合并感染；酶活力

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是中國對蝦養(yǎng)殖業(yè)重要的養(yǎng)殖對象。白斑綜合癥病毒是對蝦養(yǎng)殖業(yè)病害頻繁爆發(fā)最重要的病原之一，感染后對蝦的死亡率可達90%～100%[1]。除病毒病外，弧菌(Vibrio)也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見的病原體，通常是繼發(fā)感染中機會性感染者[2]。研究表明，不同密度的鰻弧菌(V.anguillarum)與一定含量白斑綜合癥病毒合并感染凡納濱對蝦，合并感染條件下死亡率總是高于白斑綜合癥病毒單獨感染，且病毒攜帶量高于白斑綜合癥病毒單獨感染條件下的病毒攜帶量[3]。這與筆者前期的研究及Corteel等[4]研究的一定含量的弧菌與白斑綜合癥病毒合并感染可以抑制白斑綜合癥病毒爆發(fā)的結(jié)果有所不同。此類現(xiàn)象在果蠅的研究中也有發(fā)現(xiàn)，感染了沃爾巴克氏體細菌(Wolbachia)的黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)可以抑制果蠅C型病毒的爆發(fā)[5]。此外Glaser等[6-7]也發(fā)現(xiàn)，感染了沃爾巴克氏體細菌的果蠅與埃及伊蚊(Aedesaegypti)具有更強的抗病毒感染能力，可以抑制西尼羅病毒與基孔亞熱病毒在機體內(nèi)的增殖。目前，在對蝦養(yǎng)殖中，細菌與病毒合并感染的研究較少，對于副溶血弧菌(V.prahaemolyticus)與白斑綜合癥病毒合并感染條件下對蝦免疫機制的研究尚未見報道。

面對水環(huán)境中各種病原體的威脅，對蝦通過各種免疫反應來阻止和抑制病原的入侵感染。非特異性免疫是甲殼動物的第一道防線，非特異性免疫系統(tǒng)可以通過信號轉(zhuǎn)導途徑激活體液和細胞免疫反應[8]，發(fā)生吞噬作用，釋放各類抗菌因子，激活酚氧化酶原系統(tǒng)[9]。其中對蝦黏著斑激酶在信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。斑激酶是一種非受體酪氨酸激酶，為integrin信號轉(zhuǎn)導途徑的下游信號分子，對蝦在白斑綜合癥病毒感染早期，通過提高血細胞斑激酶蛋白表達和磷酸化水平增強細胞黏附能力，促進細胞免疫能力來抵抗病毒入侵[11]。本研究中，筆者克隆了凡納濱對蝦黏著斑激酶基因cDNA的全長，探討了在副溶血弧菌與白斑綜合癥病毒單獨、合并感染條件下凡納濱對蝦黏著斑激酶基因的表達和各種免疫相關酶活力變化，以期為病毒病和弧菌病的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在廣東海洋大學無脊椎動物工程中心完成。健康凡納濱對蝦取自廣東海洋大學東海島生物研究基地，體長(7.66 ± 0.82) cm。對蝦取回后暫養(yǎng)于溫度(26 ± 1) ℃、鹽度25 ± 1的沙濾海水中，7 d后進行試驗。

RNA提取試劑盒為上海生物工程有限公司產(chǎn)品；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒pMD-18、熒光定量QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；RACE試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒均為Clontech公司產(chǎn)品；酶活力測定試劑盒購于南京建成公司；白斑綜合癥病毒來源于本實驗室保存于- 80 ℃的病毒粗提液；副溶血弧菌由廣東海洋大學水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室贈予。

1.2 方法

1.2.1 RACE模板制備

提取健康凡納濱對蝦鰓和腸部RNA，混合后按照說明書方法制備RACE模板。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)基因序列設計引物斑激酶 1R、斑激酶 1F，以獲得凡納濱對蝦黏著斑激酶基因中間片段，經(jīng)克隆后送上海生物工程有限公司測序。3′、5′均采用巢式PCR方法擴增。引物設計見表1。

表1 試驗引物序列

1.2.2 序列分析

利用DNAMAN軟件拼接凡納濱對蝦黏著斑激酶基因cDNA全長。利用美國國立生物技術(shù)信息中心BLASTP(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線工具鑒定獲得的cDNA全長屬于斑激酶基因。使用在線工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析基因ORF，利用ProtParam工具(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)對蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)和保守位點進行分析。利用在線工具InterPro工具(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)比對其保守功能結(jié)構(gòu)域。利用BLASTP搜索同源蛋白，Clustal X 2.0進行序列比對，采用MEGA4.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 熒光定量

解剖健康凡納濱對蝦，取不同組織用于凡納濱對蝦黏著斑激酶基因組織表達分析。采集感染白斑綜合癥病毒與副溶血弧菌后不同時間的凡納濱對蝦鰓，提取RNA反轉(zhuǎn)錄后作為RT-PCR模板。反應體系為：10 μL，每個樣品3個重復，以引物斑激酶 1R、斑激酶 1F作為凡納濱對蝦黏著斑激酶基因熒光定量引物，以β-actin作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。

1.2.4 白斑綜合癥病毒與副溶血弧菌合并感染

試驗設3個試驗組和一個磷酸鹽緩沖液對照組，每組3個平行，每個平行對蝦40尾。試驗組分為白斑綜合癥病毒 (104倍稀釋液)和副溶血弧菌單獨感染組(1.22×106cfu/mL)及二者合并感染組，合并感染組病原液中白斑綜合癥病毒與弧菌密度與單獨感染組相同。在對蝦第二腹節(jié)肌肉處注射50 μL病原液或磷酸鹽緩沖液。感染后第0、3、6、12、24、48、72、96 h取樣。

1.2.5 酶液制備及酶活力測定

取0.2 g肝胰腺組織，加入1.8 mL 磷酸鹽緩沖液冰浴勻漿，4500 r/min低溫離心15 min，取上清液于-80 ℃保存。肝胰腺粗酶液按照試劑盒說明書規(guī)定的比例稀釋后，按照試劑盒說明書測定蛋白濃度、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶活力。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 21軟件，進行單因素方差分析和多重比較檢驗，P< 0.05時差異顯著；利用Excel 2003軟件做圖。

2 結(jié) 果

2.1 凡納濱對蝦黏著斑激酶基因氨基酸序列特征

通過分段克隆及DNAMAN軟件拼接，得到凡納濱對蝦黏著斑激酶基因cDNA序列全長為4919 bp，其中ORF片段長3036 bp，編碼1012個氨基酸，分子量113677.5 Da，理論等電點為9.48。Interpro工具分析表明，凡納濱對蝦黏著斑激酶氨基酸序列包含一個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸激酶(398～652 aa)和C端的對蝦黏著斑激酶結(jié)構(gòu)域(852～973 aa)(圖1)。

圖1 凡納濱對蝦斑激酶基因氨基酸序列PTK結(jié)構(gòu)域用下劃線標記，對蝦黏著結(jié)構(gòu)域用灰色標記.

2.2 凡納濱對蝦黏著斑激酶基因氨基酸進化樹分析

采用鄰接法構(gòu)建基于氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，不同物種對蝦黏著斑激酶被聚合成幾支，包括甲殼動物、昆蟲、魚類、兩棲類、哺乳動物和棘皮動物。紅麗魚(Pundamilianyererei)、尾羅羅非魚(Oreochromisniloticus)等聚成魚類分支，家鼠(Rattusnorvegicus)、蝙蝠(Myotislucifugus)等聚成哺乳動物分支，綠海膽(Lytechinusvariegatus)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)形成棘皮動物和兩棲動物兩單獨分支，蠅蛹金小蜂(Nasoniavitripennis)和黑腹果蠅聚成昆蟲分支，凡納濱對蝦與日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)聚成甲殼動物分支，豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)以其特殊蛋白結(jié)構(gòu)單獨成支(圖2)。

2.3 凡納濱對蝦黏著斑激酶基因的組織表達

分別從健康凡納濱對蝦胃、眼、心臟、肝胰腺、肌肉、鰓和腸提取總RNA，通過RT-PCR定量了凡納濱對蝦黏著斑激酶基因在各組織中的相對表達量。結(jié)果表明，對蝦黏著斑激酶在凡納濱對蝦各組織中均有分布，眼部的相對表達量最高，肌肉中表達量最低(圖3)。

2.4 副溶血弧菌與白斑綜合癥病毒單獨、合并感染對凡納濱對蝦黏著斑激酶基因表達量的影響

整個試驗過程中，磷酸鹽緩沖液對照組的凡納濱對蝦鰓組織中對蝦黏著斑激酶相對表達量未見明顯的變化，而3個感染組對蝦黏著斑激酶表達量先升后降。試驗前期，弧菌單獨感染組對蝦黏著斑激酶表達量水平總是高于白斑綜合癥病毒單獨感染組，感染6 h時出現(xiàn)最大值，且顯著高于白斑綜合癥病毒單獨感染組與合并感染組(P< 0.05)。白斑綜合癥病毒單獨感染組與合并感染組對蝦黏著斑激酶在感染24 h有最大值，96 h出現(xiàn)最低表達量，白斑綜合癥病毒單獨感染組對蝦黏著斑激酶相對表達量顯著高于合并感染組(P< 0.05)。感染6、12、24、48 h時各處理組對蝦黏著斑激酶表達量相對磷酸鹽緩沖液組有明顯上調(diào)(圖4)。

圖2 凡納濱對蝦黏著斑激酶基因進化樹分析

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei);伯氏樸麗魚(Haplochromisburtoni);紅麗魚(Pundamilianyererei);半滑舌鰨(Cynoglossidaesemilaevis);尾羅羅非魚(Oreochromisniloticus);非洲爪蟾(Xenopuslaevis);蝙蝠(Myotislucifugus);人類(Homosapiens);褐家鼠(Rattusnorvegicus);綠海膽(Lytechinusvariegatus);豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum);日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus);蠅蛹金小蜂(Nasoniavitripennis);黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster).

圖3 凡納濱對蝦黏著斑激酶基因在凡納濱對蝦不同組織中的表達量

2.5 副溶血弧菌與白斑綜合癥病毒單獨、合并感染對凡納濱對蝦免疫相關酶活力的影響

12 h時弧菌和白斑綜合癥病毒單獨感染組酸性磷酸酶活力最大，而后各組均降低；合并感染組酸性磷酸酶活力先升后降，在24 h時出現(xiàn)最大值。試驗后期，合并感染組酸性磷酸酶活力總是高于白斑綜合癥病毒單獨感染組，在48、96 h差異顯著(P< 0.05)； 96 h時弧菌單獨感染組酸性磷酸酶活力顯著高于白斑綜合癥病毒單獨感染組和合并感染組(P<0.05)。比較各處理組的離散程度可以看出，合并感染組酸性磷酸酶活力變化最活躍，離散系數(shù)(0.50)高于磷酸鹽緩沖液組(0.12)、弧菌感染組(0.35)和白斑綜合癥病毒感染組(0.45)(圖5)。

圖4 單獨和合并感染后不同時間凡納濱對蝦黏著斑激酶基因的表達含不同字母表示在同一時間點，不同處理組之間存在顯著性差異 (P < 0.05)，下同.

圖5 合并感染對凡納濱對蝦酸性磷酸酶活力的影響

圖6 合并感染對凡納濱對蝦堿性磷酸酶活力的影響

圖7 合并感染對凡納濱對蝦過氧化物酶活力的影響

試驗12 h 時磷酸鹽緩沖液組與合并感染組過氧化物酶活力最大；6 h時弧菌與白斑綜合癥病毒單獨感染組超氧化物歧化酶活力最大。試驗48、72、96 h，白斑綜合癥病毒單獨感染組超氧化物歧化酶活力與合并感染組差異不顯著(P>0.05)；整個試驗過程中，弧菌單獨感染組超氧化物歧化酶活力始終高于其他2個感染組，試驗48 h和72 h差異顯著(P<0.05)。72、96 h時磷酸鹽緩沖液組超氧化物歧化酶活力高于病原處理組，72 h差異顯著(P<0.05)?；【鷨为毟腥窘M超氧化物歧化酶活力離散程度(0.32)最高，磷酸鹽緩沖液組最低(0.22)(圖8)。

圖8 合并感染對凡納濱對蝦超氧化物歧化酶活力的影響

3 討 論

3.1 副溶血弧菌與白斑綜合癥病毒單獨、合并感染對凡納濱對蝦黏著斑激酶基因表達量的影響

凡納濱對蝦是世界上重要的養(yǎng)殖蝦類之一。隨著世界水環(huán)境的污染和破壞，病毒病、弧菌病成為對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要制約因素[12-13]，而弧菌與病毒的合并感染又是蝦病爆發(fā)的重要形式。前期的試驗結(jié)果表明，副溶血弧菌的感染可以抑制白斑綜合癥病毒的爆發(fā)，降低對蝦死亡率。起初筆者認為，這是由于白斑綜合癥病毒感染細胞后，需要利用細胞中代謝產(chǎn)物來合成自身核酸和蛋白質(zhì)，來完成自身大分子的合成，而副溶血弧菌的合并感染可能通過減緩細胞新陳代謝速度和爭奪細胞代謝產(chǎn)物兩種途徑，使被感染細胞不能夠及時為病毒的復制提供所需要的能量和材料，從而抑制白斑綜合癥病毒在對蝦體內(nèi)增殖。后有研究發(fā)現(xiàn)，被沃爾巴克氏體細菌感染的埃及伊蚊，組織中活性氧含量較高，從激活相關免疫基因及抗氧化劑的大量表達，抑制病毒增殖[14]。本研究中，筆者克隆了凡納濱對蝦黏著斑激酶基因，并研究在副溶血弧菌與白斑綜合癥病毒合并感染形式下免疫基因與免疫相關酶的應答情況。

凡納濱對蝦黏著斑激酶基因cDNA全長4919 bp，編碼1012個氨基酸，包含一個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸激酶和C端對蝦黏著結(jié)構(gòu)域，這與Zhang等[11]克隆日本囊對蝦黏著斑激酶基因結(jié)構(gòu)相似。黏著斑激酶是一類酪氨酸激酶，C端對蝦黏著結(jié)構(gòu)域可通過其他基因結(jié)構(gòu)域相互作用，將斑激酶定位到黏著斑中。蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域是蛋白激酶特征結(jié)構(gòu)域，蛋白酪氨酸激酶可以從ATP中轉(zhuǎn)運磷酸鹽到酪氨酸殘基。不同物種構(gòu)建的斑激酶進化樹顯示，凡納濱對蝦黏著斑激酶基因與日本囊對蝦有高度同源性，二者斑激酶基因相似度可達96%，與人類斑激酶基因相似度達48%。

斑激酶可以通過多條信號通路參與細胞黏附、侵襲、遷移、增殖以及凋亡等活動。在副溶血弧菌與白斑綜合癥病毒單獨、合并感染條件下，凡納濱對蝦黏著斑激酶基因相對表達量呈現(xiàn)了先上調(diào)后下降的變化趨勢，這可能與3種病原感染激活了斑激酶的表達有關。研究表明，感染白斑綜合癥病毒的日本囊對蝦血細胞中的斑激酶蛋白表達量升高[11]，機體感染病原后，需要通過多種方式增強細胞黏附能力，抵御病原感染，這與本試驗的研究結(jié)果相似。副溶血弧菌和白斑綜合癥病毒的入侵可以調(diào)控斑激酶的表達及磷酸化水平[15]。本研究中，副溶血弧菌單獨感染組斑激酶表達量總是高于白斑綜合癥病毒單獨感染組，試驗前期，合并感染條件下斑激酶表達量也高于白斑綜合癥病毒單獨感染組，這可能與副溶血弧菌對斑激酶具有較強的誘導作用有關。試驗后期，各感染組凡納濱對蝦黏著斑激酶基因表達量明顯下降，可能是機體長時間感染病原細胞活力下降導致的。

3.2 副溶血弧菌與白斑綜合癥病毒單獨、合并感染對凡納濱對蝦免疫相關酶活力的影響

酸性磷酸酶和堿性磷酸酶是溶酶體酶的重要組成部分，磷酸酶活力水平可作為評價對蝦免疫水平的重要指標[16]，酸性磷酸酶在機體免疫反應中起清除和水解微生物的作用[17]。在本研究中，試驗12、24 h各病原感染組酸性磷酸酶活力均明顯上調(diào)，而后活力下降，這與感染白斑綜合癥病毒的中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)酸性磷酸酶活力變化結(jié)果相似[18]，這可能是機體免疫機能在病理條件下急性激活反應的體現(xiàn)。堿性磷酸酶是重要的生物調(diào)控酶[19]，在本文中堿性磷酸酶活力先升后降，這與感染了螺原體羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[20]堿性磷酸酶的變化相似。試驗后期，合并感染組酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活力均普遍高于白斑綜合癥病毒單獨感染組，副溶血弧菌單獨感染組高于白斑綜合癥病毒單獨感染組，這可能是弧菌感染誘導機體產(chǎn)生更強的免疫反應導致。依酸性磷酸酶、堿性磷酸酶離散程度推測，酸性磷酸酶對合并感染最敏感，而堿性磷酸酶對白斑綜合癥病毒單獨感染最敏感。

非特異性免疫策略是對蝦抵御病原感染的第一道防線[21]。當外界水環(huán)境改變或病原入侵感染等發(fā)生時，機體將通過有氧代謝途徑產(chǎn)生過多的氧化劑，導致氧應激反應[22]。過多的活性氧將損傷機體的蛋白質(zhì)等，機體的防御策略是產(chǎn)生超氧化物歧化酶、過氧化物酶等抗氧化劑消除活性氧，保證機體內(nèi)抗氧化與呼吸爆發(fā)機能的動態(tài)平衡[23]。

過氧化物酶體可以產(chǎn)生多種抗氧化酶，包括過氧化物酶、過氧化氫酶等[24]。過氧化物酶活力是評價甲殼動物免疫能力的指標之一[25]。本研究中，白斑綜合癥病毒單獨感染6 h時過氧化物酶活力最大，弧菌單獨感染組與合并感染12 h過氧化物酶活力最高，這與Wang等[24]發(fā)現(xiàn)感染了白斑綜合癥病毒的紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)過氧化物酶活力12 h達到最大值的結(jié)果相似。試驗后期，各感染組過氧化物酶活力均顯著低于正常水平，這與病原的長期感染降低了機體的免疫機能有關。試驗72、96 h合并感染組肝胰腺組織中過氧化物酶活力高于白斑綜合癥病毒單獨感染組，這說明合并感染組對蝦具有更強抗病原免疫能力。各處理組的離散系數(shù)表明，弧菌單獨感染組過氧化物酶活力最活躍，對副溶血弧菌較白斑綜合癥病毒更為敏感。

“你選擇雪螢的哥哥作為車禍的受害者，原來是為了破壞我和雪螢之間的關系？你太卑鄙、太殘忍了?！币缓紤崙嵉卣f。

超氧化物歧化酶是關鍵的抗氧化酶之一，具有將氧化自由基轉(zhuǎn)化成水分子，清除超氧化物自由基的作用，保護機體免受氧化損傷[26]。研究表明，超氧化物歧化酶在保護機體抗病毒、細菌、寄生蟲以及物理化學應激方面具有重要作用[27]。本研究中，磷酸鹽緩沖液組超氧化物歧化酶活力在試驗12 h最大，這可能與機體應激反應有關。試驗72、96 h，各處理組超氧化物歧化酶活力均低于磷酸鹽緩沖液組，這與感染了白斑綜合癥病毒的印度明對蝦(F.indicus)[28]和凡納濱對蝦[29]超氧化物歧化酶活力明顯下降結(jié)果相似。張濤等[30]認為，這可能由于感染對蝦氧化自由基的急劇增長使抗氧化系統(tǒng)機能異常導致。筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)，弧菌單獨感染組超氧化物歧化酶活力離散程度最高，說明其活力更易受副溶血弧菌感染的誘導。參考文獻：

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cDNACloningofFocalAdhesionKinaseandImmuneResponsetoCo-injectioninPacificWhiteLegShrimpLitopenaeusvannamei

WANG Gang1, SUN Chengbo1,2

( 1.College of Fisheries, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025, China; 2.Tropical Invertebrates Aquaculture Research Center of Guangdong Colleges and Universities, Zhanjiang 524025, China )

Focal adhesion kinase (FAK) gene of Pacific white leg shrimpLitopenaeusvannameiwas cloned by RACE method to study the immune response of Pacific white leg shrimp under co-infection of pathogenic bacteriumVibrioprahaemolyticusand white spot syndrome virus (WSSV). The cDNA sequence was jointed, compared and constructed for phylogenetic tree by software tools, and the tissue distribution and the response under co-infection were studied via real time PCR techniques. The results showed that the full-length cDNA of LvFAK was 4919 bp with an open reading frame of 3036 bp encoding 1012 amino acids. There were two special domain in LvFAK gene, PTK domain and FAT domain. The real-time PCR revealed that the transcrips of LvFAK were detected in all tissue, the maximal relative expression in eyes, and the inimal relative expression in muscle. The LvFAK was regulated byV.prahaemolyticusor WSSV infection or co-infection, first increase and then decrease, and always higher transcrips in co-infection group than in WSSV single infection group.The shrimp had the maximal activity of acid phosphatase (ACP) under co-infection group in all groups, and there was higher alkaline phosphatase (AKP) activity inVibriosingle infection group than in co-infection group, and higher peroxidase (POD) activity in co-infection group than in WSSV single infection group at the end of experiment. The superoxide dismutase (SOD) activity was found to be higher inVibriosingle infectious group than in the other groups.

Litopenaeusvannamei;Vibrioprahaemolyticus; white spot syndrome virus; focal adhesion kinase (FAK); co-infection; enzyme activity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.02.012

S917

A

1003-1111(2016)02-0162-07

2015-04-17；

2015-09-06.

廣東省重點科技計劃項目(2013B020501004).

王剛(1989-),男,碩士研究生;研究方向:水產(chǎn)經(jīng)濟動物學及種苗工程.E-mail:wgang2015@126.com.通訊作者：孫成波(1970-),男,教授,博士;研究方向:對蝦養(yǎng)殖和病害防治.E-mail：suncb@gdou.edu.cn.