符合中醫(yī)體征的血虛便秘小鼠模型的建立與評價*

杜麗東，牛亭惠，吳國泰，王志旺，邵 晶，任 遠

(甘肅中醫(yī)藥大學甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

·實驗研究·

符合中醫(yī)體征的血虛便秘小鼠模型的建立與評價*

杜麗東，牛亭惠，吳國泰，王志旺，邵 晶，任 遠

(甘肅中醫(yī)藥大學甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

目的：建立血虛便秘小鼠模型，評價模型小鼠的體征并探討模型復制條件。方法：將64只SPF級KM小鼠隨機分為正常對照組、血虛組、便秘組和血虛便秘組，每組16只。血虛組皮下注射乙酰苯肼60 μg/g+腹腔注射環(huán)磷酰胺40 μg/g，便秘組灌胃復方地芬諾酯25 μg/g，血虛便秘組皮下注射乙酰苯肼60 μg/g +腹腔注射環(huán)磷酰胺40 μg/g+灌胃復方地芬諾酯25 μg/g，正常對照組皮下注射+腹腔注射+灌胃等量生理鹽水，造模連續(xù)28 d。觀察小鼠狀態(tài)，檢測體質量、血常規(guī)、糞便性狀、小腸推進率(SIPR)、首粒黑便排出時間(TFBF)、糞便含水量(FWC)和結腸含水量(CWC)；結腸組織進行HE和AB-PAS染色，觀察組織形態(tài)學改變。結果：與正常對照組對比，血虛組隨造模時間延長，體質量增長緩慢，WBC、RBC、HGB和HCT均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，糞便質軟、SIPR、TFBF、FWC和 CWC均無顯著性變化(P>0.05)；便秘組體質量增長稍慢，WBC、RBC、HGB和HCT無顯著變化(P>0.05)；血虛便秘組體質量增長緩慢，WBC、RBC、HGB和HCT均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；便秘組和血虛便秘組小鼠糞便質硬，SIPR顯著減慢、TFBF顯著延長、FWC和 CWC均顯著下降(P<0.05或P<0.01)；血虛組小鼠結腸組織形態(tài)和黏液分泌與正常對照組相似(P>0.05)，便秘和血虛便秘組小鼠結腸黏膜層和大腸腺萎縮，黏液分泌減少(P<0.05)。結論：乙酰苯肼、環(huán)磷酰胺聯合復方地芬諾酯能建立符合中醫(yī)體征的血虛便秘小鼠模型，造模方法可控、簡便、易行。

血虛便秘；小鼠；模型

便秘是一種臨床常見癥狀，血虛便秘是中醫(yī)臨床常見的證型。患者多表現血虛陰虧、津枯血燥，面色萎黃或潮紅，脈細數，舌質紅而少津或淡而津干，大便量少、質干硬。便秘的產生原因有多種，或產后、術后失血過多，血虛腸燥；或熱病后津液耗傷而致腸液干枯；或平素大便秘結，長期服用通便藥導致腸液干枯；或老年人腸道功能減退、患有痔疾、婦女患月經病[1]。中醫(yī)臨床對血虛便秘的研究取得了長足進展，但血虛便秘動物模型的研究一直頗有爭議，建立符合中醫(yī)臨床指征的動物模型是開展血虛便秘基礎研究、開發(fā)有效治療藥物的基礎。本研究采用復合因素建立血虛便秘小鼠模型，并與血虛和便秘模型小鼠進行對比，旨在建立一種簡單易行、條件可控、基本能體現血虛便秘體征特點的小鼠模型，為相關科學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級昆明種小鼠64只，雌雄各半，體質量18～22 g，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(甘)2015-0002。 飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心SPF級實驗室。

1.2 藥品與儀器

復方地芬諾酯片，常州康普藥業(yè)有限公司產品，批號1603033；乙酰苯肼(APH), 上海源葉生物科技有限公司產品，批號20150701258；環(huán)磷酰胺(CPA)，山西普德藥業(yè)股份有限公司產品，批號04150405。AU5400型全自動生化分析儀、BX51-32H01型顯微鏡，均為日本Olympus公司產品。

1.3 分組與模型的建立

參照文獻[2-3]并在預實驗基礎上，將小鼠按性別、體質量隨機分正常對照組、血虛組、便秘組和血虛便秘組，每組16只；自由進食飲水，適應性飼養(yǎng)1周。血虛組小鼠造模第1，4，7，10 天 皮下注射APH 60 μg/g，第10-14天腹腔注射CTX 40 μg/g；便秘組小鼠灌胃復方地芬諾酯混懸液25 μg/g( 5 d為1個療程，療程間停藥2 d)；血虛便秘組小鼠造模第1，4，7，10天皮下注射 APH 60 μg/g，第10-14天腹腔注射 CTX 40 μg/g，同時灌胃復方地芬諾酯混懸液25 μg/g；正常對照組第1，4，7，10天皮下注射、第10-14天腹腔注射、同時灌胃等量生理鹽水；各組給藥容積10 μL/ g。造模連續(xù)28 d。

1.4 觀測指標

1.4.1 一般狀況與體質量

觀察各組小鼠活動狀態(tài)，毛色，口、鼻、唇、尾顏色，糞便形態(tài)。分別在造模前、造模第7，14，21，28天和造模結束第7天稱量體質量。

1.4.2 血常規(guī)

分別在造模第28天和造模結束第7天，取各組小鼠8只，眼眶靜脈叢取血20 μL ，采用全自動血液分析儀檢測外周血中白細胞 (WBC) 計數、紅細胞 (RBC) 計數、血紅蛋白 (HGB) 含量和紅細胞壓積(HCT)。

1.4.3 首粒黑便排出時間(TFBF)和小腸推進率 (SIPR)

在造模第28天和造模結束第7天，禁食、不禁水12 h，分別取各組小鼠8只，每只灌胃50 g/L炭末糊0.5 mL，單籠飼養(yǎng)并記錄各小鼠TFBF。造模第29天和造模結束后第8天禁食、不禁水12 h，取各組小鼠8只，每只灌胃50 g/L 炭末糊0.5 mL。25 min后頸椎脫臼處死，開腹，取出小腸，分離系膜，鋪直，測量小腸全長(幽門至回盲部距離)及推進距離(幽門至炭末前沿的距離)，計算SIPR。 SIPR=推進距離/小腸全長×100%。

1.4.4 糞便含水量(FWC)和結腸含水量(CWC)

取1.4.3項處死小鼠，取結腸殘留糞便，稱濕重，80 ℃恒溫干燥10 h，稱干重，計算FWC。FWC=(濕重-干重)/濕重×100%。取結腸組織約 2 cm(距盲腸2 cm處)，稱濕重，60 ℃恒溫干燥6 h，稱干重，計算CWC。CWC =(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.5 結腸組織形態(tài)

造模第29天，取結腸組織約1 cm(距離直腸2 cm處)， 40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.4.6 結腸黏液分泌

造模第29天，取結腸組織約1 cm (距直腸 3 cm處)，卡諾氏固定液(無水乙醇︰冰醋酸︰氯仿=6∶1∶3) 固定，石蠟包埋，切片，AB-PAS染色，光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組一般狀況對比

正常對照組小鼠反應靈敏，皮毛密而有光澤，糞便形狀規(guī)則，質稍軟，互不粘連。血虛組小鼠蜷縮，萎靡，皮毛膨松、易掉，耳、鼻、唇、尾蒼白，糞便較硬。便秘組小鼠皮毛光澤暗淡，排便減少，糞便干結、粘連。血虛便秘組小鼠蜷縮，萎靡，毛枯疏，光澤暗淡，耳、鼻、唇、尾蒼白，排便減少，糞便干結、粘連。

2.2 各組小鼠體質量對比

造模前各組小鼠體質量對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與正常對照組對比，隨著造模時間延長，便秘組小鼠體質量增長雖減慢，但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；血虛組和血虛便秘組小鼠分別從造模第14 天、第7天起至造模結束第7天體質量增長顯著減慢，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

組 別造模造模前造模第7天造模第14天造模第21天造模第28天造模結束第7天正常對照組18.8±1.321.4±1.522.5±1.524.1±1.525.2±1.925.7±1.5便秘組18.7±1.819.8±1.521.9±1.922.9±2.024.1±2.225.0±2.2血虛組19.1±2.119.9±2.120.5±2.0**22.3±2.122.6±2.0**23.0±1.9**血虛便秘組18.6±1.119.4±0.8*20.2±0.8**21.8±0.5**22.2±0.9**22.4±0.4**

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 各組小鼠WBC、HGB、RBC和HCT對比

與正常對照組對比，造模第28天和造模結束第7天，便秘組小鼠外周血WBC、RBC、HGB、HCT均無顯著變化(P>0.05)；血虛組和血虛便秘組小鼠外周血WBC、RBC、HGB、HCT均降低，差別有統(tǒng)計學意義 (P<0.05或P<0.01)。見表2。

組 別造模第28天WBC/(×109個·L-1)HGB/(g·L-1)RBC/(×1012個·L-1)HCT/%正常對照組11.4±3.7146.8±22.58.6±1.434.4±7.4便秘組11.9±2.2150.2±22.08.7±1.334.7±8.4血虛組8.8±2.9*104.4±20.3**6.3±1.2**血虛便秘組6.5±2.6**102.5±15.0**6.1±1.2**26.5±7.3*

組 別造模結束第7天WBC/(×109個·L-1)HGB/(g·L-1)RBC/(×1012個·L-1)HCT/%正常對照組10.6±4.5151.7±10.57.9±0.832.2±2.5便秘組9.4±2.5135.5±27.07.4±1.329.7±4.7血虛組5.8±0.9*117.5±13.1*6.5±0.7*27.89±3.5*血虛便秘組5.5±1.4**116.0±24.6**6.3±1.3*25.7±4.4*

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 各組小鼠TFBF和SIPR對比

與正常對照組對比，造模第28天和造模結束第7天，便秘組和血虛便秘組小鼠TFBF延長、SIPR降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 血虛組小鼠TFBF有延長趨勢、SIPR有減慢趨勢，但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

組 別造模第28天TFBF/minSIPR/%造模結束第7天TFBF/minSIPR/%正常對照組124.6±39.369.6±7.4113.3±30.070.1±7.7便秘組187.0±40.7**62.8±6.3*173.1±32.9**62.2±7.9*血虛組148.2±37.266.5±8.3139.3±42.769.1±6.1血虛便秘組184.9±26.2**61.8±8.4*186.8±47.1**61.7±7.4*

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 各組小鼠FWC和CWC對比

與正常對照組對比，便秘組和血虛便秘組小鼠FWC和CWC降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；血虛組小鼠FWC和CWC有降低趨勢，但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表4。

組 別造模第28天FWC/%CWC/%造模結束第7天FWC/%CWC/%正常對照組64.6±8.078.1±3.869.4±5.776.8±7.0便秘組50.5±7.5**73.1±4.5*49.8±8.7**70.0±4.7*血虛組58.4±7.977.7±2.864.6±6.173.8±5.2血虛便秘組47.1±8.5**74.8±2.4*46.7±12.0**69.4±9.0*

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.6 各組小鼠結腸組織形態(tài)對比

正常小鼠結腸黏膜上皮層、固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層、漿膜層均未見明顯病理改變，結腸黏膜上皮完整，排列整齊。便秘組和血虛便秘組小鼠結腸黏膜層萎縮，黏膜固有層大腸腺明顯萎縮，黏膜下層、肌層和漿膜層未見異常病理改變。血虛組各層未見明顯異常病理改變。見圖1。

圖1 造模對小鼠結腸組織形態(tài)的影響(HE 染色，×10)

2.7 各組小鼠結腸黏液分泌對比

正常小鼠結腸黏膜層上皮細胞和杯狀細胞形態(tài)飽滿、圓潤，黏液分泌豐富，黏膜表面覆蓋混合性黏液。血虛組小鼠黏液分泌接近正常小鼠。便秘組和血虛便秘組小鼠黏膜層上皮細胞和杯狀細胞出現不同程度萎縮，黏膜表面黏液覆蓋減少。見圖2。

圖2 造模對小鼠結腸黏液分泌的影響(AB-PAS 染色，×20)

3 討 論

目前，與病因病機相符合且能體現“證”的主要癥狀的血虛便秘模型的研究較少，且缺乏判斷模型成功的金標準。文獻報道的血虛便秘小鼠模型有皮下注射鹽酸嗎啡+剪尾放血[4]，灌胃鹽酸洛哌丁胺+剪尾放血[5]，模型的判斷標準為：動物出現血虛表現，如精神萎靡，蜷臥，少動，嗜睡，毛聳無華，眼睛淡白無神，鼻唇色淡，活動減少；血常規(guī)中WBC、RBC、HTC和PLT降低；出現糞便數量減少，便干，整腸傳輸時間延長等便秘癥狀。放血符合血虛便秘病因病機中“血的持久過度損耗，滋潤和營養(yǎng)減弱”，但存在小鼠放血量難以精確控制、易致尾部血管變構、部分動物恢復過快而不出現血虛癥狀等缺點。本研究采用目前常用的化學因素APH和CPA致血虛方法聯合止瀉藥復方地芬諾酯建立血虛便秘模型，并與血虛和便秘模型小鼠進行對比，旨在確立一種簡便、可控的符合中醫(yī)臨床病證結合的血虛便秘小鼠模型。

本研究結果顯示：與正常對照組對比，血虛組小鼠血虛但不便秘，隨造模時間延長，體質量增長緩慢，血中WBC、RBC、HGB和HCT均顯著降低，糞便質軟，SIPR、TFBF、FWC和 CWC均無顯著性變化(研究周期內，單種血虛未出現便秘癥狀，可能是由血虛導致便秘需要更長的時間)。便秘組小鼠便秘但血不虛：小鼠體質量增長正常，血中WBC、RBC、HGB和HCT無顯著變化。血虛便秘組小鼠血虛兼便秘：小鼠體質量增長緩慢，血中WBC、RBC、HGB和HCT均顯著降低。便秘組和血虛便秘組小鼠糞便質硬，TFBF顯著延長，SIPR顯著減慢，FWC和 CWC均顯著下降，結腸黏膜層和大腸腺萎縮，黏液分泌減少。造模結束7 d，血液和便秘的相關檢測顯示與造模結束時一致，提示該模型比較穩(wěn)定。以上結果與李國峰等[4-6]的研究結果一致。

本研究建立的血虛便秘小鼠模型操作簡單，造模條件量化、可控、造模周期相對較短、模型基本穩(wěn)定，但該模型屬于血虛和便秘的兼證，未能體現血虛與便秘的因果關系。在目前沒有更好的血虛便秘動物模型的情況下，可作為開展血虛便秘基礎研究和開發(fā)有效治療藥物評價的動物模型。

[1]石鳴之.血虛腸燥便秘的臨床治療[J]. 江蘇中醫(yī),1995,16(8):46.

[2]李偉霞,唐于平,段金廒，等.當歸-川芎藥對及其組成藥味對3種血虛模型補血作用的比較研究[J]. 中國中藥雜志,2011,36(13):1808-1814.

[3]謝培,周永學.大鼠功能性便秘模型建立方法的研究[J]. 陜西中醫(yī),2014,35(3):377-379.

[4]李國峰.養(yǎng)血活血方治療血虛型便秘的臨床研究及對便秘模型小鼠結腸ICC的影響[D].北京：中國中醫(yī)科學院,2008.

[5] 劉五州,妥海燕,任遠，等.當歸對血虛便秘模型小鼠的治療作用及機制研究[J]. 甘肅中醫(yī)藥大學學報,2016,33(2):1-4.

[6] 吳霜,程瀅瑞,周錦勇，等.洛哌丁胺構建大鼠便秘模型對水通道蛋白AQP3和AQP8的影響[J].世界華人消化雜志,2014,22(7):969-974.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)03-0075-04

R256.35

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.03.34

任遠，教授，博士研究生導師，Leyuan816@163.com

甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室開放基金項目(ZDSYS-KJ-2015-009，ZDSYS-ZZ-2015-002，ZDSYS-KJ-2015-008)；隴原青年創(chuàng)新人才扶持計劃項目(甘組電明字〔2015〕34號)；甘肅省中藥現代制藥工程研究院基金項目(YWW-2015050)

2016-12-09；

2017-02-20