昆侖雪菊提取物對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用研究*

舒 暢，范 強(qiáng)，楊麗霞，姜良恩，張邦能，康萬榮，張延英，萬生芳

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

·實(shí)驗(yàn)研究·

昆侖雪菊提取物對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用研究*

舒 暢1，范 強(qiáng)1，楊麗霞2，姜良恩1，張邦能3，康萬榮1，張延英1，萬生芳1

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

目的：觀察昆侖雪菊提取物對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用。方法：將35只雄性STZ誘導(dǎo)的糖尿病Wistar大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組,昆侖雪菊提取物低、中、高劑量組,吡咯列酮組5組，每組7只；另選7只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服生理鹽水，昆侖雪菊低、中、高劑量組分別按100，200，400 μg/(g·d)劑量灌胃，吡咯列酮組灌服吡咯列酮10 μg/(g·d),連續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)大鼠空腹血糖、餐后2 h血糖及血脂水平，采用ELISA法檢測(cè)大鼠胰島素分泌水平(INS)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI1)、單核細(xì)胞趨化因子1(MCP1)，HE染色胰腺組織并光鏡下觀察胰島結(jié)構(gòu)。結(jié)果：昆侖雪菊提取物對(duì)降低糖尿病大鼠體質(zhì)量作用不明顯(P>0.05)，但對(duì)空腹血糖、餐后2 h 血糖具有降低作用，并在一定程度上能夠促進(jìn)胰島素分泌，下調(diào)炎癥因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6的表達(dá)，與模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HE染色顯示各藥物組具有保護(hù)胰島β細(xì)胞、延緩胰島衰竭的作用。結(jié)論：昆侖雪菊提取物在一定程度上具有降低2型糖尿病大鼠血糖、促進(jìn)胰島素分泌、改善胰島素抵抗的作用,其作用機(jī)制可能與下調(diào)炎癥因子表達(dá)有關(guān)。

昆侖雪菊提取物/藥效學(xué)；STZ；糖尿病大鼠模型；血糖；胰島素抵抗；動(dòng)物；大鼠

昆侖雪菊，民間又稱“血菊”，植物學(xué)名是蛇目菊、金雞菊(Coreopsis)，菊科金雞屬，一年生草本植物的干燥頭狀花序。它主要分布在我國新疆和田地區(qū)海拔高3 000米左右的昆侖山區(qū)，因此而得名昆侖雪菊，是一種與雪蓮齊名，具有獨(dú)特功效的稀有野生高寒植物，具有相當(dāng)高的藥用價(jià)值，被當(dāng)?shù)鼐用褡鳛榛ú栾嬘?，被?dāng)?shù)蒯t(yī)院作為一種維藥材使用，具有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾的功效，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡疔腫毒，是一種具有廣闊的市場(chǎng)前景和研究價(jià)值的新品種藥材[1]。臨床上，雪菊花及復(fù)方制劑可用于預(yù)防、治療呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)何皮膚等的感染性疾病，以及高血壓、高血脂癥等[2]。目前有研究表明，昆侖雪菊中總黃酮含量顯著高于市售菊花，且酚類化合物單體組成更加豐富，含量亦相對(duì)較高，具有較高的研究和開發(fā)價(jià)值[3-4]。近年來，市場(chǎng)上將雪菊主要作為降低血糖、血壓、血脂的保健品進(jìn)行銷售。為了明確其藥理作用，本課題采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，通過觀察昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病大鼠血糖、血脂、血清炎癥因子和胰島素抵抗的作用，闡明其對(duì)糖尿病的作用及藥理機(jī)制，旨在為糖尿病的治療提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

70只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK(甘)2004-0006。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)屏障級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，每天自由飲水、攝食。

1.2 藥品、試劑與儀器

昆侖雪菊，產(chǎn)地青海，購于青海優(yōu)潤堂商貿(mào)有限責(zé)任公司，由上海友思生物技術(shù)有限公司提??；鹽酸吡格列酮片，北京太洋藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)130605。鏈脲佐菌素(STZ)，Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)046K1206。ELISA試劑盒：胰島素(INS，批號(hào)CSB-E05070r)、MCP-1(批號(hào)CSB-E07429r)、PAI1(批號(hào)CSB-E07948r)、ICAM1(批號(hào)CSB-E04576r)，均為CUSABIO公司產(chǎn)品；TNF-α(批號(hào)DKW12-3720-096)、IL-1(批號(hào)DKW12-3012-048/DKW12-3012-096)、IL-6(批號(hào)DKW12-3036-096)，均為達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；羅氏活力型血糖試紙，德國Roche Diagnostics GmbH公司產(chǎn)品。Accu-Chek Active [Model GC]血糖儀，德國Roche Diagnostics GmbH公司產(chǎn)品；2700型全自動(dòng)生化儀，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；Bio-rad 680型酶標(biāo)儀，美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.3 糖尿病大鼠模型的建立與給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常對(duì)照組7只外，其余大鼠均給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，8周末尾靜脈注射STZ 25 μg/(g·d)，l周后尾靜脈取血測(cè)定血糖。隨機(jī)血糖穩(wěn)定>13.9 mmol/L者診斷為2型糖尿病，未成功模型追加25 μg/(g·d) STZ 1次。選取造模成功的大鼠35只，隨機(jī)分為模型對(duì)照組，昆侖雪菊提取物低、中、高劑量組，吡格列酮組5組，每組7只。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服生理鹽水，昆侖雪菊提取低、中、高劑量組分別按100，200，400 μg/(g·d)的劑量灌胃，吡咯列酮組灌服10 μg/(g·d)劑量的吡咯列酮。灌胃量為10 μL/g，所有藥品以生理鹽水配成所需的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，1 d 1次，連續(xù)4周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

4周后，禁食8 h，稱量體質(zhì)量，麻醉后，一次性心臟采血，頸椎脫位處死后，取胰腺組織。血液靜置2 h，4 ℃、3 500 r/min離心20 min，取血清，-20 ℃保存；胰腺組織以40 g/L 甲醛固定，常溫保存。

1.4.1 大鼠一般情況、血糖、血脂

觀察大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)狀況、毛色等一般情況，并稱量體質(zhì)量，測(cè)空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(P2hPG)和血清總膽固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。

1.4.2 大鼠血清INS水平及炎癥因子ICAMI、PAI1、MCP1、TNF-α、IL-1、IL-6

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，檢測(cè)前先對(duì)所有樣本進(jìn)行低溫離心，在反應(yīng)孔中加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)標(biāo)本，每孔劑量為100 μL。在空白對(duì)照孔中加入稀釋液，劑量為100 mL；在37 ℃電熱培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，孵育后對(duì)檢測(cè)板進(jìn)行洗滌；加酶標(biāo)抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)。反應(yīng)終止后，將檢測(cè)板在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)，以空白對(duì)照孔調(diào)零，檢測(cè)條件為450 nm，測(cè)定各孔OD值。

1.4.3 胰腺組織形態(tài)

HE染色，光鏡下觀察胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況對(duì)比

正常對(duì)照組大鼠皮毛光澤，精神狀態(tài)良好，動(dòng)作反應(yīng)靈敏，行為活躍。模型對(duì)照組大鼠皮毛干枯無光澤，精神狀態(tài)較差，動(dòng)作遲緩，反應(yīng)較慢，活動(dòng)度差，并隨著飼養(yǎng)時(shí)間程度加重。昆侖雪菊提取物各劑量組和吡格列酮組與模型對(duì)照組對(duì)比，上述情況有不同程度的改善。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、血清FPG、P2hPG、INS水平對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠的體質(zhì)量降低，F(xiàn)PG與P2hPG升高，INS水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，昆侖雪菊各劑量組大鼠體質(zhì)量變化不明顯，但FPG與P2hPG有不同程度的降低，其中高劑量作用顯著，并且能顯著促進(jìn)胰島素的分泌，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

組 別劑量/(μg·g-1)體質(zhì)量/gFPG/(mmol·L-1)P2hPG/(mmol·L-1)INS/(μIU·L-1)正常對(duì)照組—432.1±43.14.30±0.206.05±0.4390.03±18.72模型對(duì)照組—220.0±28.5*26.20±3.80*30.90±1.60*19.41±19.36*吡咯列酮組10231.4±41.025.45±7.3323.95±3.19#43.44±57.10#昆侖雪菊低劑量組100239.4±51.618.34±7.1127.74±3.8235.30±35.70#昆侖雪菊中劑量組200244.4±37.416.73±4.97#25.93±4.2439.37±42.38#昆侖雪菊高劑量組400238.3±32.016.91±7.33#23.65±6.77#42.53±49.67#

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05。

2.3 各組大鼠血清CHOL、TG、HDL、LDL水平對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠CHOL、TG升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。昆侖雪菊提取物低、中、高劑量及吡咯列酮組的 CHOL、TG較模型對(duì)照組有一定下降趨勢(shì)，HDL、LDL較之變化不大。表明：昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病大鼠血脂指標(biāo)作用不明顯。見表2。

組 別劑量/(μg·g-1)CHOL/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)HDL/(mmol·L-1)LDL/(mmol·L-1)正常對(duì)照組—1.51±0.230.88±0.240.96±0.170.27±0.02模型對(duì)照組—2.08±0.17*1.48±0.63*1.34±0.060.36±0.09吡咯列酮組101.84±0.371.20±0.661.25±0.200.28±0.13昆侖雪菊低劑量組1001.84±0.500.77±0.351.31±0.390.28±0.07昆侖雪菊中劑量組2001.81±0.33#0.71±0.63#1.22±0.270.35±0.19昆侖雪菊高劑量組4001.65±0.26#0.62±0.31#1.16±0.200.32±0.06

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05。

2.4 各組大鼠血清炎癥因子ICAM1、PAI1、MCP1、TNF-α、IL-1、IL-6對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清ICAMI、PAI1、MCP1、TNF-α、IL-6水平升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IL-1升高不明顯，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，4個(gè)藥物組炎癥因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6水平下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而TNF-α、IL-1水平較之差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明：昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病大鼠血清炎癥因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6在一定程度上具有抑制作用。見表3。

組 別劑量/(μg·g-1)ICAM1/(μg·L-1)PAI1/(μg·L-1)MCP1/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)IL-1/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)正常對(duì)照組—99.39±5.310.33±0.8588.82±23.68104.4±10.8444.19±1.6765.43±5.61模型對(duì)照組—173.6±202.4*8.84±8.95*172.0±78.84*131.9±44.1346.54±2.73120.3±102.1*吡咯列酮組1096.80±10.49#3.85±1.55#111.3±26.25#109.2±14.9051.67±14.183.58±44.59#昆侖雪菊低劑量組10095.12±7.83#3.31±2.75#111.85±36.5#129.1±41.5144.19±2.8168.92±20.16#昆侖雪菊中劑量組20092.84±5.19#3.87±3.11#90.81±30.96#124.6±13.5644.59±1.0796.47±33.08#昆侖雪菊高劑量組40093.70±4.55#4.73±5.74#88.65±22.39#136.3±41.5045.09±1.3487.99±20.30#

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05。

2.5 各組大鼠胰腺組織形態(tài)對(duì)比

正常對(duì)照組大鼠胰島邊界清楚，結(jié)構(gòu)完整，外部形態(tài)豐滿，胰島細(xì)胞分布均勻，各細(xì)胞核呈橢圓形，胞漿豐富，胰島數(shù)量及島內(nèi)細(xì)胞數(shù)均較多。模型對(duì)照組大鼠胰島數(shù)量減少，體積變小，邊界不清，胰島細(xì)胞胞漿減少，細(xì)胞核固縮。各藥物組均有不同程度的改善。見圖1。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.吡咯列酮組；D.昆侖雪菊低劑量組；E.昆侖雪菊中劑量組；F.昆侖雪菊高劑量組

3 討 論

糖尿病的發(fā)病因素很多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前大量研究表明胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)。IR是指胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素的敏感性下降，產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)低于正常狀態(tài)，胰島素的作用沒有很好地發(fā)揮出來。IR與很多代謝性疾病如高血壓、高血脂、糖尿病、痛風(fēng)等有關(guān)，是這些疾病的共同病理生理基礎(chǔ)。因此，研究改善胰島素抵抗對(duì)于預(yù)防糖尿病等許多慢性代謝性疾病意義重大。

目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療胰島素抵抗方面存在著許多瓶頸問題尚未解決，其中患者不能長期耐受藥物的副作用是最常見的問題，此外還有藥物的不良反應(yīng)及長期服用所產(chǎn)生的耐藥性等等；因此，純天然植物藥物的開發(fā)和應(yīng)用具有很大的優(yōu)勢(shì)和廣闊的市場(chǎng)前景。許多純天然植物中含有黃酮類化合物，其中許多是藥食兩用植物。在國外，很多食品添加劑或營養(yǎng)補(bǔ)充劑就是黃酮類化合物，黃酮類化合物與化學(xué)藥物相比具有較高的安全性，適合患者長期服用。大量研究表明，植物黃酮類化合物在改善胰島素抵抗方面具有顯著療效，已研究發(fā)現(xiàn)有蕎麥花葉總黃酮、玉米須總黃酮、葛根黃酮等黃酮苷藥物具有降血糖、改善胰島素抵抗的功效，有些已用于臨床[6-8]。因此，將黃酮類化合物開發(fā)成為改善胰島素抵抗、治療糖尿病的藥物，具有良好的應(yīng)用前景。昆侖雪菊是純天然野生植物中含黃酮類化合物較高的植物，昆侖雪菊中水溶性總黃酮含量平均為18.62%[1]，水溶性總黃酮主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查耳酮及異黃銅類化合物[9]；醇溶性總黃酮含量為12.28%[10]，無查耳酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，雪菊提取物內(nèi)大量的黃酮類化合物具有抗氧化、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈-抗心肌缺血、降血壓、抑制艾滋病毒、抗癌等生物活性和藥理作用[9]。近年來雖然開展了一些有關(guān)昆侖雪菊化學(xué)成分的研究，但其藥理作用研究仍然不足，很多研究尚處于初級(jí)階段，生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確，使其臨床應(yīng)用受到限制，這對(duì)于我國中藥材資源的開發(fā)十分不利；因此，非常有必要加快對(duì)該藥材的藥用價(jià)值研究，并闡明其化學(xué)成分和藥理活性，以便于開發(fā)出療效確切、穩(wěn)定的新藥。

本研究結(jié)果顯示：昆侖雪菊提取物對(duì)降低糖尿病大鼠體質(zhì)量作用不明顯；與模型對(duì)照組相比，在灌胃4周后，對(duì)糖尿病大鼠的空腹血糖、餐后2 h血糖有降低作用；均具有促進(jìn)胰島素分泌，增強(qiáng)胰島素敏感性的作用；對(duì)糖尿病大鼠血清炎癥因子ICAMI、PAI1、MCP1、IL-6降低作用明顯，對(duì)TNF-α、IL-1具有降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病大鼠血清炎癥因子在一定程度上具有抑制作用。HE染色結(jié)果顯示：昆侖雪菊提取物具有保護(hù)胰島β細(xì)胞、延緩胰島功能衰竭的作用。結(jié)果表明：昆侖雪菊提取物在一定程度上具有降低糖尿病大鼠血糖、改善胰島素抵抗的作用，但由于藥物的純度較低，灌胃的時(shí)間較短，藥效發(fā)揮并非理想，這需要在以后的研究中進(jìn)一步改善。本研究僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，缺乏作用機(jī)制及臨床的深入研究，這將成為本課題以后的研究重點(diǎn)，以期能夠?yàn)樘悄虿〉闹委熖峁└鼮橛行У乃幬铩?/p>

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)03-0066-05

R587.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.03.31

舒暢(1978-)，女(漢族)，重慶人，副教授，碩士,主要從事中醫(yī)藥防治糖尿病的研究。

楊麗霞，副主任醫(yī)師，博士,13038770310@163.com

國家自然科學(xué)基金(81202971)；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)1308RJZA106)；蘭州市科技局項(xiàng)目(2014-1-20)

2016-08-15；

2017-01-17