腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8在肺癌組織中的表達(dá)及對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

彭英東 秦 勇 魏新素 廖 波 劉永泰

(新疆兵團(tuán)第一師醫(yī)院呼吸科,新疆 阿克蘇 843000)

腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8在肺癌組織中的表達(dá)及對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

彭英東 秦 勇 魏新素 廖 波 劉永泰

(新疆兵團(tuán)第一師醫(yī)院呼吸科,新疆 阿克蘇 843000)

目的 探討腫瘤壞死因子(TNF)α誘導(dǎo)蛋白(TNFAIP)8在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況及其對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。方法 用RT-PCR和Western印跡檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織與癌旁組織中TNFAIP8 mRNA和蛋白表達(dá)的差異。合成TNFAIP8特異性siRNA，轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞，RT-PCR和Western印跡檢測(cè)TNFAIP8-siRNA對(duì)細(xì)胞中TNFAIP8 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況，Western印跡檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 非小細(xì)胞肺癌組織中TNFAIP8 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.01)。與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染TNFAIP8-siRNA的肺癌A549細(xì)胞TNFAIP8 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，細(xì)胞增殖和遷移能力顯著降低(P<0.01)，細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 TNFAIP8高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生密切相關(guān)，沉默TNFAIP8的表達(dá)能夠抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖和遷移能力。

腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8；非小細(xì)胞肺癌；肺癌A549細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的85%〔1〕。肺癌的最佳治療方式是手術(shù)切除，但由于大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，不適合再進(jìn)行手術(shù)切除治療，而傳統(tǒng)的化療、放療也會(huì)產(chǎn)生很大的副作用〔2〕。分子靶向治療成為目前腫瘤學(xué)術(shù)界和患者所認(rèn)同的治療方式，運(yùn)用靶向治療藥物直接作用于肺癌細(xì)胞特異性靶位點(diǎn)，可獲得較好的療效又不會(huì)損傷正常細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞中有許多分子可作為癌癥治療的靶位點(diǎn)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞骨架蛋白等〔3〕。腫瘤壞死因子(TNF)α誘導(dǎo)蛋白(TNFAIP)家族包括TNFAIP1～ TNFAIP9等多個(gè)家族成員，由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生，其中TNFAIP8是近年來新發(fā)現(xiàn)的蛋白家族，包含4個(gè)序列高度同源的家族成員，在人的多種組織中均有表達(dá)〔4〕。TNFAIP8基因最早在原發(fā)性人頭頸鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)，目前研究顯示，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、遷移等相關(guān)，在人類多種腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)〔5,6〕。本實(shí)驗(yàn)旨在研究TNFAIP8對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2014～2016年在新疆兵團(tuán)第一師醫(yī)院就診的肺癌患者30例，經(jīng)病理學(xué)診斷確診為非小細(xì)胞肺癌，術(shù)前未經(jīng)過放療和化療治療。在經(jīng)患者同意并簽訂知情同意書后，采集患者的肺癌組織，并在肺癌組織周圍10 cm以上處采集癌旁正常組織。將采集的組織標(biāo)本放入液氮中迅速冷凍，然后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.1 細(xì)胞 肺癌A549細(xì)胞購買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清(FBS)購于美國(guó)Hyclone公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國(guó)Gibco公司，NFAIP8-siRNA及其陰性對(duì)照購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白提取試劑盒購于Promega公司，Trizol試劑、熒光定量試劑(SYBR Green Ⅰ)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，TNFAIP8、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9單克隆抗體和辣根過氧化物標(biāo)記的二抗購自美國(guó) Abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購于日本三洋公司，倒置熒光顯微鏡購于日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀購于美國(guó)BD公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀購于Thermo Labsystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將裝有肺癌A549細(xì)胞的凍存管從液氮灌中取出，放入37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，用移液槍迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到5 ml無菌EP管中，加入含有10% FBS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞凍存液中的二甲基亞砜(DMSO)，1 000 r/min離心5 min，去除上清。加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后換液一次，去除漂浮的死細(xì)胞，之后每隔48 h換液一次，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 (1)TNFAIP8-siRNA組。(2)siRNA陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染無關(guān)序列。(3)空白對(duì)照組：只加細(xì)胞培養(yǎng)液，未轉(zhuǎn)染siRNA。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)TNFAIP8 mRNA表達(dá) 取適量非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織，用Trizol法提取組織總RNA。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，加入含有10% FBS無抗生素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí)，按照1.2.2中的分組設(shè)置轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4 h后，更換為細(xì)胞完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h后，收集肺癌A549細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA濃度和質(zhì)量；PrimeScript TM RT Reagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，將產(chǎn)物作5 倍稀釋，用SYBR GreenⅠ熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。RT-PCR引物的設(shè)計(jì)用Primer5.0軟件，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的人TNFAIP8 mRNA序列，用β-actin作為內(nèi)參。TNFAIP8引物序列，正義：5'-TCCATCGCCACCACCTTA-3',反義-5'-CTCTGCCTCCTTCTTGTTTT-3'。 β-actin引物序列，正義：5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3',反義：5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。采用2-△△Ct法對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次，在細(xì)胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化液，待細(xì)胞呈單個(gè)存在時(shí)，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，離心收集細(xì)胞沉淀。用培養(yǎng)液重懸，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中(200 μl/孔)，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%左右，按照1.2.2中的分組設(shè)置轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞。分別在轉(zhuǎn)染12、24、36、48 h后，每組選擇6孔細(xì)胞，每孔加入0.5% MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO 150 μl，低速震蕩10 min。用調(diào)零孔調(diào)零，在490 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞的OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，在細(xì)胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞。用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整2×106個(gè)/ml，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2 ml/孔)，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，用移液槍垂直輕輕劃出一條細(xì)痕，用細(xì)胞刮刀刮除劃痕一側(cè)細(xì)胞，然后用PBS沖洗3次，將劃出來的細(xì)胞清洗干凈。按照1.2.2中的分組設(shè)置轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，在相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕寬度，每孔劃痕觀察6個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=轉(zhuǎn)染組平均寬度/空白對(duì)照組平均寬度。

1.2.6 Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)變化 取適量非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織，按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白。肺癌細(xì)胞A549轉(zhuǎn)染TNFAIP8-siRNA和siRNA陰性對(duì)照48 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。在細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解反應(yīng)30 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)BCA試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度，將稀釋至同一濃度的蛋白樣品與5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液充分混勻后，煮沸使蛋白質(zhì)變性。將變性蛋白樣品加入到SDS蛋白凝膠上樣孔中，每孔加入50 μl，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，PBS洗滌3次后用5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h，依次與一抗(500倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)孵育，滴加化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)顯色液，在暗室中曝光，對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織與癌旁組織中TNFAIP8 mRNA和蛋白表達(dá)差異 將癌旁組織中TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平設(shè)為1。肺癌組織中TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(5.42，4.29)，均顯著高于癌旁組織(P<0.01)。見圖1。

2.2 TNFAIP8-siRNA對(duì)肺癌A549細(xì)胞中TNFAIP8 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 將空白對(duì)照組肺癌A549細(xì)胞中TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平設(shè)為1 。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，TNFAIP8-siRNA轉(zhuǎn)染組肺癌A549細(xì)胞中TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(0.29，0.36)顯著降低(P<0.01)，而陰性對(duì)照組(0.95，0.92)與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明成功構(gòu)建了沉默TNFAIP8表達(dá)的肺癌A549細(xì)胞株。見圖2。

2.3 沉默TNFAIP8表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 沉默TNFAIP8基因的表達(dá)后，肺癌A549細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(P<0.01)，且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，TNFAIP8-siRNA組肺癌A549細(xì)胞的增殖能力逐漸降低；不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖1 肺癌組織與癌旁組織中TNFAIP8蛋白Western印跡結(jié)果

圖2 TNFAIP8-siRNA處理肺癌A549細(xì)胞TNFAIP8蛋白Western印跡結(jié)果

與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較：1)P<0.01圖3 沉默TNFAIP8表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

2.4 沉默TNFAIP8表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移的影響 將空白對(duì)照組肺癌A549細(xì)胞的遷移能力設(shè)為1。TNFAIP8-siRNA轉(zhuǎn)染組肺癌A549細(xì)胞遷移率(0.39)顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(0.96)(P<0.01)；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 沉默TNFAIP8表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，TNFAIP8-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.01)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖4。

表1 沉默TNFAIP8表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05

圖4 肺癌A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白Western印跡結(jié)果

3 討 論

目前初步確定的人類TNFAIP8家族成員有4個(gè)：TNFAIP8(TIPE)、TNFAIP8L1(TIPE1)、TNFAIP8L2(TIPE2)、TNFAIP8L3(TIPE3)，它們的序列具有高度的同源性，但是功能并不完全相同。TNFAIP8是研究較多的成員，在人體多種組織中均有表達(dá)，近年來發(fā)現(xiàn)TNFAIP8與腫瘤的形成密切相關(guān)，在乳腺癌〔7〕、卵巢癌〔8〕、胃癌〔9〕、肺癌〔10〕等多種癌癥組織中的表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織，并與腫瘤的臨床病理特征和不良預(yù)后存在一定的相關(guān)性〔11〕。

TNFAIP8還能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等眾多過程，如陳悅之〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，TNFAIP8在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，沉默TNFAIP8基因的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低，侵襲和遷移能力也受到抑制。楊大磊等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，TNFAIP8在卵巢癌組織中呈陽性表達(dá)，過表達(dá)TNFAIP8能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。吳素霞等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，沉默TNFAIP8基因能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖和遷移能力，同時(shí)能夠促進(jìn)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)沉默TNFAIP8基因的表達(dá)能夠抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖和遷移能力。MMPs是一類由結(jié)締組織分泌的肽鏈內(nèi)切酶，在細(xì)胞中廣泛存在，參與機(jī)體的多種生理和病理過程〔15〕。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、破壞組織屏障，在腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、遷移、侵襲等過程中起重要作用〔16〕。目前關(guān)于MMP-2和MMP-9在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用已進(jìn)行了較深入的研究，發(fā)現(xiàn)其在胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌等多種癌癥中的表達(dá)顯著高于癌旁組織〔17～19〕。因此MMP-2和MMP-9可作為一種分子標(biāo)志物，觀察癌細(xì)胞的浸潤(rùn)程度和轉(zhuǎn)移侵襲情況〔20〕。本研究結(jié)果說明TNFAIP8能夠通過調(diào)控MMP-2和MMP-9的表達(dá)調(diào)控肺癌A549細(xì)胞的遷移。

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〔2016-12-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

彭英東(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)科腫瘤的治療研究。

R734.2

A

1005-9202(2017)10-2382-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.015