不同抗褐變劑組合對(duì)海南龍血樹組織培養(yǎng)及抗褐變效果的影響

胡燕梅　方中明　鄭孝丹

摘要：[目的]探討不同抗褐變劑及其組合對(duì)海南龍血樹組織培養(yǎng)及抗褐變效果的影響，為其種苗的快速繁殖提供參考依據(jù)。[方法]采用3種抗褐變劑處理海南龍血樹外植體嫩莖，開展愈傷組織誘導(dǎo)與抗褐變?cè)囼?yàn)；在基本培養(yǎng)基MS中添加不同濃度的6-BA～和NAA組合，檢測(cè)其對(duì)海南龍血樹愈傷組織分化不定芽和叢生芽形成的影響。[結(jié)果]海南龍血樹嫩莖在0.1g/L半胱氨酸（Cys）溶液中浸泡10mind接種于含0.1g/L維生素c（Vc）的培養(yǎng)基中，褐變率比對(duì)照（cK）低，僅20.5%，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為75.5%；適宜龍血樹嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為6.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，誘導(dǎo)率為75.5%；適宜龍血樹芽增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為r4.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，增殖倍數(shù)為3.3。[結(jié)論]采用Cys和Vc兩種抗褐變劑組合處理可適當(dāng)減輕龍血樹組培過程中嫩莖的褐變程度，促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)；培養(yǎng)基中適當(dāng)添加6-BA和NAA可促進(jìn)愈傷組織的不定芽分化和叢生芽形成。

關(guān)鍵詞：海南龍血樹；愈傷組織；褐變；半胱氨酸（cys）；維生素c（vc）

中圖分類號(hào)：S722.37 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）11-2023-07

0引言

[研究意義]海南龍血樹（DracaenacambodianaPierreexGagnep.）為龍舌蘭科常綠灌木，生長十分緩慢，生命期長達(dá)八千年，被譽(yù)為植物壽星，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材血竭的兩種基源植物之一，主要分布于熱帶雨林，多用于園林觀賞。由于某些生態(tài)因子嚴(yán)重抑制種子萌發(fā)或小苗生長，海南龍血樹自然更新極差（鄭道君等，2009，2016），我國已將其定為珍稀瀕危植物，屬國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)樹種。目前海南龍血樹野生資源因遭受掠奪性采挖而急劇下降。隨著市場(chǎng)需求的增加，應(yīng)加快開展龍血樹野生資源繁育技術(shù)研究，并建立規(guī)范化、規(guī)?；纳a(chǎn)基地以滿足市場(chǎng)需求（黃莉雅等，2009）。規(guī)?；N植基地的培育首先需要規(guī)?；N苗的生產(chǎn)，而海南龍血樹較難收獲種子，繁殖率較低，通過植物組織培養(yǎng)繁育種苗又存在愈傷組織褐化嚴(yán)重等問題。因此，探討海南龍血樹的組織培養(yǎng)及其抗褐變措施，對(duì)龍血樹種苗的快速繁育和資源的保護(hù)利用具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]楊曉虹等（2009）研究了劍葉龍血樹愈傷組織的形成，結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重褐化；黃莉雅等（2010）以劍葉龍血樹芽為外植體誘導(dǎo)芽分化，同時(shí)探討了聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和活性碳（AC）防褐化的效果；靳靜晨等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，海南龍血樹可以頂芽或腋芽為外植體誘導(dǎo)叢生芽形成，但這種外植體取材方式會(huì)消耗大量母本材料；羅冠勇等（2012）以海南龍血樹側(cè)芽和頂芽為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)可減輕褐變，提高誘導(dǎo)率；齊安民等（2015）提出控制普通也門鐵莖段褐化效果最理想的培養(yǎng)基為MS+0.25g/LVc+0.50g/LNa₂S₂O₃；吳雪松等（2017）以海南龍血樹頂芽和莖段為外植體在含6-BA和NAA的培養(yǎng)基中可獲得愈傷組織和不定芽。[本研究切入點(diǎn)]海南龍血樹為木本植物，其外植體莖段前期培養(yǎng)形成愈傷組織過程中褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，影響愈傷組織的形成和再分化，難以快速繁殖，而目前針對(duì)抗褐變現(xiàn)象開展的試管苗快速生產(chǎn)研究鮮見報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]探討海南龍血樹愈傷組織初始培養(yǎng)階段的抗褐變措施及后期試管苗增殖的適宜激素組合，為海南龍血樹種苗工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

海南龍血樹購于武漢堤角花卉市場(chǎng)。常規(guī)消毒流程為：取健康植株長約5.0cm幼嫩莖段，置于洗潔精中泡3-5min后用自來水沖洗30min，再用蒸餾水沖洗5次；將幼嫩莖段置于超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30s，無菌水沖洗1次，再用0.1%HgCl₂溶液泡8min，無菌水反復(fù)沖洗4次。將消毒后的莖段切成長約1.0cm的小段，每個(gè)莖段盡量帶一個(gè)腋芽，接種于各試驗(yàn)組培養(yǎng)基中。接種材料均置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度1500lX，光照時(shí)間10h/d。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體莖段愈傷組織誘導(dǎo)與抗褐變?cè)囼?yàn) 以MS+30.0g/L蔗糖+5.6g/L瓊脂+6.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA（pH=5.8±0.2）為基本培養(yǎng)基，以海南龍血樹嫩莖為外植體，經(jīng)過常規(guī)消毒流程后直接接種于基本培養(yǎng)基中為對(duì)照（CK）；選擇半胱氨酸（Cys）、維生素c（vc）和AC3種抗褐變劑，設(shè)Ⅰa-Ⅰe、Ⅱa-Ⅱi、Ⅲa-Ⅲg和Ⅳa-Ⅳb共23個(gè)處理（表1）。

1.2.26-BA和NAA組合對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以MS+30.0g/L蔗糖+5.6g/L瓊脂+0.1mg/LVc（pH=5.8+0.2）為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別添加6.0、4.0和2.0mg/L3個(gè)水平的6-BA及0.5和1.0mg/L2個(gè)水平的NAA，切好的海南龍血樹莖段均在0.1g/LCys溶液中浸泡10min后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，以檢測(cè)6-BA和NAA組合對(duì)莖段愈傷組織的誘導(dǎo)效果。

1.2.36-BA與NAA組合對(duì)叢生芽增殖的影響

以MS+30.0g/L蔗糖+5.6g/L瓊脂為增殖培養(yǎng)基，添加6.0、4.0和2.0mg/L3個(gè)水平的6-BA及0.2和0.5mg/L2個(gè)水平的NAA，將1.2.2中愈傷組織上得到的海南龍血樹芽切成有4-6個(gè)芽的叢生芽小塊，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，以檢測(cè)6BA和NAA組合對(duì)叢生芽增殖的影響。

1.3測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1和1.2.2中各處理均培養(yǎng)45d后觀察愈傷組織長勢(shì)，以“-”表示無愈傷組織形成，“+”表示有愈傷組織形成，“+”越多表示愈傷組織長勢(shì)越好。1.2.3中各處理的叢生芽生長狀況記錄同愈傷組織生長狀況表示。統(tǒng)計(jì)有效接種數(shù)（接種培養(yǎng)45d后未污染的接種數(shù)），記錄誘導(dǎo)率、褐變率、芽增殖倍數(shù)及長勢(shì)狀況。同時(shí)對(duì)材料的生長狀態(tài)進(jìn)行拍照。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=（有效接種數(shù)中形成愈傷組織的莖段數(shù)/有效接種數(shù)）×100

褐變率（%）=（褐化的外植體莖段數(shù)/有效接種數(shù)）×100

叢生芽增殖率（%）=（增殖的叢生芽團(tuán)數(shù)/接種的叢生芽團(tuán)數(shù)）×100

不定芽分化率（%）=（再生不定芽的愈傷組織數(shù)/愈傷組織數(shù)）×100

叢生芽增殖倍數(shù)=增殖后芽總數(shù)/接種芽數(shù)

1.4統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以SPSS18.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1抗褐變處理對(duì)海南龍血樹莖段愈傷組織誘導(dǎo)和褐變的影響

接種培養(yǎng)15d后部分嫩莖邊緣處少量開始愈傷化，褐變得到有效控制，但大部分嫩莖褐變嚴(yán)重，且邊緣處無愈傷化跡象（圖1）；培養(yǎng)45d后已形成的愈傷組織多為綠色致密的桑葚狀（圖2）。

2.1.1單一抗褐變方式處理的抗褐變結(jié)果 由表2可知，CK的愈傷組織誘導(dǎo)率為0，褐變率達(dá)100.0%，完全無生長跡象；Ⅰa～Ⅰe5種抗褐變處理中，Ⅰa～Ⅰc處理的愈傷組織誘導(dǎo)率均為0，說明直接在培養(yǎng)基中加入抗褐變劑效果較差；Ⅰe處理的誘導(dǎo)率為50.4%，顯著高于CK及其他單一抗褐變劑處理（P<0.05，下同），且褐變率僅35.5%，顯著低于CK及其他大部分抗褐變處理（Ⅰb處理褐變率為0），說明海南龍血樹嫩莖在Cys溶液中浸泡10min后再接種（Ⅰe處理），其愈傷組織誘導(dǎo)和抗褐變效果較好。

2.1.22種抗褐變方式組合處理的抗褐變結(jié)果

由表3可知，Ⅱa-Ⅱd處理的外植體經(jīng)Cys或Vc浸泡后再接人含Vc或Cys的培養(yǎng)基中，其愈傷組織誘導(dǎo)率較CK均顯著增加，褐變率顯著降低，其中，Ⅱb處理的抗褐變效果最佳，其愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)75.5%，顯著高于其他組合方式處理，褐變率也較低，僅20.5%，說明外植體在Cys溶液中浸泡10min后再接種到加有0.1g/LVc的培養(yǎng)基中，既可提高嫩莖的愈傷誘導(dǎo)率，又能降低褐變率；由表2和表3可知，Ⅱb與Ⅰe處理相比，其抗褐變效果也有所提高，褐變率下降15.0%（絕對(duì)值，下同），愈傷組織誘導(dǎo)率提高25.1%，說明外植體莖段經(jīng)Cys浸泡后加入含Vc的培養(yǎng)基中，其愈傷組織誘導(dǎo)及抗褐變效果比單獨(dú)浸泡Cys效果更佳；Ⅱe～Ⅱh處理的愈傷組織誘導(dǎo)率和褐變率均為0，而這些培養(yǎng)基中均有AC存在，說明抗褐變劑AC加入培養(yǎng)基中雖能控制褐變卻不能誘導(dǎo)愈傷；Ⅱi處理中沒有愈傷組織形成，褐變率也較高，印證了表1中Ⅰa+Ⅰb處理的抗褐變效果。

2.1.33種抗褐變方式組合處理的抗褐變結(jié)果

由表4可知，Ⅲa-Ⅲb處理的愈傷組織誘導(dǎo)率為0，且褐變嚴(yán)重；而Ⅲc-Ⅲg處理的褐變率雖為0，但誘導(dǎo)率也為0，即外植體既不能形成愈傷組織也未發(fā)生褐變，可能是由于Ⅲc-Ⅲg處理培養(yǎng)基中含有抗褐變劑AC所致，印證了表3中Ⅱe～Ⅱh處理的研究結(jié)果；在2.1.2中Ⅱb處理的抗褐變效果最佳，但Ⅲb處理的誘導(dǎo)率卻為0，而Ⅲb處理比Ⅱb處理的培養(yǎng)基中僅多了抗褐變劑Cys，可能是Cys和Vc反應(yīng)產(chǎn)生了某種物質(zhì)，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)加有Vc和Cys的培養(yǎng)基均有難聞氣味產(chǎn)生，導(dǎo)致誘導(dǎo)愈傷組織效果較差。

2.1.44種抗褐變方式組合處理的抗褐變結(jié)果由表5可知，Ⅳa和Ⅳb處理的褐變率均為0，其愈傷組織誘導(dǎo)率也為0，可能也是培養(yǎng)基中均加有抗褐變劑AC所致。

綜合分析表2～表5結(jié)果可知，在培養(yǎng)基中加入AC處理的海南龍血樹外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率和褐變率均為0，即外植體莖段在加入AC的培養(yǎng)基中雖未褐變但也無任何生長跡象，說明AC在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)也吸附了培養(yǎng)基中的激素從而使其失去作用，影響了外植體的進(jìn)一步生長發(fā)育。

綜上所述，Ⅱb處理即外植體浸泡Cys后接種在加有Vc的培養(yǎng)基上，其抗褐變效果最佳，褐變率僅20.5%，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)75.5%，生長狀況也較佳（圖3），當(dāng)愈傷組織長大到一定體積后產(chǎn)生了叢生芽（圖4）。

2.26-BA和NAA組合對(duì)海南龍血樹外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

海南龍血樹外植體莖段接種15d后觀察，莖段邊緣處開始發(fā)生愈傷跡象，30d時(shí)部分較大的愈傷組織表面出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，40d后綠色愈傷組織上均分化出小不定芽（圖3）。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果如表6所示，結(jié)果顯示，最適宜龍血樹嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)的激素組合為6.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，誘導(dǎo)率為75.5%。

2.36-BA和NAA組合對(duì)叢生芽增殖的影響

叢生芽接種20d后芽叢表面開始出現(xiàn)新的芽點(diǎn)，新芽均為嫩綠色；培養(yǎng)45d后接種的叢芽基部側(cè)邊增殖了新芽，叢生芽增殖率均達(dá)100.0%，但芽增殖倍數(shù)存在差異，同時(shí)仍有少數(shù)芽叢基部發(fā)生了褐變（圖4）。由表7可看出，各處理叢生芽增殖率均達(dá)100.0%，表明6-BA+NAA組合對(duì)海南龍血樹叢生芽增殖效果明顯，各處理雖然均有增殖，但增殖倍數(shù)差異顯著。當(dāng)6-BA濃度相同時(shí)，0.2mg/LNAA處理較0.5mg/LNAA處理更有利于叢生芽增殖；當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度增加，其增殖倍數(shù)呈先增后降的變化趨勢(shì)，其中4.0mg/L6-BA處理的叢生芽增殖倍數(shù)均最高，分別達(dá)3.3和1.2，說明添加0.2mg/LNAA比添加0.5mg/LNAA整體效果更好。

3討論

外植體的木質(zhì)化程度越高、切面與體積的比率越大，其褐化程度越嚴(yán)重；消毒劑對(duì)外植體的損傷程度越嚴(yán)重，褐化程度也越高（馮代弟等，2015），木本植物的外植體莖段在愈傷組織誘導(dǎo)階段容易產(chǎn)生褐變。楊瑞瑋（2012）報(bào)道硫代硫酸鈉能有效控制林蔭銀蓮花外植體褐變；譚誼談和曾凱芳（2014）研究得出Cys和Vc處理可有效降低鮮切芋艿貯藏期間褐變度的結(jié)論。本研究選取3種抗褐變劑在兩種不同方式下的23種處理對(duì)海南龍血樹莖段初始培養(yǎng)階段的抗褐變效果試驗(yàn)，取得了較理想的抗褐變效果。其中，以外植體莖段浸泡cvs溶液后接種于含有Vc的培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)和抗褐變效果較好，可能是嫩莖在Cys溶液中浸泡后對(duì)傷口有保護(hù)作用，而Vc又可以降低莖段傷口的氧化程度，所以能達(dá)到既降低褐變又提高愈傷化的目的。

6-BA是植物組織培養(yǎng)過程中常用的細(xì)胞分裂素之一。本研究在基本培養(yǎng)基中添力14.0mg/L6-BA后海南龍血樹叢生芽增殖倍數(shù)最高，且增殖的芽長勢(shì)最好，與何旭君等（2006）、陳梅和莫饒（2008）對(duì)海南龍血樹的研究結(jié)果相似；但6-BA濃度高7：4.0mg/L后叢生芽增殖倍數(shù)下降。

試驗(yàn)過程中將海南龍血樹愈傷組織上的叢生芽切割進(jìn)行芽增殖時(shí)其叢生芽增殖效果較好，但直接將龍血樹上的芽消毒后作為外植體進(jìn)行接種時(shí)，其芽增殖效果卻較差，芽下端僅愈傷化而未發(fā)生叢生芽。薛鷹等（2007）的試驗(yàn)結(jié)果也提出以海南龍血樹的單芽為外植體誘導(dǎo)率降低，以單芽為外植體接種更易脫分化形成愈傷組織，但在繼代增殖過程中，以叢芽為接種材料對(duì)芽的增殖數(shù)和生長均比單芽有利。本研究還發(fā)現(xiàn)，海南龍血樹外植體莖段切割方式對(duì)試驗(yàn)的影響也很重要，由于海南龍血樹是木本植物，其莖中央木質(zhì)化嚴(yán)重，所以外植體切塊時(shí)要除去中央木質(zhì)化部分，且外植體上盡可能帶一個(gè)腋芽，這樣的帶芽莖段作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的概率較高，外植體上腋芽抽生小芽的可能性也很高，與吳繁花等（2005）的研究結(jié)果相似。靳靜晨等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，海南龍血樹以帶腋芽的莖段為外植體也可直接進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，但目前此類研究報(bào)道較少。

李克烈等（2006）以海南龍血樹種子為外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)出芽的方式可快速繁殖海南龍血樹植株，而本研究是以嫩莖為外植體誘導(dǎo)愈傷組織并獲得叢生芽的方式，從而快速繁殖海南龍血樹種苗，在外植體選取上有一定區(qū)別。

4結(jié)論

采用Cys和Vc兩種抗褐變劑組合處理可適當(dāng)減輕龍血樹組培過程中嫩莖的褐變程度，促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)；培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度6-BA和NAA可促進(jìn)愈傷組織上不定芽的分化和叢生芽的形成。

（責(zé)任編輯鄧慧靈）