Yes相關(guān)蛋白在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中的表達及與細(xì)胞增殖的相關(guān)性分析

鄧慧儀 李美嬌 王瑋豪 黃雪琨 黃健聰 張革化 楊欽泰

【摘要】目的檢測Yes相關(guān)蛋白（YAP）在慢性鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）中的表達情況，初步探討YAP在CRSwNP發(fā)病機制中的作用。方法收集對照組（13例）的下鼻甲黏膜和CRSwNP組（27例）的鼻息肉，采用實時熒光定量PCR的方法檢測組織中YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA的表達情況，并分析相關(guān)性。結(jié)果鼻息肉組織中YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA的相對表達量均高于對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<005）。YAP mRNA相對表達水平分別與TEAD1、TSLP、IL33、Ki67 mRNA相對表達水平呈正相關(guān)（rs=0568；rs=0693；rs=0745；rs=0561；P均<001）。結(jié)論YAP可能參與了CRSwNP的發(fā)病機制，并且可能與TSLP、IL33等上皮因子的表達增加從而介導(dǎo)鼻息肉細(xì)胞增殖有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】Yes相關(guān)蛋白；鼻息肉；上皮因子；細(xì)胞增殖；Ki67

Correlation analysis between expression levels of Yesassociated protein and cell proliferation in chronic rhinosinusitis with nasal polypsDeng Huiyi， Li Meijiao， Wang Weihao， Huang Xuekun， Huang Jiancong， Zhang Gehua， Yang Qintai Department of OtorhinolaryngologyHead and Neck Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University， Guangzhou 510630， China

Correspongding author，Yang Qintai， Email：yangqt@163com

【Abstract】ObjectiveTo measure the expression levels of Yesassociated protein （YAP） in chronic sinusitis with nasal polyps（CRSwNP） and preliminarily investigate the effect of YAP upon the pathogenesis of CRSwNP MethodsThe inferior turbinates mucosa was collected in the control group（n=13） and nasal polyp tissue was obtained in the CRSwNP group（n=27） Fluorescent quantitative RTPCR was performed to quantitatively measure the expression levels of YAP， TEAD1， TSLP， IL33 and Ki67 mRNA， and correlation analysis was conducted ResultsThe relative expression levels of YAP， TEAD1， TSLP， IL33 and Ki67 mRNA in the CRSwNP tissues were significantly higher compared with those in the control group（all P<005） The relative expression level of YAP mRNA was positively correlated with that of TEAD1 （rs=0568， P=0002）， TSLP （rs=0693， P<0001）， IL33 （rs=0745， P<0001） and Ki67 mRNA （rs=0561， P<0001） ConclusionsYAP is probably involved with the pathogenesis of CRSwNP It can mediate the cell proliferation of CRSwNP probably through upregulating the expression levels of TSLP， IL33 and other epithelial factors

【Key words】Yesassociated protein； Chronic sinusitis with nasal polyps； Epithelial factor；

Cell proliferation； Ki67

慢性鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）是耳鼻喉科最常見的疾病之一，變態(tài)反應(yīng)和感染性炎癥反應(yīng)均為重要病因，但具體發(fā)病機制目前尚未完全闡明[1]。有研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞增殖的核蛋白Ki67抗原在鼻息肉組織中表達增加，提示鼻息肉組織中存在細(xì)胞過度增殖、組織重塑等表現(xiàn)，但鼻息肉細(xì)胞增殖如何被調(diào)控則未進一步探討[23]。Yes 相關(guān)蛋白（YAP）是Hippo通路的關(guān)鍵蛋白，研究表明該通路可調(diào)控器官體積、細(xì)胞增殖、組織再生等，目前在腫瘤細(xì)胞增殖中研究較多，且YAP廣泛存在于機體各主要細(xì)胞中，但YAP是否調(diào)控鼻息肉細(xì)胞非正常的增殖則未見報道，故本研究旨在檢測YAP在鼻息肉組織中表達情況并初步探討YAP是否與鼻息肉細(xì)胞增殖有關(guān)[48]。

對象與方法

一、研究對象

鼻息肉標(biāo)本27例，來自2017年1月至5月在我院住院手術(shù)治療的CRSwNP患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照2012年歐洲鼻竇炎和鼻息肉指南[9]。男21例、女6例，年齡（3454±1167）歲。所有患者術(shù)前至少4周內(nèi)無全身或局部使用過任何激素類藥物。另取下鼻甲黏膜13例作對照組，其中男11例、女2例，年齡（4193±1384）歲，該標(biāo)本來自腦脊液鼻漏、視神經(jīng)管骨折或慢性淚囊炎等患者，因術(shù)中暴露解剖結(jié)構(gòu)的需要而切除的正常下鼻甲（表1）。所有患者均已簽署知情同意書，并且已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

表1患者臨床特點匯總表組別男∶女年齡病程對照組11∶23454±1167373±165CRSwNP組21∶64193±1384423±221t值--1658-0718P值1000a01050477注：aFisher確切概率法

二、方法

1標(biāo)本采集與處理

采集對照組下鼻甲或?qū)嶒灲M鼻息肉組織1份，用生理鹽水洗去血跡和分泌物后，把組織浸潤于RNALater中并剪碎，4℃過夜，吸取RNALater后，-80℃保存，備qRTPCR。分別檢測各組織中YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA的表達。

2實時熒光定量PCR檢測方法

組織在液氮中研磨后，采用Trizol試劑提取組織總RNA，以1 μg RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，兩步法逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)： 42℃ 2 min去除基因組DNA； 37℃ 15 min，85℃ 5 s逆轉(zhuǎn)錄。三步法實時熒光定量PCR反應(yīng)：95℃ 5 min預(yù)變性；95℃ 15 s退火，60℃ 15 s解鏈，72℃ 32 s延伸，40個循環(huán)。引物序列見表2。結(jié)果分析：ΔCT= （ΔCT。xΔCT β2M），基因相對表達量=2ΔCT，其中x為目標(biāo)基因，β2M為內(nèi)參。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 200軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。2組性別的組間差異采用Fisher確切概率法，年齡和病程的組間差異采用兩組獨立樣本t檢驗。CRSwNP組與對照組的YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA的表達差異采用MannWhitney檢驗。CRSwNP組的YAP mRNA與TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA之間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA在鼻息肉和正常下鼻甲組織中的表達水平

CRSwNP組鼻息肉組織和對照組下鼻甲均可檢測到Y(jié)AP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA表達（表3）。CRSwNP組中各指標(biāo)的表達均高于對照組，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<005）。

二、YAP mRNA分別與TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA之間的相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)性分析表明，在鼻息肉組織中（n=27），YAP mRNA相對表達水平與TEAD1 mRNA相對表達水平呈正相關(guān)（rs=0568；P=0002，圖1A）；YAP mRNA相對表達水平與TSLP mRNA相對表達水平呈正相關(guān)（rs=0693；P<0001，圖1B）； YAP mRNA相對表達水平與IL33 mRNA相對表達水平呈正相關(guān)（rs=0745；P<0001，圖1C）；YAP mRNA相對表達水平與Ki67 mRNA相對表達水平呈正相關(guān)（rs=0561；P=0002，圖1D）。

討論

鼻息肉形成的發(fā)病機制目前尚未完全清楚，鼻息肉上皮細(xì)胞增殖過度活躍是鼻息肉典型的病理特征之一。Ki67是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)記，本研究中發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中Ki67表達水平高于對照組的鼻黏膜組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示鼻息肉組織的細(xì)胞增殖活性高于正常鼻黏膜組織，符合鼻息肉上皮增生、間質(zhì)水腫，腺體增多的病理狀態(tài)，也與Zhao等[10]研究結(jié)果相符。但正常的鼻黏膜如何發(fā)

表3YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA在對照組下鼻甲及

鼻息肉組織中的表達水平中位數(shù)（四分位數(shù)間距）組別YAPTEAD1TSLPIL33Ki67對照組0372（0388）0176（0182）0017（0033）04390（0366）0008（00115）CRSwNP組290（267）0322（1032）0047（013）0703（0983）0066（0081）Z值-4260-2469-2744-3119-4232P值<000100130005<0001<0001

圖1鼻息肉組織中YAP與TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA的相關(guān)性分析展成鼻息肉以及鼻息肉細(xì)胞過度增殖又是如何被調(diào)控的目前研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中存在凋亡相關(guān)蛋白Fas、FasL和Ki67的平衡失調(diào)，鼻息肉細(xì)胞凋亡抑制而增殖活性加強從而導(dǎo)致上皮組織增生、重塑[1112]。也有研究發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤導(dǎo)致鼻黏膜組織損傷，病理狀態(tài)下上皮修復(fù)從而導(dǎo)致組織增生[1315]。但這些研究并未解答鼻息肉組織中Ki67活性是如何被調(diào)控增強從而使鼻息肉細(xì)胞增殖過度活躍最后導(dǎo)致組織增生。

YAP是Hippo通路的主要蛋白，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和組織大小等方面發(fā)揮重要作用。該通路主要由哺乳動物 STE20 樣激酶1/2（MST1/2）和磷酸化腫瘤抑制基因（LATS1/2）組成的激酶級聯(lián)激活，最終使 Hippo信號通路的主要效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子YAP和具有 PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活物（TAZ）去磷酸化入核，然后結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TEAD14，從而轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平參與細(xì)胞的增殖、分化和死亡等[4]。目前YAP在腫瘤方面研究較多，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中Hippo通路活化，YAP表達增加可使Ki67表達增加從而使肝癌細(xì)胞增殖活躍，提示機體在病理狀態(tài)下可由YAP調(diào)控Ki67表達從而使細(xì)胞增殖過度活躍[16]。但在鼻息肉組織中YAP是否與Ki67表達有關(guān)則未見報道。

本研究通過檢測鼻息肉組織中YAP及其核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TEAD1 mRNA相對表達水平，發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中YAP及TEAD1表達均比對照組高，提示病理狀態(tài)下鼻黏膜組織中YAP激活。本研究接著探討鼻息肉組織中YAP活化是否與細(xì)胞過度增殖有關(guān)，通過分析鼻息肉組織中YAP和Ki67 mRNA相對表達水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)，提示鼻息肉細(xì)胞增殖過度活躍與YAP有關(guān)，即YAP參與了鼻息肉的形成機制，調(diào)控細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致組織增生。

鼻息肉形成與上皮受損激發(fā)炎癥反應(yīng)有關(guān)，近年來研究發(fā)現(xiàn)鼻黏膜上皮受到刺激后可分泌TSLP、IL33等固有免疫因子[2， 1720]。因此，本研究還進一步探討TSLP、IL33等因子是否與YAP調(diào)控Ki67從而使細(xì)胞增殖過度活躍有關(guān)，發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中TSLP、IL33的mRNA相對表達水平較對照組高，且均與YAP高表達呈正相關(guān)，提示鼻息肉組織中YAP活化可能與上皮受損釋放TSLP、IL33等因子有關(guān)。

Hippo通路作為一種控制組織和器官大小的新型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，目前在鼻黏膜慢性炎癥發(fā)病中仍未見報道。本研究通過檢測鼻息肉YAP、TEAD1、Ki67、TSLP、IL33等mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)鼻息肉中存在Hippo通路的活化，再進一步發(fā)現(xiàn)YAP與Ki67表達增加呈正相關(guān)，初步提示鼻息肉中細(xì)胞過度增殖與YAP有關(guān)。同時鼻黏膜上皮受損后釋放的TSLP、IL33表達上調(diào)也與YAP正相關(guān)，表明鼻黏膜上皮受損可能活化了YAP的活性，從而介導(dǎo)細(xì)胞、組織的過度增殖，但具體機制仍需更多的研究進一步證實。

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（收稿日期：20170606）

（本文編輯：楊江瑜）