納米羥基磷灰石對(duì)卵巢癌細(xì)胞株的抑制作用研究

韓麗麗 張慧慧 馬慧芳 付莉

【摘要】目的研究納米羥基磷灰石（nHAP）對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3生長(zhǎng)的影響及其作用機(jī)制。方法培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，分別計(jì)算出nHAP對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的30%、50%、70%抑制濃度（IC30、IC50、IC70），繪制量效曲線和時(shí)效曲線。選用IC50的nHAP作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞48 h，與無nHAP的對(duì)照組卵巢癌SKOV3細(xì)胞對(duì)比，分別進(jìn)行透射電鏡觀察、流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果 nHAP作用48 h后，不同濃度nHAP對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞均表現(xiàn)出抑制作用，nHAP對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的IC30、IC50、IC70分別為946、2883、6080 mg/L。IC30、IC50、IC70的nHAP作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞 48 h期間，抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，48 h后抑制率增速變緩。形態(tài)學(xué)觀察和定量分析顯示IC50的nHAP作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞48 h可誘導(dǎo)其凋亡，其凋亡率為（4332±1253）%，對(duì)照組為（1088±548）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），且與對(duì)照組比較，IC50的nHAP作用下的卵巢癌SKOV3細(xì)胞G0/G1期百分比高、S期細(xì)胞百分比低（P均<005）。結(jié)論nHAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能是nHAP作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞的S期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】納米羥基磷灰石；卵巢癌；細(xì)胞株

Effect of nanoscale hydroxyapatite on ovarian cancer cell lineHan Lili， Zhang Huihui， Ma Huifang， Fu Li Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Hospital of Jilin University， Changchun 130041， China

Corresponding author， Fu Li， Email：doctorfuli@sinacom

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of nanoscale hydroxyapatite （nHAP） upon the growth of ovarian cancer cell line SKOV3 MethodsThe ovarian cancer cell line SKOV3 was cultured The 30%， 50% and 70%inhibitory concentrations （IC30， IC50 and IC70） of nHAP upon the ovarian cancer cell line SKOV3 were calculated， and the doseeffect and timeeffect curves were delineated The SKOV3 cells treated with IC50 of nHAP and those untreated with nHAP were prepared for transmission electron microscopic observation and flow cytometry detection ResultsAfter nHAP treatment for 48 h， different concentrations of nHAP could inhibit the growth of ovarian cancer SKOV3 cells The IC30， IC50 and IC70 of ovarian cancer SKOV3 cells were calculated as 946， 2883 and 6080 mg/L， respectively During the 48h period of different concentrations of nHAP treatment， the inhibitory rate was elevated over time and remained slow and stable after 48 h Morphological observation and quantitative analysis demonstrated that 48h treatment with IC50 of nHAP could induce the apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells with a apoptosis rate of （4332±1253）%， significantly higher compared with （1088±548）% in the control group（P<005） Compared with the control group， the percentage of SKOV3 cells at G0/G1 phase was significantly higher， whereas the proportion of SKOV3 cells at S phase was considerably lower after treatment with IC50 of nHAP（both P<005） ConclusionsnHAP exerts significant effect upon suppressing the growth of ovarian cancer cell line SKOV3 The underlying mechanism is probably that nHAP affects the ovarian cancer SKOV3 cells during the S phase and induces the apoptosis of cancer cells

【Key words】Nanoscale hydroxyapatite； Ovarian cancer； Cell line

羥基磷灰石（HAP）的主要成分為鈣和磷，因其生物相容性作用，常被用作骨修復(fù)生物材料[1]。近年研究報(bào)道，納米HAP（nHAP）本身也具有抑制結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞的作用[27]。目前筆者尚未見nHAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制研究，為此本研究觀察了nHAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的生長(zhǎng)抑制作用，并進(jìn)一步深入探討其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、材料

卵巢癌細(xì)胞株SKOV3由吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦科實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清、碘化丙啶（PI）、胰酶、MTT選自美國(guó)Sigma公司，其余試劑均選自國(guó)產(chǎn)分析純。nHAP長(zhǎng)約60～80 nm，半徑約5～10 nm。

二、方法

1卵巢癌SKOV3細(xì)胞的培養(yǎng)

適宜條件下于含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，隔日換液，按1∶3的比例傳代。

2卵巢癌SKOV3細(xì)胞在nHAP中的生長(zhǎng)情況檢測(cè)

將nHAP用培養(yǎng)液配成 10種梯度濃度（10、20、50、100、150、200、250、300、350、400 mg/L），選對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。接種于96孔板，孵箱培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，分別加入調(diào)配好的10種梯度濃度nHAP液，對(duì)照組為等量卵巢癌SKOV3細(xì)胞加等量培養(yǎng)液，每濃度設(shè)8復(fù)孔，48 h后每孔再加5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸凈液體后每孔加入150 μl二甲亞砜。均勻搖動(dòng)10 min，酶標(biāo)儀測(cè)OD450值（OD值）。計(jì)算nHAP作用下的細(xì)胞抑制率，繪制量效曲線，并分別計(jì)算出nHAP 對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的30%、50%、70%抑制濃度（IC30、IC50、IC70）。同法接種96孔板，24 h后棄培養(yǎng)液，此時(shí)分別加入IC30、IC50和IC70的nHAP，培養(yǎng)24、48、72、96、120、144 h時(shí)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制情況，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。繪制這3種濃度nHAP下卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)效曲線。細(xì)胞存活率（%）=（試驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%；細(xì)胞抑制率（%）=1-（試驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%[4]。

3nHAP作用后卵巢癌SKOV3細(xì)胞的形態(tài)觀察

48 h后收集對(duì)照組和IC50的nHAP作用下的卵巢癌SKOV3細(xì)胞（試驗(yàn)組），戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，1%OsO4再固定，PBS再清洗。脫水后以Epon812樹脂包埋3 h，切片、雙重染色后用透射電子顯微鏡觀察。

4細(xì)胞周期分析

流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期的比例，用Sub G1峰法分析各組細(xì)胞的凋亡率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 190處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示。P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、nHAP作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞的量效曲線

nHAP作用48 h后，10種不同濃度nHAP對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞均表現(xiàn)抑制作用，見圖1。當(dāng)nHAP濃度≤100 mg/L時(shí)，抑制率隨濃度增高而增高。當(dāng)HAP濃度>100 mg/L后，抑制率增加速度變緩。nHAP對(duì)SKOV3的IC30、IC50、IC70分別為946、2883、6080 mg/L。

圖1nHAP作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞48 h的量效曲線

二、nHAP作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞的時(shí)效曲線

IC30、IC50、IC70的nHAP作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞48 h期間，抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，48 h后抑制率增速變緩，見圖2。

三、nHAP對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

1光鏡下細(xì)胞形態(tài)

光鏡下，對(duì)照組卵巢癌SKOV3細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，呈略圓形或多角形，核較大，多為單核，可見較多核分裂相。與對(duì)照組相比，經(jīng)IC50 nHAP作用48 h的試驗(yàn)組SKOV3細(xì)胞密度降低，細(xì)胞間隙增寬，且形態(tài)不規(guī)則，核分裂相減少，見圖3。

與無nHAP的對(duì)照組卵巢癌SKOV3細(xì)胞對(duì)比，試驗(yàn)組G0/G1期百分比高，S期細(xì)胞百分比低，2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<005），2組G2/M期細(xì)胞百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。試驗(yàn)組凋亡率高于對(duì)照組（P<005），見表1。

討論

1992年Hideki等采用液相沉淀法合成納米羥基磷灰石微晶體，并意外發(fā)現(xiàn)HAP微晶體對(duì)Ca9表1IC50的nHAP對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期和凋亡率的影響（±s）%組別例數(shù)細(xì)胞周期G0/G1期S期G2/M期凋亡率對(duì)照組106065±5722598±4541337±6551088± 548試驗(yàn)組106833±4001893±2711273±3484332±1253t值3479421702737501P值000300010789<0001腫瘤細(xì)胞的增殖也有明顯的抑制作用。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)HAP納米粒子對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用[27]。

本研究顯示，nHAP能抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)nHAP≤100 mg/L時(shí)，nHAP對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制率隨濃度增高而增高，而IC30、IC50、IC70的nHAP在48 h內(nèi)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，表明48 h內(nèi)為其敏感期。

目前尚未明確nHAP對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制機(jī)制，本研究為了探討nHAP抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，首先對(duì)SKOV3 細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組細(xì)胞呈凋亡形態(tài)學(xué)改變，胞核和胞漿內(nèi)有大量的nHAP，因此考慮為nHAP體積小，可通過胞膜、核膜引起DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。有學(xué)者認(rèn)為，nHAP非特異性的吞噬能力與黏附能力密切相關(guān)。納米級(jí)材料具有較大的表面能，與非nHAP相比更容易被腫瘤細(xì)胞所吞噬[89]。

本研究還通過流式細(xì)胞儀定量分析了對(duì)照組與試驗(yàn)組的細(xì)胞周期所占比例和凋亡率。在細(xì)胞周期中，正常情況下細(xì)胞一旦進(jìn)入S期、開始合成DNA，就會(huì)不間斷地、有順序地通過細(xì)胞的各個(gè)周期，完成細(xì)胞分裂，直至G1期，因此細(xì)胞的增殖通常是由DNA合成開始所控制的。本研究顯示，用藥組的S期細(xì)胞明顯少于對(duì)照組，而G0/G1期細(xì)胞多于對(duì)照組，因此我們認(rèn)為nHAP作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞的S期，使其凋亡，不能達(dá)到G2期，最終不能完成細(xì)胞分裂和增殖。

綜上所述，nHAP有抑制卵巢癌細(xì)胞株SKOV3生長(zhǎng)的作用，其機(jī)制可能是nHAP作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞的S期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：20170605）

（本文編輯：林燕薇）