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    不同細(xì)胞系中培養(yǎng)毒害艾美耳球蟲對比研究

    2017-05-30 10:48:04楚德軍劉建平
    畜牧獸醫(yī)科學(xué) 2017年4期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)

    楚德軍 劉建平

    摘要:在體外培養(yǎng)的過程中,細(xì)胞系是影響球蟲發(fā)育的主要因素。本研究主要對比不同細(xì)胞系對于毒害艾美耳球蟲發(fā)育的影響。5種不同的細(xì)胞系在37℃,5% CO2在6孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞融合。將純化好的子孢子在分別37℃和 41℃入侵細(xì)胞。利用HE 染色地方法檢測細(xì)胞內(nèi)毒害艾美耳球蟲的發(fā)育程度。所有的細(xì)胞系均有球蟲入侵。VERO細(xì)胞中,毒害艾美耳球蟲的發(fā)育最好。在VERO細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度血清和葉酸,觀察球蟲發(fā)育情況,確定最佳實(shí)驗(yàn)條件,為下一步研究做好準(zhǔn)備。

    關(guān)鍵詞:毒害艾美耳球蟲;細(xì)胞培養(yǎng);VERO細(xì)胞

    中圖分類號:S858.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B 文章編號:2096-3637(2017)04-0001-03

    1 概述

    毒害艾美耳球蟲是一種危害養(yǎng)雞業(yè)的重要胞內(nèi)寄生蟲,在研究球蟲分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)和抗藥性研究中,體外細(xì)胞培養(yǎng)顯然起到至關(guān)重要的作用。在體外培養(yǎng)過程中,對球蟲的生長的影響較大的因素包括細(xì)胞系的選擇、環(huán)境溫度以及培養(yǎng)基。本試驗(yàn)通過對比不同細(xì)胞系的子孢子入侵時(shí)間

    2 方法

    2.1 子孢子純化

    2.1.1 卵囊破壁

    卵囊計(jì)數(shù)后,3000 r/min,離心10 min棄上清,將沉淀加到組織研磨器中并在冰水中研磨。不斷在顯微鏡下觀察,直至90%左右的球蟲卵囊破壁即可,3000 r/min,離心10 min棄去上清。

    2.1.2子孢子脫囊

    將含有孢子囊的溶液分別加入到A,B,C,D 4種不同配方的脫囊液中,40 ℃水浴,邊消化邊鏡檢,在顯微鏡下,不斷觀察脫囊情況,30 min后停止消化。

    2.1.3子孢子的純化

    配制 20%,30%,65%,70%,75%,80%的蔗糖溶液。先將65%,70%,75%,80%的蔗糖分別加到不同離心管中,再用滴管分別將20%,30%蔗糖溶液依次加到離心管中,并做好標(biāo)記。并將含有子孢子的脫囊液滴入,1 500 r/min,離心10 min,吸取2種濃度溶液間的白色條帶。加入PBS液3 000 r/min離心15 min洗滌蔗糖溶液,計(jì)算回收率(純化后子孢子數(shù)/脫囊后計(jì)數(shù))。

    2.1.4子孢子活性檢測

    用不同的脫囊液脫囊的子孢子經(jīng)過同樣的方法純化后,將純化好的子孢子用PBS定容到2 mL,吸取一滴子孢子液滴在載玻片上再加入兩滴伊紅Y染液。2 min后在顯微鏡下觀察。計(jì)算子孢子的存活率(染色后未見伊紅顏色子孢子數(shù)/總子孢子數(shù))。

    2.2 雞胚成纖維細(xì)胞的制備

    A 取9~11日齡雞胚,取出胚體置于滅菌平皿中,去掉內(nèi)臟、頭、四肢,PBS洗2次。

    B 將胚體轉(zhuǎn)移至小燒杯中,充分剪碎,PBS洗2次,吸棄PBS。

    C 加入2mL0.25%胰蛋白酶,37℃消化15min左右。

    D 輕輕吸棄胰酶,PBS洗2次,吸棄PBS。

    E 加少量生長液輕輕吹打,將上清細(xì)胞篩過濾;再用生長液將剩余組織塊吹開,過濾。

    F 過濾后的細(xì)胞懸液稀釋10倍,進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為40~60萬/mL。

    G 加入50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

    H 37℃培養(yǎng),24~28h形成致密單層。

    2.3 雞腎原代細(xì)胞培養(yǎng)

    A 取9~11日齡雞,無菌環(huán)境中取腎。

    B 將腎轉(zhuǎn)移至小燒杯中,充分剪碎,PBS洗2次,吸棄PBS。

    C 加入5倍體積0.25%胰蛋白酶,37℃消化30min左右。

    D 輕輕吸棄胰酶,PBS洗2次,吸棄PBS。

    E 加少量生長液輕輕吹打,將上清細(xì)胞篩過濾;再用生長液將剩余組織塊吹開,過濾。

    F 過濾后的細(xì)胞懸液稀釋10倍,進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為40~60萬/mL。

    G 加入50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

    H 37℃培養(yǎng),24~28h形成致密單層。

    2.4 傳代細(xì)胞系細(xì)胞代培養(yǎng)

    2.4.1凍存細(xì)胞復(fù)蘇:液氮中凍存的MDBK細(xì)胞在37℃水浴中迅速溶解(1min之內(nèi))。加入細(xì)胞瓶中,再加入含有血清、雙抗的培養(yǎng)基,37℃,5%CO2培養(yǎng)12h后,倒掉培養(yǎng)基,換入新的含有雙抗、血清的培養(yǎng)基。

    2.4.2細(xì)胞傳代:待細(xì)胞瓶底的細(xì)胞鋪滿80%后,將培養(yǎng)基倒掉,用D-Hanks清洗3次,加入少量胰酶,37℃,5%CO2消化3min,待細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)為圓形后,加入培養(yǎng)基小心吹打均勻,再放入37℃,5%CO2中培養(yǎng)。

    2.5 入侵時(shí)間比對試驗(yàn)

    A 用胰酶37℃,5%CO2消化3min消化下所需細(xì)胞,進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為50萬/mL。

    B將泡過酸,洗凈高壓好的蓋玻片加入6孔板中,每孔加入細(xì)胞懸液2mL,分別在37℃,5%CO2和41℃,5%CO2培養(yǎng)2h。

    C將純化好的子孢子計(jì)數(shù),每孔接入10萬卵囊。

    D分別在37℃,5%CO2和41℃,5%CO2培養(yǎng)每隔0.5h進(jìn)行HE染色觀察入侵時(shí)間。

    2.6 入侵率比對試驗(yàn)

    A 用胰酶37℃,5%CO2消化3min消化下所需細(xì)胞,進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為50萬/mL。

    B將泡過酸,洗凈高壓好的蓋玻片加入6孔板中,每孔加入細(xì)胞懸液2mL,分別在37℃,5%CO2和41℃,5%CO2培養(yǎng)2h。

    C將純化好的子孢子計(jì)數(shù),每孔接入10萬卵囊。

    D分別在37℃,5%CO2和41℃,5%CO2培養(yǎng)24h進(jìn)行HE染色觀察入侵率。

    2.7 HE染色

    A 用胰酶37℃,5%CO2消化3min消化下所需細(xì)胞,進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為50萬/mL。

    B將泡過酸,洗凈高壓好的蓋玻片加入6孔板中,每孔加入細(xì)胞懸液2mL,分別在37℃,5%CO2和41℃,5%CO2培養(yǎng)2h。

    C將純化好的子孢子計(jì)數(shù),每孔接入10萬卵囊。

    D分別在37℃,5%CO2和41℃,5%CO2培養(yǎng)培養(yǎng)每隔0.5h進(jìn)行HE染色觀察入侵時(shí)間。

    2.8 培養(yǎng)基成分對比試驗(yàn)

    A將VERO細(xì)胞在兩塊6孔板中培養(yǎng)至融合。

    B將純化好的子孢子計(jì)數(shù),每孔接入10萬卵囊。

    C六個(gè)孔中加入不同的培養(yǎng)基,并將每塊板的PH值分別調(diào)整為7和7.6

    D如上圖所示,分別在不同培養(yǎng)中培養(yǎng)每隔0.5h進(jìn)行HE染色觀察入侵情況。

    3 結(jié)果

    3.1 不同細(xì)胞系入侵時(shí)間

    從結(jié)果可以看出,細(xì)胞系在入侵時(shí)間上對子孢子的影響沒有顯著性差異,但是明顯溫度可以影響子孢子的入侵時(shí)間。在41℃下,子孢子能夠更快的入侵細(xì)胞。

    3.2 不同細(xì)胞系不同溫度入侵率

    從試驗(yàn)結(jié)果可以看出在37℃時(shí),VERO細(xì)胞的入侵率是最高的,其次就是PK-15細(xì)胞,其他3種細(xì)胞差異不是很顯著。(見表2-4)

    從試驗(yàn)結(jié)果可以看出在41℃時(shí),PK15和VERO的入侵率最高,雞胚成纖維細(xì)胞和PK細(xì)胞入侵率較高,雞腎細(xì)胞的入侵率最低。(見表2-5)

    從圖中可以看到除PK,MDBK細(xì)胞外其他3種細(xì)胞在41℃時(shí)的入侵率較高,但總體比較VERO細(xì)胞的入侵率無論是在41℃還是在37℃下培養(yǎng)入侵率都是較高的。(見圖2-2)

    3.3 培養(yǎng)基中添加不同成分的入侵率

    4 討論

    柔嫩艾美爾球蟲體外培養(yǎng)技術(shù)中, MDBK是較為良好的上皮細(xì)胞系[1],但卻是布氏艾美爾球蟲在MDBK細(xì)胞中發(fā)育不是十分良好[2],而且小隱孢子蟲在MDBK中無法發(fā)育。BHK被廣泛用于培養(yǎng)艾美爾,并且認(rèn)為是優(yōu)于雞腎細(xì)胞和火雞腎細(xì)胞。Tierney 認(rèn)為BHK,MDBK,RK-13明顯適合球蟲生長,較適宜用來體外培養(yǎng)柔嫩艾美爾球蟲。有證據(jù)表明MDBK和Hep2細(xì)胞較適合體外培養(yǎng)弓形蟲,VERO,BHK,RK13,RDA,CER對于弓形蟲的體外培養(yǎng)不是很好。HCT-8細(xì)胞被認(rèn)為是最適合體外培養(yǎng)小隱孢子蟲,但有人比對小隱孢子蟲入侵MDCK, MA-104, Hep-2 和Vero后MDCK最易于感染,在MA-104細(xì)胞中小隱孢子蟲無法進(jìn)行有性生殖,VERO細(xì)胞入侵最少而且無法形成滋養(yǎng)體。也有研究認(rèn)為VELI細(xì)胞在體外培養(yǎng)小隱孢子蟲得到的卵囊在感染小鼠時(shí)的感染力更強(qiáng),更適于體外培養(yǎng)小隱孢子蟲。弓形蟲在Hela細(xì)胞中培養(yǎng)可以產(chǎn)生大量的速殖子。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出雖然子孢子在入侵時(shí)間上VERO時(shí)間都較短,但差異并不是十分顯著,可見在毒害艾美爾球蟲體外培養(yǎng)中細(xì)胞系的影響不是很大。

    溫度對球蟲的生長也有很大影響以LMH,BHK ,MDBK,HCT-8,VERO,CRFK, PK-15,RK-13,IEC-6 為載體時(shí),41℃比較適宜球蟲生長,而以Caco-2和MDCK為載體時(shí)37℃時(shí)比較適宜球蟲生長。因?yàn)榍蛳x的自然宿主的體溫是41℃。有研究證明在室溫和37℃時(shí)體外培養(yǎng)弓形蟲明顯影響弓形蟲的感染率,而且有研究認(rèn)為29℃體外培養(yǎng)弓形蟲能夠產(chǎn)生更多的速殖子。但是在體外培養(yǎng)肉孢子蟲時(shí)溫度對于體外培養(yǎng)的影響并不是很大,起到主要作用的是細(xì)胞的種類。然而目前沒有對毒害艾美耳球蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞系的相關(guān)報(bào)道。從本實(shí)驗(yàn)的研究成果可見,毒害艾美爾球蟲在37℃時(shí)的入侵時(shí)間明顯比41℃時(shí)間要長,這可能是由于雞的體溫為41℃,雖然37℃更適宜細(xì)胞生長,但如果需要進(jìn)行毒害艾美爾球蟲體外培養(yǎng)試驗(yàn)建議在子孢子入侵和后續(xù)培養(yǎng)過程中進(jìn)行溫度調(diào)節(jié),更加接近自然狀態(tài)。

    培養(yǎng)基也是影響球蟲生長的一個(gè)重要因素。有研究證明添加有5%水解乳蛋白的MEM細(xì)胞維持培養(yǎng)液被認(rèn)為是適宜柔嫩艾美耳球蟲在體外培養(yǎng)細(xì)胞上發(fā)育的培養(yǎng)系統(tǒng)。在THP-1體外培養(yǎng)小隱孢子蟲時(shí)在培養(yǎng)基中加入腺苷或是肌苷培養(yǎng)72h可以提高卵囊的產(chǎn)出,在MDBK細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入肌苷培養(yǎng)24h也有同樣效果。用有報(bào)道認(rèn)為培養(yǎng)基中加入葉酸可以提高球蟲的表達(dá)量。而且pH值也可以影響球蟲的產(chǎn)量,一般認(rèn)為pH7.4最適宜球蟲生長。血清的含量明顯影響了弓形細(xì)胞培養(yǎng)過程中的增殖率。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出在培養(yǎng)基中添加肌苷可以提高子孢子的入侵率,且與其他各種添加成分比效果顯著。

    綜上所述,筆者認(rèn)為在體外培養(yǎng)毒害艾美爾球蟲過程中,采用VERO細(xì)胞在41℃環(huán)境中,培養(yǎng)基中添加葉酸對下一步的試驗(yàn)更為有利。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Schmatz D M, Crane M S, Murray PK Eimeria tenella: parasites-spectific incorporation of 3H-uracil as a quantitative measure of intracellular development .[J] Protozool 33:109-104.

    [2] Girouard, D,Gallant, J,Akiyoshi, D. Eet Failure to propagate Cryptosporidium spp. in cell-free culture [J] J Parasitol 2006,92(2):399-400.

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