CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體的工藝研究

張婷

（長春圣金諾生物制藥有限公司，吉林長春 130000）

隨著科技的發(fā)展和社會的進步，生物醫(yī)藥行業(yè)也得到了快速發(fā)展，單克隆抗體產(chǎn)業(yè)作為醫(yī)藥領(lǐng)域的重要組成部分，其中CHO細胞（中華倉鼠卵巢細胞Chinese hamster ovary cell）培養(yǎng)表達單克隆抗體的生產(chǎn)是目前醫(yī)藥領(lǐng)域研究的重點和熱點。單克隆抗體的CHO細胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝基本要求：首先，要能通過CHO細胞培養(yǎng)表達出合格的單克隆抗體；其次，CHO細胞培養(yǎng)工藝要能穩(wěn)定表達出合格的單克隆抗體；最后，CHO細胞培養(yǎng)工藝要實現(xiàn)高效率和高經(jīng)濟效益的生產(chǎn)單克隆抗體。CHO細胞培養(yǎng)表達單克隆抗體的基本工藝流程：第一步，在培養(yǎng)基、適宜培養(yǎng)參數(shù)的條件下培養(yǎng)CHO細胞；第二步，CHO細胞培養(yǎng)結(jié)束將收獲液進行純化工序處理來得到原液；第三步，將得到的原液經(jīng)過各指標的測定（如抗體蛋白結(jié)構(gòu)、宿主蛋白含量及糖型分布等）來確定其制得的抗體產(chǎn)品的安全性和有效性。其中，CHO細胞培養(yǎng)收獲液中的雜質(zhì)直接影響著收獲液的純化工序的復(fù)雜和難易，同時對收獲液制得原液的效率也有大的影響。目前來說，對于不同糖型的單克隆抗體在純化工序中是很難分離的，如果想使收獲液的純化工序簡單，那么必須從CHO細胞培養(yǎng)過程對雜質(zhì)的含量加以把控，從而使得收獲液的雜質(zhì)含量低、純化工序簡便，進而使得制得的原液指標符合抗體產(chǎn)品的安全性。在CHO細胞培養(yǎng)特別是大規(guī)模培養(yǎng)表達過程中，要對CHO細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)參數(shù)和培養(yǎng)工藝流程進行研究和把控，以實現(xiàn)單克隆抗體表達量和抗體生成效率的提高，并同時實現(xiàn)抗體生產(chǎn)的穩(wěn)定性和生成抗體的安全性[1]。

1 CHO細胞培養(yǎng)工藝中的培養(yǎng)基

1.1 培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)中的功能與作用

在細胞培養(yǎng)表達工藝過程中，培養(yǎng)基是細胞繁殖和產(chǎn)物表達的物質(zhì)基礎(chǔ)，由于細胞在培養(yǎng)過程中要消耗物質(zhì)和能量來進行自身的生長繁殖和代謝產(chǎn)物的生成，而培養(yǎng)基在其中發(fā)揮著提供物質(zhì)和營養(yǎng)的作用，是細胞培養(yǎng)表達的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。與此同時，在細胞培養(yǎng)時培養(yǎng)基的選擇要充分考慮到培養(yǎng)細胞的特性及表達產(chǎn)品的要求，以實現(xiàn)細胞培養(yǎng)的有效性和表達產(chǎn)品生產(chǎn)效率的提高。此外，隨著社會科技的發(fā)展和環(huán)保安全理念的不斷深入，細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基也趨向于化學成分確定、無蛋白無動物來源等以提高細胞培養(yǎng)表達的穩(wěn)定性和安全性。

1.2 CHO細胞培養(yǎng)基的種類與應(yīng)用

根據(jù)在細胞培養(yǎng)過程中加入時間和目的的不同，培養(yǎng)基通常情況下分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基主要是細胞培養(yǎng)的初期用于細胞的繁殖和生長階段，而補料培養(yǎng)基可以用于細胞繁殖的早期和代謝產(chǎn)物的表達階段。在細胞培養(yǎng)表達過程中，要根據(jù)細胞不同階段的物質(zhì)營養(yǎng)需求和代謝表達來選擇適用的培養(yǎng)基種類。近年來，CHO細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基已開發(fā)多種，有商品類和定制類可以滿足CHO細胞培養(yǎng)的物質(zhì)營養(yǎng)和代謝表達需求[2]。相比于商品類的CHO細胞培養(yǎng)基，定制類培養(yǎng)基可以根據(jù)具體CHO細胞株的特性進行針對性的配制和優(yōu)化，以實現(xiàn)CHO細胞培養(yǎng)表達產(chǎn)品產(chǎn)率和質(zhì)量的提高，同時還有利于對培養(yǎng)基進行優(yōu)化處理。

1.3 CHO細胞培養(yǎng)基的優(yōu)化

在CHO細胞培養(yǎng)表達工藝過程中，對培養(yǎng)基的優(yōu)化是提高表達抗體產(chǎn)品產(chǎn)率和質(zhì)量的重要工藝手段之一。在CHO細胞培養(yǎng)基的優(yōu)化中，主要的優(yōu)化方式有3種。（1）選用多種商品類培養(yǎng)基進行組合混料實驗，根據(jù)CHO細胞培養(yǎng)的情況來選出較好的組合混料培養(yǎng)基。（2）選用固定的培養(yǎng)基并向其中添加微量元素、氨基酸、生物因子及維生素等物質(zhì)，通過培養(yǎng)實驗結(jié)果得出對CHO細胞培養(yǎng)影響最大的物質(zhì)，然后再有針對性地進行培養(yǎng)基的優(yōu)化處理。（3）根據(jù)CHO細胞的情況來分析CHO細胞生長繁殖過程中和代謝表達過程中所需的營養(yǎng)物質(zhì)和限制因子，然后進行針對性的添加或去除，從而達到優(yōu)化培養(yǎng)基的目的[3]。此外，對于CHO細胞的優(yōu)化，先進行小規(guī)模實驗的優(yōu)化，然后進行培養(yǎng)工藝的放大對優(yōu)化的培養(yǎng)基進行驗證，以確定最終的CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體的培養(yǎng)基。

2 CHO細胞培養(yǎng)參數(shù)分析

在CHO細胞培養(yǎng)表達工藝過程中，對培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)環(huán)境的酸堿度及環(huán)境的溶氧情況等參數(shù)都有一定的要求。通過對培養(yǎng)參數(shù)的研究來確定CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體工藝的最佳培養(yǎng)參數(shù)。目前，在CHO細胞培養(yǎng)中變溫培養(yǎng)應(yīng)用最為廣泛，在CHO細胞的生長繁殖階段和代謝產(chǎn)物表達階段的溫度控制在不同的范圍內(nèi)，在繁殖的后期階段將溫度降低以延緩CHO細胞的死亡來提高代謝產(chǎn)物的表達量。與此同時，在CHO細胞培養(yǎng)過程中對于培養(yǎng)環(huán)境酸堿度的把控也影響著CHO細胞的生長繁殖和代謝的產(chǎn)物表達，對于培養(yǎng)環(huán)境中的溶氧情況也是影響CHO細胞培養(yǎng)效率的重要指標參數(shù)[4]?，F(xiàn)階段，CHO細胞培養(yǎng)多采用攪拌式的反應(yīng)器，在攪拌的過程中實現(xiàn)細胞生長代謝對氧氣的需求，同時有效去除多余的二氧化碳（CO2）以實現(xiàn)細胞培養(yǎng)的有效進行，然而過大的攪拌速率將會對細胞的培養(yǎng)和表達產(chǎn)物的質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響。因此，在CHO細胞培養(yǎng)工藝過程中，攪拌槳的速度要依據(jù)CHO細胞的耐受值而進行合理的限定，同時渦旋的尺寸要大于細胞的最大直徑來避免細胞受到剪切傷害。因此，CHO細胞培養(yǎng)參數(shù)及細胞培養(yǎng)工藝設(shè)備的選擇都對CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體產(chǎn)生較大的影響。

3 CHO細胞放大工藝研究

在CHO細胞培養(yǎng)過程中，除了優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)參數(shù)，培養(yǎng)工藝的放大是CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于對細胞培養(yǎng)表達產(chǎn)品生產(chǎn)的成本和穩(wěn)定性的考究，通常CHO細胞培養(yǎng)要先在實驗室規(guī)模進行工藝試驗，然后到試驗中試階段，最后至生產(chǎn)線大規(guī)模生產(chǎn)，即CHO細胞培養(yǎng)工藝放大的研究是非常必要的。（1）在CHO細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)參數(shù)優(yōu)化中，也要將優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)參數(shù)進行培養(yǎng)工藝的放大來驗證和調(diào)整，以實現(xiàn)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)參數(shù)的可實用性和高效性。（2）在CHO細胞培養(yǎng)工藝的放大過程中，可以更直觀、更清晰地分析出各個工藝環(huán)節(jié)和指標參數(shù)對整個抗體產(chǎn)品生產(chǎn)效率的影響，從而實現(xiàn)CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體工藝生產(chǎn)的穩(wěn)定性[5]。在CHO細胞培養(yǎng)工藝放大的過程中，通常培養(yǎng)溫度、環(huán)境酸堿度等變化不大，而攪拌速度、通氣速率等因素受到試驗規(guī)模大小的影響較大，要根據(jù)具體情況遵循一定的變化規(guī)則，來選擇相應(yīng)的培養(yǎng)設(shè)備指標參數(shù)，如渦旋設(shè)備的尺寸等等要做相應(yīng)的調(diào)整，從而實現(xiàn)CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體工藝的穩(wěn)定性和生產(chǎn)效率的提高。

4 結(jié)語

隨著醫(yī)藥行業(yè)的不斷發(fā)展，生物醫(yī)藥已經(jīng)備受關(guān)注，單克隆抗體產(chǎn)業(yè)作為生物醫(yī)藥中的重要板塊，其CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體的工藝研究也越來越多。通過對其CHO細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)參數(shù)分析及工藝的放大等研究分析來實現(xiàn)CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，進而推動單克隆抗體產(chǎn)業(yè)在醫(yī)藥領(lǐng)域的不斷向前發(fā)展。