水稻組織培養(yǎng)相關(guān)研究綜述

尹祥佳 趙慧軍 李艷玫 郝楠

摘要：水稻是我國(guó)的主要糧食作物，有粳稻和秈稻兩個(gè)栽培亞種，對(duì)我國(guó)糧食生產(chǎn)和安全起著重要的作用。同時(shí)，水稻作為模式植物，在組織培養(yǎng)研究中取得了顯著的成果，也為開展水稻分子育種研究奠定了基礎(chǔ)。主要從選用外植體誘導(dǎo)愈傷組織、基本培養(yǎng)基成分、激素配比等方面綜述了粳稻和秈稻組織培養(yǎng)相關(guān)研究及存在的問題，并提出了一些建議。

關(guān)鍵詞：水稻；組織培養(yǎng)；影響因素；存在問題

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1463（2017）08-0073-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.06.019

Relevant Research Review on Rice Tissue Culture

YIN Xiangjia， ZHAO Huijun， LI Yanmei， HAO Nan

（Lanzhou Vocational and Technical College，Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：Rice is the main food crops in China， there are two cultivation of japonica and indica rice subspecies， play an important role on Chinas grain production and security. At the same time， as a model plant，rice tissue culture research has obtained the remarkable results， also has laid the foundation for developing rice molecular breeding research. The article mainly from the callus induction explant selection， basic culture medium， the respect such as hormone proportion respectively the influence factors of japonica and indica rice tissue culture were reviewed and the existing problems， and puts forward some Suggestions.

Key words：Rice；Tissue culture；Influencing factors；Existing question

水稻是我國(guó)乃至世界的三大糧食作物之一。2016年，我國(guó)水稻播種面積為3016萬hm2，播種面積僅次于玉米，占我國(guó)糧食作物播種面積的26.69%；產(chǎn)量居世界第一，約占世界水稻總產(chǎn)量的30%，占國(guó)內(nèi)糧食總產(chǎn)量的33.58%[1 - 2 ]。粳稻和秈稻是亞洲栽培稻的兩個(gè)亞種，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整，水稻生產(chǎn)逐漸向主產(chǎn)區(qū)集中，其中粳稻主要集中在東三省和蘇皖，2015年黑龍江和江蘇兩省的面積和產(chǎn)量占全國(guó)粳稻的60%以上；中晚秈稻主要集中在湖南、四川、湖北和江西，2015年4省中晚秈稻產(chǎn)量占全國(guó)的55%以上；早秈稻主要集中在湖南、江西、廣東與廣西，2016年4省區(qū)早秈稻種植面積占全國(guó)的81.2%，產(chǎn)量占全國(guó)的81.9%[3 ]。由此可見，水稻對(duì)我國(guó)糧食生產(chǎn)和安全起著重要的作用。

植物組織培養(yǎng)是指在人工無菌操作下，利用優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)離體植物器官組織細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其在不同培養(yǎng)基上再生細(xì)胞或長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)[4 ]。1965年，Nishi等[5 ]選用水稻根的愈傷組織分化出水稻再生植株，此后又有很多國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了水稻組織培養(yǎng)研究。目前，水稻作為植物組織培養(yǎng)研究的模式植物，已在建立組織培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上開展了大量遺傳轉(zhuǎn)化研究，創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，為提升我國(guó)水稻分子育種和常規(guī)育種研究水平起著重要的作用，并取得了顯著成果[6 - 7 ]。我們從選用外植體誘導(dǎo)愈傷組織、基本培養(yǎng)基成分、激素配比等方面對(duì)粳稻和秈稻組織培養(yǎng)相關(guān)研究及存在的問題進(jìn)行如下綜述，以便給相關(guān)研究者提供參考。

1 粳稻組織培養(yǎng)

1.1 外植體

獲得理想的外植體是建立粳稻組織培養(yǎng)體系的前提。在前人研究中，多選用盾片、胚芽鞘、花藥、幼胚和幼穗等外植體來誘導(dǎo)愈傷組織[8 - 10 ]。但上述外植體的取材多受季節(jié)和環(huán)境因素的限制，不能滿足高通量組織培養(yǎng)試驗(yàn)的要求。鄭文靜 等[11 ]選用8個(gè)粳稻品種，以成熟胚、幼胚 、幼穗及花藥為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，結(jié)果表明，以成熟胚作為外植體時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高。由于成熟胚具有來源不受生長(zhǎng)季節(jié)和環(huán)境的影響、取材比較方便、外植體滅菌容易、接種操作方便，試驗(yàn)重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的研究人員最終選用粳稻成熟種子作為外植體材料，誘導(dǎo)高質(zhì)量的愈傷組織[12 - 13 ]。

1.2 基本培養(yǎng)基

粳稻組織培養(yǎng)用到的基本培養(yǎng)基有誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基的選擇是粳稻組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵因素。近年來，各種優(yōu)化的粳稻組織培養(yǎng)基配方不斷涌現(xiàn)，培養(yǎng)方法也不斷改進(jìn)，使得粳稻的愈傷組織誘導(dǎo)和組織培養(yǎng)再生能力得到顯著提高[14 ]。 Lee 等[15 ]選用3個(gè)粳稻品種分別在LS、MS、N6基本培養(yǎng)基上添加相同量的2，4-D，研究對(duì)粳稻胚性愈傷誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果表明N6基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，而分化和生根培養(yǎng)基都選用了MS培養(yǎng)基。黃賽麟等[16 ]用N6培養(yǎng)基和在N6的基礎(chǔ)上添加了脯氨酸和水解酪蛋白的改良培養(yǎng)基誘導(dǎo)粳稻愈傷組織，得出改良的N6培養(yǎng)基在誘導(dǎo)效率上差異極其顯著，甚至對(duì)于有些品種已經(jīng)達(dá)到了100%的誘導(dǎo)效率，而且所生長(zhǎng)出的愈傷組織質(zhì)地較硬，呈淡黃色的顆粒狀，而分化和生根都選用MS培養(yǎng)基。施利利等[17 ]選用5個(gè)粳稻品種，在N6、NB、MS基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷，表明NB和N6培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)量要好于MS培養(yǎng)基上的。王敬東等[18 ]以N6D、NB、B5、MS為基本培養(yǎng)基，添加相同量的2，4-D、脯氨酸、水解酪蛋白，研究愈傷組織誘導(dǎo)，結(jié)果在N6D培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率最高，達(dá)到100%；MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率最低，僅為57%。因此，在粳稻的愈傷組織誘導(dǎo)過程中選用N6和NB作為誘導(dǎo)和繼代的基本培養(yǎng)基，且不同基因型品種對(duì)培養(yǎng)基具有選擇性。為了提高誘導(dǎo)愈傷組織的質(zhì)量，還要加入一定量的2，4-D、脯氨酸和水解酪蛋白。在分化和生根培養(yǎng)中通常選用MS作為基本培養(yǎng)基，尤其是在分化培養(yǎng)基中還要加入一定量的2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、6-BA（6-芐氨基嘌呤、細(xì)胞分裂素）、KT（6-糖基氨基嘌呤，激動(dòng)素）、IAA（吲哚乙酸，生長(zhǎng)素）、NAA（萘乙酸，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑），以提高粳稻的分化率和再生率。

1.3 分化激素配比

植物激素對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，植物激素通過調(diào)控細(xì)胞或組織的基因表達(dá)，從而調(diào)控一系列代謝過程，進(jìn)而影響植物細(xì)胞胚性潛力維持和表達(dá)[19 ]。早在1957年，Skoog和Miller在植物組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素調(diào)控形態(tài)發(fā)生和植株發(fā)育的現(xiàn)象，并提出了“激素平衡”假說，之后眾多學(xué)者對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)與形態(tài)發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行了大量研究[20 ]。在粳稻愈傷組織分化過程中，需要在分化培養(yǎng)基上添加不同的激素配比，以實(shí)現(xiàn)粳稻的再生。張秀香[21 ]以MS為分化培養(yǎng)基，添加了0.02 mg/L IAA+0.5 mg/L NAA+2 mg/L KT，結(jié)果3個(gè)供試粳稻品種的分化率為90.2%～97.2%。閻麗娜等[22 ]以添加了1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D和1 g/L活性炭的MS作為分化培養(yǎng)基，取得了較高的分化率。在粳稻粳稻組織培養(yǎng)分化過程中添加激素是愈傷組織能否分化成綠苗的關(guān)鍵，但不同基因型品種的愈傷組織在分化時(shí)，添加激素的水平及配比也有所不同[23 ]。因此在不同粳稻品種組織培養(yǎng)研究過程中要根據(jù)具體情況設(shè)置激素的梯度試驗(yàn)，以優(yōu)化分化效率。

1.4 存在的問題及建議

在粳稻組織培養(yǎng)過程中要有效解決好試驗(yàn)研究與生產(chǎn)實(shí)際的關(guān)系，品種基因型差異與培養(yǎng)基配方、激素配比的關(guān)系，少量的研究試驗(yàn)與規(guī)?；M織培養(yǎng)的關(guān)系。要帶著粳稻育種和生產(chǎn)實(shí)際中的問題來研究粳稻生產(chǎn)型品種的組織培養(yǎng)體系，為粳稻育種服務(wù)。

1.4.1 需要調(diào)整粳稻組織培養(yǎng)的品種 目前，粳稻組織培養(yǎng)研究所涉及的品種比較少，且又多是從實(shí)驗(yàn)室操作的角度出發(fā)選取品種，真正針對(duì)在生產(chǎn)實(shí)際或者主推水稻品種的研究尚不多見。粳稻的組織培養(yǎng)研究要切合生產(chǎn)實(shí)際，這樣可能會(huì)更加適應(yīng)以組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的粳稻分子改良，提高外源基因?qū)胨镜霓D(zhuǎn)化效率，篩選有價(jià)值的育種材料，豐富水稻的基因型，培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗水稻新品種的育種要求。

1.4.2 培養(yǎng)基配方研制周期長(zhǎng) 因粳稻成熟胚組織培養(yǎng)時(shí)不同品種對(duì)激素的敏感性差異較大，需要在已有研究的成果上優(yōu)化品種特異性的獨(dú)特培養(yǎng)基配方，研制的試驗(yàn)周期很長(zhǎng)。因此，有必要在有關(guān)科研院所或者企業(yè)的牽頭下整合粳稻組織培養(yǎng)研究信息，建立數(shù)據(jù)庫，實(shí)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)信息的共享。

1.4.3 規(guī)?；M織培養(yǎng)體系有待建立 粳稻組織培養(yǎng)是為后續(xù)的粳稻分子育種、基因功能驗(yàn)證、基因編輯技術(shù)研究以及常規(guī)育種服務(wù)的。因此，建立規(guī)?；慕M織培養(yǎng)技術(shù)體系是有效實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的途徑，要在粳稻組織培養(yǎng)試驗(yàn)中樹立規(guī)?；芯康睦砟睢?/p>

2 秈稻組織培養(yǎng)

大多數(shù)粳稻品種愈傷組織容易誘導(dǎo)，增殖速度快，繼代培養(yǎng)能力強(qiáng)，再生率高。而栽培面積廣的大多數(shù)秈稻品種具有不良的組培特性，表現(xiàn)為愈傷組織誘導(dǎo)率和再生率低，后續(xù)繼代培養(yǎng)中容易褐化，高效、適用性廣泛的秈稻組織培養(yǎng)體系尚未建立，極大地阻礙了秈稻分子育種研究[24 ]。秈稻品種9311不僅在生產(chǎn)上有重要意義，在水稻功能基因組學(xué)研究中也是一個(gè)重要的模式品種[25 ]。

2.1 外植體

秈稻組織培養(yǎng)研究中，可選擇的外植體有成熟種子、幼胚、幼穗、花藥 [26 - 29 ]。為了方便秈稻組織培養(yǎng)的研究，取材不受季節(jié)和環(huán)境的限制，常選用成熟的種子作為外植體。

2.2 基本培養(yǎng)基

選用和優(yōu)化秈稻的基本培養(yǎng)基要解決秈稻品種基因型的差異，及其誘導(dǎo)、繼代和分化過程中的愈傷質(zhì)量和褐化問題。閻麗娜等[30 ]以9個(gè)秈稻成熟胚為研究對(duì)象，以M8為基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，MS為分化培養(yǎng)基研究了秈稻的組織培養(yǎng)。周杰等[31 ]選用N6、NB、MS和CC作為基本培養(yǎng)基開展了秈稻YTB成熟胚的誘導(dǎo)、繼代、分化研究，得出NB基本培養(yǎng)基是較適合秈稻YTB成熟胚組織培養(yǎng)再生。劉元風(fēng)等[32 ]建立了適合5個(gè)秈稻品種成熟胚的高效植株再生體系，認(rèn)為N6基本培養(yǎng)基有利于秈稻愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，N6中的大量元素和MS中的微量元素有利于愈傷組織的分化。秈稻組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基種類比較多，這和秈稻的基因型差異有關(guān)。

2.3 激素配比

秈稻組織培養(yǎng)中各類激素的生理作用雖有相對(duì)專一性，但是誘導(dǎo)脫分化和再分化過程不是某類激素單獨(dú)作用的結(jié)果，而需要一定的激素配 比[33 ]。研究發(fā)現(xiàn)，在添加2 mg/L 2，4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織比較松軟，一般不易分化，但在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基上添加NAA和KT后，可以改進(jìn)愈傷組織的質(zhì)量，愈傷組織比較致密、較硬、顆粒狀結(jié)構(gòu)、易于分化，能夠提高秈稻的再生頻率[34 ]。王子斌[35 ]等以培矮64S和鹽恢559成熟胚為外植體，研究發(fā)現(xiàn)在秈稻中存在著廣泛的基因型影響，不同秈稻品種誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的2，4-D最佳濃度不同。繼代中適當(dāng)提高2，4-D的濃度，既可得到較多顏色鮮艷的愈傷組織又可保證得到較多高分化能力的愈傷組織，分化培養(yǎng)基成分為改良MS培養(yǎng)基加2.5 mg/L KT、0.1 mg/L NAA。周永國(guó)等[36 ]以9311成熟胚為外植體，設(shè)計(jì)了5類誘導(dǎo)培養(yǎng)基，結(jié)果表明，9311在添加2，4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上都能誘導(dǎo)出愈傷組織。采用MSDAP培養(yǎng)基培養(yǎng)，9311成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)87.5%。分化采用MS基本培養(yǎng)基，并添加3 mg/L 6-BA、1.5 mg/L NAA，分化率為46.7%。由此可見，在秈稻組織培養(yǎng)中要把激素配比與基本培養(yǎng)基、材料基因型的差異給予針對(duì)性的優(yōu)化，得出最佳的激素配比。

2.4 存在的問題及建議

2.4.1 褐化問題 很多秈稻品種在組織培養(yǎng)過程中存在愈傷組織褐化而使分化率和再生率降低的問題，因此，褐化問題一直是秈稻組織培養(yǎng)研究的重點(diǎn)。已有研究者針對(duì)秈稻9311組織培養(yǎng)中的褐化問題開展了相關(guān)研究。郝建琴等[37 ]研究表明，9311在愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和分化3個(gè)階段分別添加山梨醇10、20和40 g/L，分化率可以達(dá)到86.1%；分化階段添加5.5 g/L蔗糖和40 g/L山梨醇，愈傷組織分化率高達(dá)82.7%～95.2%?？梢娚嚼娲寄軌蚴褂鷤M織保持良好的狀態(tài)、 抑制秈稻愈傷組織褐化并提高分化率。

2.4.2 愈傷繼代周期短 已有研究表明[38 ]，誘導(dǎo)2周的9311愈傷顏色為淡黃色略發(fā)白，呈球形，致密且堅(jiān)硬，誘導(dǎo)17 d的9311愈傷植株再生能力最高。由此得知，9311愈傷的誘導(dǎo)和植株再生過程均受到培養(yǎng)基組成成分的影響，而愈傷繼代培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短又對(duì)愈傷的生理狀態(tài)產(chǎn)生影響，這些都嚴(yán)重制約著秈稻愈傷植株的再生能力。因此，在秈稻組織培養(yǎng)再生過程中要減少繼代次數(shù)，隨時(shí)觀察愈傷的生長(zhǎng)狀態(tài)，及時(shí)分化再生。

3 小結(jié)

目前水稻組織培養(yǎng)常選用的外植體有花藥、幼穗、幼胚、成熟胚等，其中成熟胚取材方便，不受季節(jié)限制、操作簡(jiǎn)單，獲得的愈傷組織質(zhì)量較高，在水稻組織培養(yǎng)研究中有著較為廣闊的應(yīng)用前景。水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和再生是組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，影響水稻胚性愈傷組織形成和植株再生能力的因素包括基因型、外植體、基本培養(yǎng)基、激素配比以及培養(yǎng)的環(huán)境和繼代時(shí)間等多個(gè)方面，其中水稻的基因型和激素配比是最重要的影響因素。

水稻品種的組織培養(yǎng)要結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，研究主推水稻品種的組織培養(yǎng)再生體系，為后續(xù)的分子育種奠定基礎(chǔ)，獲得更多的分子育種改良材料。秈稻的褐化問題還需要投入更多的研究，秈稻的再生能力研究相比較粳稻來說具有復(fù)雜性。需要針對(duì)不同的品種，從培養(yǎng)基的成分，激素配比，培養(yǎng)條件，繼代周期等方面綜合考慮和優(yōu)化。要建立規(guī)模化的水稻的組織培養(yǎng)體系，為功能基因驗(yàn)證、分子育種、基因編輯技術(shù)研究以及獲得豐富的育種材料，培育出更多的適用于不同生態(tài)環(huán)境推廣的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗的水稻新品種奠定基礎(chǔ)。

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（本文責(zé)編：陳 珩）