漳平水仙茶餅多酚的純化及其體外活性研究

黎英 曾珍清 張薇 鄭蘭香 陳雪梅 石小瓊

摘 要 為了研究大孔樹脂對水仙茶餅多酚的純化效果，試驗以水仙茶餅多酚粗提液為原料，比較了9種不同型號大孔樹脂對水仙茶餅粗多酚的靜態(tài)吸附和解吸性能，再以吸附率和解吸率為指標通過靜態(tài)、動態(tài)吸附解吸試驗?？疾炝烁饕蛩貙X-28樹脂純化水仙餅茶粗多酚的影響，最后探討了純化前后的水仙茶餅多酚的體外抗氧化和抑菌效果。結(jié)果表明：最佳純化樹脂 LX-28，最佳吸附和解吸條件為1.5 mg/mL的質(zhì)量濃度的水仙茶餅多酚粗提取液（pH4.0～5.0）以2.0 mL/min的流速上樣95 mL，吸附平衡后去離子水沖洗至無色，再用70 mL，65%體積分數(shù)乙醇溶液（pH6.0）為洗脫劑，以3.0 mL/min流速洗脫，在此純化條件下LX-28樹脂對水仙茶餅多酚的吸附率和解吸率分別為（93.587±0.379）%和（95.330±1.282）%，樹脂可重復使用4次，純度提高了約3.04倍；對DPPH·和ABTS+·自由基清除率的IC50值分別從純化前的1.279、3.682 mg/mL降低到0.295、1.525 mg/mL；對供試的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、米根霉和紫紅曲霉均有不同程度的抑制作用，純化后的水仙茶餅多酚的抑菌效果優(yōu)于純化前。

關鍵詞 漳平水仙茶餅；多酚；大孔樹脂；純化；抗氧化；抑菌

中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A

Separation and Purification of Polyphenols from Zhangping

Shuixian Tea Cake by Macroporous Resin

and Its Vitro Activity

LI Ying， ZENG Zhenqing， ZHANG Wei， ZHENG Lanxiang，

CHEN Xuemei， SHI Xiaoqiong

Fujian Provincial Key Laboratory for the Prevention and Control of Animal Infectious

Diseases and Biotechnology / Longyan University， Longyan， Fujian 364012， China

Abstract The present study focuses on the separation and purification technology of the crude polyphenol extracted from Zhangping Shuixian tea cake by using a macroporous adsorption resin method. Nine different types of macroporous resins were adopted. Through the comparison of the separation effect， LX-28 was selected as the most efficient adsorbent as it had strong adsorption ability and high desorption rate. Based on the static and dynamic experiments of resin adsorption-desorption， the impact of LX-28 macroporous resin when purifying the polyphenols of Zhangping Shuixian tea cake was investigated， with adsorption and desorption rate as the index. Results were as follows： the optimal experimental conditions for static adsorption and desorption were determined as sample concentration 1.5 mg/mL（pH4.0～5.0）， sample volume 95 mL， flow rate 2.0 mL/min， elution ethanol concentration 65%（pH6.0）， elution volume 70 mL， flow rate 3.0 mL/min was built and applied to separate the polyphenols of Zhangping Shuixian tea cake. Additionally， under the above conditions， the desorption and desorption rate was（93.587±0.379）%，（95.330±1.282）%， LX-28 macroporous resin could be reused for 4 times， the purity rate was 3.04 times more than the original solution. Antioxidant test showed that the scavenging rates IC50 values to DPPH· and ABTS+· radical reduced from 1.279， 3.682 mg/mL to 0.295 and 1.525 mg/mL after purification. Antibacterial test showed that the effect of purified polyphenols on Escherichia coli， Staphylococcus aureus， Rhizopus oryzae and Monascus purpureus was better than unpurified polyphenols.

Key words Zhangping Shuixian tea cake； polyphenols； macro porous resin； purification； antioxidant； antibacterial

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.014

福建漳平水仙茶（Zhangping Shuixian Tea），其自元代開始種植，茶梗粗壯，葉張肥厚，于2009年獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的農(nóng)產(chǎn)品地理標志登記證書，迄今為止，種植面積近4.5 hm2，常年產(chǎn)量約達5 000 t。水仙茶餅又名“紙包茶”，是烏龍茶中唯一的緊壓茶，其制作綜合閩南和閩北烏龍茶的工序技術，工藝獨特（即木模壓制造型、包紙定型、焙干成形），產(chǎn)品外形見方扁平（4 cm×4 cm×1 cm），經(jīng)久藏，耐沖泡，色澤烏褐油潤，滋味醇厚，香高回甘，具有去濕、排毒、健胃通腸及久飲多飲不傷胃等特點[1-3]。

水仙茶餅多酚類化合物是水仙茶葉中的有效生物活性物質(zhì)之一，具有清除自由基、抑菌、抗氧化和預防心血管疾病等功效[4]。樹脂吸附分離技術是20世紀60年代發(fā)展起來的一種分離純化天然產(chǎn)物有效成分的方法，具有環(huán)保、選擇性好、吸附容量大、吸附迅速、解吸容易、操作及再生簡單、可重復使用及成本低等優(yōu)點[5-6]。不同來源的植物多酚類化合物由于其組成和極性強弱不同，所適用的樹脂類型也不同，目前大孔吸附樹脂已被廣泛用于分離純化植物中多酚類化合物，成為當前熱點研究課題[7-12]，但關于大孔吸附樹脂對水仙茶餅多酚的純化和效果研究尚未見報道。筆者基于上述研究背景及前期試驗獲得水仙茶餅粗多酚的基礎上，對9種不同類型大孔樹脂進行靜態(tài)篩選，通過靜態(tài)、動態(tài)試驗考察LX-28樹脂富集水仙茶餅多酚的條件參數(shù)，同時探討純化前后的水仙茶餅多酚的體外抗氧化和抑菌效果，以期為水仙茶餅的綜合開發(fā)和多酚富集提取提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水仙茶餅由漳平九鵬茶葉有限公司提供；沒食子酸、1，1-二苯基-2-三硝基本肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy1，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]均購自美國Sigma公司；樹脂D-101、HPD-100、LX-28、AB-8、DM-130、S-8、ADS-17、DA-201、NKA-9均購自廈門柏嘉生物科技有限公司；福林酚試劑、無水碳酸鈉、三氯化鐵、過硫酸鉀以及蛋白胨等均為國產(chǎn)分析純。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、紫紅曲霉（Monascus purpureus）等菌種由龍巖學院微生物科研室提供。

SHB-3型循環(huán)水多用真空泵；RE-2002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州杜甫儀器廠）；KQ-600D型數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-1800型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；PHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）；HVE-50型全自動高壓滅菌器（日本Hirayama公司）；Φ12 mm×200 mm和Φ30 mm×650 mm玻璃層析柱、DHL-A恒流泵、BSZ-100自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 水仙茶餅多酚提取及含量的測定 將水仙茶餅干燥、粉碎過60目篩，參照黎英等[2]研究參數(shù)略修改為：以液料比25 ∶ 1（mL/g）加入60%體積的乙醇，在50 ℃，400 W的超聲功率下提取35 min，提取2次后真空抽濾，濃縮，粗提液一部分50 ℃真空干燥，一部分冷藏保藏備用。

含量測定：采用Folin-Ciocalteu法測定水仙茶餅總酚含量。精確稱取10.03 mg經(jīng)105 ℃干燥至恒重的沒食子酸標準品，100 mL容量瓶定容，得質(zhì)量濃度為0.100 3 mg/mL標樣。依次吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL標準液于50 mL容量瓶，定容搖勻備用。移取上述系列溶液各2 mL于25 mL具塞刻度試管中，依次加入1.0 mL福林酚試劑和2.0 mL 20%碳酸鈉溶液混勻，加蒸餾水定容，室溫下靜置30 min。以0號管為空白對照，760 nm波長下測吸光度，得茶多酚質(zhì)量濃度C與吸光度A標準曲線回歸方程，如式（1），在0.0～6.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系。將樣品稀釋同法操作后測定計算樣品多酚含量。

A=0.860 9C+0.004 2，R2=0.999 3 （1）

1.2.2 大孔樹脂預處理與篩選 將樹脂D-101、HPD-100、LX-28、AB-8、DM-130、S-8、ADS-17、DA-201和XDA-9大孔樹脂用95%乙醇攪拌浸制后傾去上層懸浮小顆粒。濕法裝柱（Φ30 mm×560 mm），先以2 mL/min 95%乙醇洗脫至流出液加等量去離子水不變渾濁后，再用去離子水洗脫至無醇味。然后用5% HCl以2 mL/min 流速洗脫6 h后去離子水洗至中性，5% NaOH溶液同樣處理，去離子水浸泡備用。

稱取上述處理好的9種（樹脂D-101、HPD-100、LX-28、AB-8、DM-130、S-8、ADS-17、DA-201、NKA-9）大孔樹脂各2.0 g置于150 mL具塞磨口錐形瓶中，依次加入30.0 mL水仙茶餅多酚粗提液（1.563 mg/mL），于恒溫搖床振蕩（25 ℃，120 r/min，24 h）后過濾。用去離子水沖洗樹脂3～5次，濾干，加入體積分數(shù)為95%的乙醇50.0 mL振蕩（25 ℃，120 r/min，24 h）后過濾，分別測定各樹脂平衡液和解吸液中多酚吸光度并計算其質(zhì)量濃度，計算公式如（2）～（5）：

吸附量/（mg/g）=■ （2）

吸附率=■×100% （3）

解吸率=■×100% （4）

回收率=■×100% （5）

式中：m為樹脂質(zhì)量（g）；C0為粗提液多酚質(zhì)量濃度（mg/mL）；C1為平衡液多酚質(zhì)量濃度（mg/mL）；C2解吸液多酚質(zhì)量濃度（mg/mL）；V1為吸附液體積（mL）；V2為解吸液體積（mL）。

1.2.3 大孔樹脂LX-28的吸附和解吸動力學曲線

按照1.2.2方法振蕩吸附和解吸，測定、計算1、2、3、4、5、7、9、11、13、15、18、21、24 h的吸附平衡液、解吸液中水仙茶餅多酚質(zhì)量濃度，繪制動力學曲線。

1.2.4 優(yōu)化大孔樹脂LX-28分離純化水仙茶餅多酚工藝中靜態(tài)吸附、解吸試驗 （1）上樣液質(zhì)量濃度對大孔樹脂LX-28吸附效果的影響。準確稱取6份2.0 g預處理好的樹脂于150 mL具塞磨口錐形瓶中，將水仙茶餅粗提物配制成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL各取50 mL，振蕩（25 ℃、120 r/min、5 h）后測定各吸附平衡液的吸光度，進而計算吸附率。

（2）上樣液pH值對大孔樹脂LX-28吸附效果的影響。根據(jù)1.2.4（1）的結(jié)果選擇質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的水仙茶餅粗提液，于6份經(jīng)預處理好的2.0 g樹脂中分別加入pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0（1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)）上樣液50 mL，振蕩（25 ℃、120 r/min、5 h）后測定各吸附平衡液的吸光度，進而計算吸附率。

（3）乙醇體積分數(shù)對大孔樹脂LX-28解吸效果的影響。將吸附飽和的樹脂用去離子水沖洗除去殘留液后抽濾，分別加入50 mL體積分數(shù)為35%、45%、55%、65%、75%、85%的乙醇溶液，振蕩（25 ℃、120 r/min、3 h）后測定各解吸平衡液的吸光度，然后計算解吸率。

（4）洗脫液pH值對大孔樹脂LX-28解吸效果的影響。將吸附飽和的樹脂用去離子水沖洗除去殘留液后抽濾，分別加入pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0乙醇溶液（體積分數(shù)為65%，用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)）各50 mL，振蕩（25 ℃、120 r/min、3 h）后測定各解吸平衡液的吸光度，然后計算解吸率。

1.2.5 優(yōu)化大孔樹脂LX-28分離純化水仙茶餅多酚工藝中動態(tài)吸附、洗脫試驗 （1）上樣流速和體積對大孔樹脂LX-28吸附效果的影響。于6根玻璃層析柱（Φ12 mm×200 mm，1BV約20 mL）各濕法填充預處理好的大孔樹脂LX-28 10 g。按1.2.4優(yōu)化試驗結(jié)果，取一定體積質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的水仙茶餅多酚粗提液，用恒流泵調(diào)節(jié)分別以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL/min流速通過樹脂柱，分步收集（5.0 mL/管），測定流出液水仙茶餅多酚吸光度并計算其質(zhì)量濃度，繪制流出液多酚質(zhì)量濃度變化曲線。

（2）洗脫流速和體積對大孔樹脂LX-28解吸效果的影響。按1.2.4和1.2.5（1）優(yōu)化試驗條件，取6份70 mL水仙茶餅多酚原液（1.5 mg/mL，pH4.0～5.0），分別以4.0 mL/min的流速通過樹脂柱，待吸附完全后，用去離子水以2～3 mL/min流速沖洗樹脂柱至流出液無色（用苯酚-濃硫酸法和考馬斯亮藍法檢測）。再用一定體積65%乙醇（pH6.0）分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL/min洗脫流速（用恒流泵調(diào)節(jié)）進行洗脫，分步收集（每5.0 mL收集1管），測定、計算各流出液水仙茶餅多酚質(zhì)量濃度，繪制LX-28樹脂動態(tài)洗脫曲線。

1.2.6 水仙茶餅多酚的純化效果 用LX-28樹脂按1.2.4和1.2.5優(yōu)化試驗得到的純化分離條件處理水仙茶餅多酚原液，收集洗脫液，檢測其吸光度，蒸發(fā)濃縮，真空干燥，得純化水仙茶餅多酚。稱取純化前后水仙茶餅多酚各100 mg，65%乙醇定容至100 mL，取1 mL顯色，比較純化效果。

（1）水仙茶餅多酚體外抗氧化試驗。把純化前后的水仙茶餅多酚配成不同濃度溶液（簡稱待測液），比較純化前后的多酚抗氧化活性[13-15]。

①對DPPH·自由基清除作用測定。在各試管中取2.0 mL待測液加入2.0 mL 0.5 mmol/L DPPH乙醇溶液，搖勻，避光放置30 min，離心（3 000 r/min，10 min）后取上清液，以無水乙醇為參比液調(diào)零，于517 nm波長處測吸光度（Ai）。空白組以2.0 mL無水乙醇代替樣品測定吸光度（A0），同時測定對照組2.0 mL樣品液與2.0 mL無水乙醇混合液的吸光度（Aj），計算公式如（6）。

DPPH·清除率=（1-■）×100% （6）

②對ABTS+·自由基清除作用測定。將7.4 mmol/L ABTS（用20 mmol/L，pH4.5乙酸鹽緩沖液溶解）溶液50 mL和2.6 mmol/L K2S2O8水溶液50 mL混合，在室溫避光條件下放置12～16 h，形成ABTS+·儲備液，使用前用20 mmol/L，pH4.5乙酸鹽緩沖液稀釋至吸光度在734 nm處為0.700±0.02左右備用。于10 mL具塞比色管中加入不同質(zhì)量濃度的待測液0.1 mL和5 mL ABTS+·儲備液，充分混合避光靜置10 min，于734 nm波長處測吸光度A1（樣品液）、A0（空白吸光度，0.1 mL乙酸鹽緩沖液代替樣品液）、A2（本底吸光度，即5.0 mL乙酸鹽緩沖液代替ABTS+·儲備液），計算公式如（7）。

ABTS+·清除率=（1-■）×100% （7）

（2）純化前后的水仙茶餅多酚體外抑菌活性試驗。用少量乙醇將純化前后的水仙茶餅多酚干粉經(jīng)助溶，按1 ∶ 1（mg/mL）的比例摻入凝固前培養(yǎng)基后鋪板備用。細菌和真菌活化、擴培、稀釋，振搖制成孢子、菌絲或菌體菌懸液備用。無菌移液槍移取200 μL細菌菌懸液（濃度約為2×104 cfu/mL），無菌三角涂布棒均勻涂布在LB培養(yǎng)基表面，倒置培養(yǎng)（37 ℃，24 h），記錄菌落數(shù)計算抑菌率；打孔器（Φ5.0 mm）打濾紙片，浸泡，取出后貼于PDA平板表面培養(yǎng)（28 ℃，48 h），游標卡尺量取菌圈直徑并計算抑菌率[16-18]。計算公式如（8）～（9）。

細菌抑菌率=■×100% （8）

細菌抑菌率=■×100% （9）

式中：N0為空白培養(yǎng)基菌落數(shù)（個）；N為加水仙茶餅多酚培養(yǎng)基菌落數(shù)（個）；D0為空白培養(yǎng)基菌落直徑（mm）；D為加水仙茶餅多酚培養(yǎng)基菌落直徑（mm）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組試驗做3次平行，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0、Origin 8.5和Design-Expert 8.0.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂類型的確定

不同型號樹脂的理化性質(zhì)因其極性、孔徑大小、比表面積的不同而有所差異，對水仙茶餅多酚吸附和解吸效果也有所不同。由表1可知，9種樹脂的吸附和解吸性能差異較大，綜合吸附率、解吸率、回收率和吸附量4個參數(shù)，弱極性樹脂LX-28的4個參數(shù)值顯著高于其他8種樹脂（p<0.05）。這可能是由于水仙茶餅多酚類化合物呈現(xiàn)一定的弱極性，在LX-28弱極性樹脂柱上更容易吸附，故吸附量相對較高；同時可能由于LX-28樹脂比表面積較大，有利于洗脫，故解吸率和回收率相應也較大。綜合考慮富集效果以及洗脫難易，確定純化水仙茶餅多酚的最佳樹脂為LX-28。

2.2 水仙茶餅多酚在LX-28樹脂上的吸附和解吸動力學曲線

由圖1可知，初始階段LX-28樹脂對水仙茶餅多酚的吸附量和洗脫量較大，吸附液和洗脫液中的多酚質(zhì)量濃度變化幅度也大，當時間分別達到4 h和2 h左右時，吸附和解吸基本達到平衡，而之后吸附和解吸液中的多酚質(zhì)量濃度隨著時間的延長趨于平緩，其數(shù)值之間無顯著差異。因此，從節(jié)約時間和效果看，分別選擇4 h和2 h為最佳吸附和解吸時間。

2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸試驗結(jié)果

2.3.1 上樣液質(zhì)量濃度對LX-28樹脂吸附效果的影響 由圖2可知，上樣的質(zhì)量濃度過低時，LX-28樹脂對水仙茶餅多酚的吸附率也低，這可能是由于大部分樹脂未能吸附飽和充分利用而導致的。當質(zhì)量濃度增大到1.5 mg/mL時，吸附率值達到最大，而后隨質(zhì)量濃度的增大，吸附率下降。這可能是濃度過大易使樹脂發(fā)生多層吸附，內(nèi)部微孔堵塞，造成部分多酚化合物未及時被吸附流出。故選擇1.5 mg/mL為最適上樣液質(zhì)量濃度。

2.3.2 上樣液pH值對LX-28樹脂吸附效果的影響

大孔樹脂對目標成分的作用力和吸附效果受溶液酸堿度影響，因酸堿度的變化影響目標成分在溶液中的電離程度，使其結(jié)構(gòu)形式和溶解度相應發(fā)生改變，進而影響溶液的極性[19]。由圖3可知，當上樣液pH值為4.0和5.0時樹脂對水仙茶餅多酚的吸附率分別為（87.759±0.214）%和（88.013±0.506）%，兩者吸附能力相近。這可能是水仙茶餅多酚含大量酚羥基，呈一定酸性，過酸過堿都不利于其形成共價結(jié)構(gòu)，合適的酸度才利于保持分子狀態(tài)，使其以氫鍵方式借助范德華力被樹脂物理吸附。故上樣pH值控制在4.0～5.0比較適宜。

2.3.3 乙醇體積分數(shù)對LX-28樹脂解吸效果的影響

由圖4可知，LX-28樹脂對水仙茶餅多酚的解吸效果受乙醇體積分數(shù)的影響較大，隨乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先升高后略降低趨勢。乙醇體積分數(shù)為35%、45%、55%時，解吸率相對較低，這可能是由于乙醇含量不足不利于吸附的多酚類物質(zhì)解吸。乙醇體積分數(shù)為65%、75%時解吸率較高，但二者之間差異不顯著。之后解吸率略有下降，可能是由于乙醇體積分數(shù)高會使一些醇溶性雜質(zhì)和親脂性強的成分增加，水溶性多酚溶解量減少導致。從節(jié)約試劑量和生產(chǎn)效率角度考慮，宜選擇65%體積分數(shù)乙醇溶液作為洗脫劑。

2.3.4 洗脫液pH值對LX-28樹脂解吸效果的影響

由圖5可知，洗脫液pH值的變化對LX-28樹脂的解吸率影響較大，解吸率隨pH值升高呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢；當pH6.0時，LX-28樹脂的解吸率達最大值90.24%。這可能與水仙茶餅多酚提取物呈弱酸性有密切關系。故選擇pH6.0較為合理。

2.4 大孔樹脂LX-28動態(tài)吸附、洗脫試驗

2.4.1 上樣流速和體積對LX-28樹脂吸附效果的影響 一般情況下，目標物質(zhì)量濃度在流出液為上樣液的1/10左右時，認為基本達到了目標物的泄漏點，泄露點出現(xiàn)時間越早，說明樣液中目標物吸附愈不充分[20]。

由圖6可知，泄漏液中的多酚質(zhì)量濃度隨上樣液體積的增加而不斷升高并向上樣液濃度趨近，并且泄露點出現(xiàn)的越早，流速為4.0、3.0、2.0、1.0 mL/min時樹脂泄露點依次出現(xiàn)在70、80、95、100 mL附近，流速大于5.0 mL/min后未出現(xiàn)泄漏點。上樣體積相同情況下，流速越大目標物與樹脂相互接觸時間越短，使目標物來不及擴散被吸附就已隨滲透液流出，而流速慢接觸時間長有利于吸附效果就好，但流速過小泄漏點出現(xiàn)延遲，造成工藝流程周期延時。此外上樣體積越大樹脂越容易中毒，造成樹脂對目標物質(zhì)吸附作用減弱，流出液中水仙茶餅多酚質(zhì)量濃度越大，浪費嚴重，并影響樹脂重復使用次數(shù)[21]。綜合考慮，故選取吸附流速和上樣體積為2.0 mL/min，95 mL比較適宜。

2.4.2 洗脫流速和體積對LX-28樹脂解吸效果的影響 由圖7可看出，洗脫流速越快洗脫峰形越寬，這可能是由于流速太快，接觸時間過短，使深層吸附的多酚不能很好地被置換出來，曲線拖尾愈明顯，同時造成洗脫體積相應增加；而流速太慢，耗時，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。洗脫流速為3.0 mL/min時，LX-28樹脂吸附的水仙茶餅多酚洗脫效果最好，所得多酚含量最高，峰形對稱性較好，無明顯拖尾現(xiàn)象，而且在其體積達70 mL時，流出液吸光度接近0，水仙茶餅多酚基本被洗脫下來。綜合考慮，確定動態(tài)條件下洗脫流速和用量選擇3.0 mL/min和70 mL。

2.5 水仙茶餅多酚純化工藝驗證

將3份各10 g已預處理好的大孔樹脂LX-28濕法裝柱，試驗采用上述各因素的優(yōu)化參數(shù)，即質(zhì)量濃度1.5 mg/mL（pH4.0～5.0）的水仙茶餅多酚粗提取液95 mL，以2.0 mL/min吸附流速進行吸附試驗，然后用去離子水以2～3 mL/min沖洗樹脂柱至流出液無色，再用70 mL，pH6.0，65%乙醇以3.0 mL/min流速進行洗脫試驗，收集洗脫液，測定，濃縮，真空干燥。結(jié)果得到大孔樹脂LX-28對水仙茶餅多酚的吸附率、解吸率分別為（93.587±0.379）%、（95.330±1.282）%。

2.6 大孔樹脂LX-28重復使用次數(shù)確定

根據(jù)3.5方法操作，在3根樹脂柱上多次重復上柱吸附、水洗、醇洗，測定每次洗脫液的吸光度，計算水仙茶餅多酚回收率，當回收率小于60%時停止重復使用[22]，確定樹脂柱使用次數(shù)。

由表2可知，LX-28樹脂隨著使用次數(shù)的增加，對水仙茶餅多酚的回收率呈下降趨勢，連續(xù)重復使用5次時對多酚的回收率明顯下降，已小于60%，需要進行再生處理，再生后依然對水仙茶餅多酚保持了較高的回收率，從而可實現(xiàn)連續(xù)使用，故LX-28樹脂重復使用4次后進行再生。

2.7 LX-28樹脂對水仙茶餅多酚的純化和活性效果

2.7.1 大孔樹脂LX-28對水仙茶餅多酚純化和體外抗氧化效果 引用半數(shù)清除率IC50值（50%清除率）作為自由基清除能力的評價準則，對圖8中曲線利用Origin 8.5進行曲線回歸擬合處理[23-26]。

由表3可知，經(jīng)LX-28大孔吸附樹脂純化后，水仙茶餅總酚得率約為18.07%，其純度提高了約3.04倍；DPPH·、ABTS+·自由基清除能力的IC50值都明顯下降，說明純化后水仙茶餅多酚抗氧化能力明顯提高。

2.7.2 純化前后的水仙茶餅多酚體外抑菌活性分析

由圖9可知，純化前后的水仙茶餅多酚對細菌和真菌都有一定的抑菌作用，其中1.0 mg/mL水仙茶餅多酚劑量對大腸桿菌的抑菌率由純化前的80.6%上升到純化后的100%，對金黃色葡萄球菌從41.5%上升到56.9%，對米根霉和紫紅曲霉的抑菌率分別從30.1%、21.8%上升到36.2%、29.5%，總體上看純化后水仙茶餅多酚對真菌的抑制率不如對細菌的效果明顯。

3 討論

本研究通過考察9種不同型號大孔樹脂，確定LX-28是最適合水仙茶餅粗多酚的樹脂，吸附量高，回收率大，且能快速實現(xiàn)吸附和解吸動力學平衡，適用于水仙茶餅多酚的純化。

最佳純化條件為：用質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的水仙茶餅多酚粗提取液（pH4.0～5.0）以2.0 mL/min的流速上樣95 mL，吸附平衡后用去離子水以2～3 mL/min沖洗樹脂柱至流出液無色，再用70 mL，pH6.0，65%乙醇以3.0 mL/min的流速進行洗脫。在此條件下樹脂LX-28對水仙茶餅多酚的吸附率和解吸率分別為（93.587±0.379）%和（95.330±1.282）%；樹脂可重復使用4次；大孔樹脂純化后，水仙茶餅多酚固形物質(zhì)量由純化前的（5.013±0.016）g降到（0.906±0.003）g，得率約為18.07%，但其純度由（28.538±0.647）%提高到（86.752±0.081）%，純度提高了約3.04倍。而且純化后的水仙茶餅多酚對DPPH·和ABTS+·自由基清除率IC50值分別由純化前的1.279、3.682 mg/mL降為0.295、1.525 mg/mL；1 mg/mL水仙茶餅多酚劑量對真菌的抑制率不如對細菌的效果明顯，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、米根霉和紅曲霉的抑菌率分別從80.6%、41.5%、30.1%、21.8%上升到100%、56.9%、36.2%、29.5%。因此，說明本方法可有效去除雜質(zhì)，提高多酚的含量和體外抗氧化、抗菌活性，可為工業(yè)化的實際生產(chǎn)提供理論參考。

大孔樹脂的多孔性使其對周邊大小不同的物質(zhì)達到選擇性吸附的作用，又利用吸附力的不同和分子量的大小使多酚類化合物在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定濃度的有機溶劑解吸而達到分離的目的。此外，植物多酚的體外活性隨著多酚分子量的增大而增強，還與酚羥基的位置和數(shù)量有很大關系[27]。目前國內(nèi)外關于多酚分離純化及活性等方面的研究比較多，但未見有對于漳平水仙茶餅多酚的研究。因此，今后有必要對水仙茶餅多酚類化合物的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成和活性機理進行深入研究。

參考文獻

[1] 陳玉梅. 漳平水仙茶生產(chǎn)中存在的問題及對策[J]. 中國園藝文摘， 2013（9）： 224-225.

[2] 黎 英， 嚴月萍， 饒龍英， 等. 漳平水仙餅茶總黃酮提取工藝優(yōu)化研究[J]. 龍巖學院學報， 2015， 33（2）： 61-67.

[3] 屠幼英. 茶與健康[M]. 北京： 世界圖書出版公司， 2011.

[4] 杜密英. 茶多酚在食品工業(yè)的應用研究進展[J]. 福建茶葉， 2016（3）： 7-8.

[5] Deng T， Jia J F， Luo N， et al. A dual-task method for the simultaneous detoxification and enrichment of stilbene glycoside from polygonum multiflorum roots extract by macroporous resin[J]. Chem Eng， 2014， 237： 138-145.

[6] Sun Y， Yuan H， Hao L， et al. Enrichment and antioxidant properties of flavone C-glycosides from trollflowers usin macroporous resin[J]. Food Chemistry， 2013， 141（1）： 533-541.

[7] Xi L， Mu T， Sun H. Preparative purification of polyphenols from sweet potato （Ipomoea batatas L.） leaves by AB-8 macroporous resins[J]. Food Chemistry， 2015， 172： 166-174.

[8] Buran T J， Sandhu A K， Li Z， et al. Adsorption/desorption characteristics and separation of anthocyanins and polyphenols from blueberries using macroporous adsorbent resins[J]. Journal of Food Engineering， 2014， 128（1）： 167-173.

[9] 張 旭， 陳 丹， 曹麗娟， 等. 5種大孔樹脂純化鮮核桃青皮汁多酚工藝的比較[J]. 中成藥， 2016， 38（8）： 1 852-1 855.

[10] 李衍方， 高彩霞， 韓相恩. 大孔樹脂純化欒樹葉多酚工藝研究[J]. 生物質(zhì)化學工程， 2016， 50（4）： 42-46.

[11] 林建城， 林海蘭， 黃書斌， 等. 枇杷果皮中多酚物質(zhì)提取和純化工藝的優(yōu)化[J]. 熱帶作物學報， 2015， 36（7）： 1 348-1 354.

[12] 馬藝丹， 劉 紅， 馬思聰， 等. 神秘果種子多酚大孔樹脂純化工藝研究[J]. 食品與機械， 2016， 32（2）： 139-144.

[13] 邢 佳， 陸文娟， 趙云霞， 等. 石榴葉多酚的純化及抗氧化活性研究[J]. 南京師范大學報（自然科學版）， 2015， 38（3）： 84-90.

[14] 孫 建， 蔡為榮， 謝亮亮， 等. 荷葉多酚體外抗氧化活性研究[J]. 安徽工程大學學報， 2016， 31（6）： 1-5， 26.

[15] Chen Q， Gan Z， Zhao J， et al. In vitro comparison of antioxidant capacity of cumin （Cuminum cyminum L.） oils and their main components[J]. LWT-Food Science and Technology， 2014， 55（2）： 632-637.

[16] 楊航宇. 茶多酚抑菌作用的研究[J]. 草原與草坪， 2016， 36（4）： 78-81.

[17] 王亞麗， 李穎暢， 馬春暢， 等. 藍莓葉多酚提取物對3種細菌的抑菌活性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2015， 41（3）： 163-167.

[18] 董 璐， 代增英， 韓 晴， 等. 茶多酚對大腸桿菌抑菌機理的研究[J]. 生物學雜志， 2015， 32（1）： 72-75.

[19] Li C， Zheng Y Y， Wang X F， et al. Simultaneous separation and purification of flavonoids and oleuropein from Olea europaea L. （olive） leaves using macroporous resin[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2011， 91（15）： 2 826-2 834.

[20] Xiong Q P， Zhang Q H， Zhang D Y， et al. Preliminary separation and purification of resveratrol from extract of peanut （Arachis hypogaea） sprouts by macroporous resins[J]. Food Chem， 2014， 145（145C）： 1-7.

[21] 張海容， 黨 琦， 趙志剛， 等. 大孔樹脂對敗醬草多酚的分離及純化研究[J]. 化學研究與應用， 2015， 27（12）： 1 822-1 828.

[22] Sun L， Guo Y， Fu C， et al. Simultaneous separation and purification of total polyphenols， chlorogenic acid and phlorizin from thinned young apples[J]. Food Chemistry， 2013， 136（2）： 1 022-1 029.

[23] Shukla S， Mehta A， Mehta P， et al. Antioxidant ability and total phenolic content of aqueous leaf extract of Stevia rebaudiana Bert[J]. Experimental and Toxicologic Pathology， 2012， 64（7/8）： 807-811.

[24] Cheung L， Cheung P C， Ooi V E. Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts[J]. Food Chemistry， 2003， 82（2）： 249-255.

[25] Soong Y Y， Barlow P J. Antioxidant activity and phenolic content of selected fruit seeds[J]. Food Chemistry， 2004， 88（3）： 411-417.

[26] 陶 莎， 黃 英， 康玉凡， 等. 大孔吸附樹脂分離純化紅小豆多酚工藝及效果[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報， 2013， 29（23）： 276-285.

[27] Eric J L， Shi J R， Huynh H B， et al. Quantitative structure-activity relationship analysis of phenolic antioxidants[J]. Free RadcalBiol Med， 1999， 26： 285-294.