響應(yīng)面法優(yōu)化高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸的合成培養(yǎng)基研究

潘淼 孫立潔 陳祥松 袁麗霞 吳金勇 凌瑞 姚建銘

摘要[目的]對(duì)高山被孢霉利用合成培養(yǎng)基液體發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸（ARA）的發(fā)酵液組分進(jìn)行優(yōu)化。[方法]對(duì)培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)單一碳源、復(fù)合碳源進(jìn)行篩選，并優(yōu)化了它們的起始濃度。

利用單因素試驗(yàn)對(duì)多種無機(jī)氮源進(jìn)行了篩選。對(duì)具有顯著效應(yīng)的葡萄糖、甘油、酵母粉和氨基酸混合物4個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)后，利用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)對(duì)顯著因素進(jìn)行了優(yōu)化。[結(jié)果]最佳碳源組合為葡萄糖80 g/L+甘油20 g/L。以酵母粉為氮源，以氨基酸混合物為生長(zhǎng)因子添加到培養(yǎng)基中，可促進(jìn)高山被孢霉發(fā)酵液中ARA的積累。最佳合成培養(yǎng)基組分為：葡萄糖80 g/L，甘油12 g/L，酵母粉20 g/L，氨基酸混合物0.3 g/L。對(duì)優(yōu)化后的合成培養(yǎng)基進(jìn)行了驗(yàn)證，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)7 d后檢測(cè)其產(chǎn)量，測(cè)得平均產(chǎn)量為7.084 1 g/L，與預(yù)測(cè)值接近。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為進(jìn)一步提高ARA在工業(yè)化生產(chǎn)中的得率提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞花生四烯酸；高山被孢霉；合成培養(yǎng)基；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)TQ921文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）09-0001-04

Study on the Optimization of Synthetic Culture Medium for Producing Arachidonic Acid with Mortierella alpina by Using Response Surface Methodology

PAN Miao，SUN Lijie*，CHEN Xiangsong，YAO Jianming* et al

（Institute of Plasma Physics，Hefei Institutes of Physical Science， Chinese Academy of Sciences， Hefei，Anhui 230031）

Abstract[Objective] To study and optimize the ingredients of fermented liquid for synthetic culture medium for producing arachidonic acid with Mortierella alpine and increase the yield of ARA. [Method] The carbon sources in the culture medium were optimized，single carbon source and composite carbon source were screened and their initial concentrations were optimized. Many kinds of inorganic nitrogen sources were screened out by using single factor test. After steepest ascent test on four significant factors（glucose， glycerol， yeast powder and amino acid mixture）with significant effects，significant factors were optimized by using response surface center combination design. [Result] The optimum carbon source combination was 80 g/L glucose + 20 g/L glycerol. Taking yeast powder as nitrogen source，amino acid mixture added in the culture medium as a growth factor could promote the accumulation of ARA in the fermentation liquid of M. alpine. The optimized synthetic medium was composed of 80 g/L glucose， 12 g/L glycerol， 20 g/L yeast powder and 0.3 g/L amino acid mixture. The optimized synthetic medium was verified and the yield was detected after shake flask fermentation culture 7 days. The average yield of ARA was 7.084 1 g/L，which was close to the predicted value. [Conclusion] The research results can provide research basis for improving the yield of ARA in the industrial production of ARA further.

Key wordsArachidonic acid；Mortierella alpina；Synthetic culture medium；Response surface methodology

花生四烯酸（Arachidonic acid，簡(jiǎn)稱 ARA或AA），系統(tǒng)命名為全順△- 5，8，11，14-二十碳四烯酸，屬于ω-6系列的多不飽和脂肪酸。它是人體前列腺素合成的重要前體物質(zhì)，具有酯化膽固醇、 抑制血小板聚集、 增加血管彈性、 降低血液黏度、 調(diào)節(jié)白細(xì)胞功能和提高免疫力等一系列生理功能，已經(jīng)在保健食品、 醫(yī)藥、 化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-2]。天然來源中ARA含量低，不適宜大規(guī)模提取。近年來，利用高山被孢霉發(fā)酵法生產(chǎn)ARA因其產(chǎn)品中ARA含量高、且油脂組成合理等特點(diǎn)，一直作為工業(yè)生產(chǎn)的主要方式[3]。

在微生物發(fā)酵過程中，微生物的生長(zhǎng)和代謝主要依靠碳源、氮源及生長(zhǎng)因子，微生物一般可利用多種碳源和氮源，但其利用率差異較大[4]。高山被孢霉生物量的積累需消耗大量的碳源和氮源[5-6]，而油脂的積累主要依賴于消耗碳源[7]。氮源在微生物的生長(zhǎng)及發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用，通常分為快速氮源和遲效氮源[8]。研究發(fā)現(xiàn)，氮源在高山被孢霉發(fā)酵路徑中，參與多種酶的調(diào)控過程，如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、ATP檸檬酸裂解酶、脂肪酸合成酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶[9]等，當(dāng)?shù)春谋M而碳源仍然存在時(shí)，高山被孢霉的生長(zhǎng)受到限制[10]，此時(shí)脂肪開始積累作為儲(chǔ)存能量[11]；另外，不同氮源對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基pH的影響較大，同樣會(huì)影響到油脂的積累及ARA合成[12]。筆者采用響應(yīng)面法對(duì)高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸的合成培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為提高ARA工業(yè)化生產(chǎn)水平提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。高山被孢霉高產(chǎn)菌G10，由中國(guó)科學(xué)院生物技術(shù)工程平臺(tái)分離獲得；菌種保存于甘油管中，置于-80 ℃冰箱內(nèi)，每6個(gè)月轉(zhuǎn)存1次。

1.1.2

原培養(yǎng)基（CK）。種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均為葡萄糖80 g/L，酵母粉20 g/L，pH自然。

1.2方法

1.2.1

發(fā)酵培養(yǎng)。將斜面上的孢子刮下，制備孢子懸液，取5 mL孢子懸液接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于28 ℃、濕度40%～60%、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min 條件下培養(yǎng)2 d，將生長(zhǎng)好的種子以10%的接種量接入500 mL 裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，與種瓶培養(yǎng)條件相同，發(fā)酵7～11 d。

1.2.2測(cè)定項(xiàng)目與方法。

1.2.2.1

發(fā)酵菌體生物量。

搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，使用布氏漏斗對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行抽慮；

抽干得到的菌體放入烘箱105 ℃烘干，計(jì)算干重W即為生物量。

1.2.2.2

菌體油脂產(chǎn)量。

①使用研缽將烘干的菌體進(jìn)行研磨至細(xì)小的粉末，稱取上述研磨的粉末1～2 g，取精確值W0，用濾紙包住并系上棉繩，放入烘箱105 ℃烘至恒重，稱得濾紙包重量W1。

②將上述的濾紙包放入索氏提取器內(nèi)，用石油醚進(jìn)行索氏提取8～10 h后取出，105 ℃烘干，稱紙包重量W2。按照以下公式計(jì)算菌體油脂百分含量：

菌體油脂百分含量（%）=（W1-W2）/ W0×100%。

③按照以下公式計(jì)算油脂產(chǎn)量：油脂產(chǎn)量（g/L）=生物量（g/L）×油脂百分含量（%）。

1.2.2.3

油脂中ARA產(chǎn)量。

①樣品處理（甲酯化）。

稱取研磨菌渣約0.1 g，加入1 mL 0.5%氫氧化鉀甲醇溶液，于60 ℃條件下水浴30 min，每5 min搖勻1次，然后加入1 mL三氟化硼甲醇溶液，置于60 ℃條件下水浴30 min，每5 min搖勻1次，此后加入2 mL正己烷混勻后再加入1 mL飽和氯化鈉溶液搖勻，反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上層液體進(jìn)行氣相檢測(cè)。

②氣相色譜檢測(cè)條件。

DB-23ms（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛細(xì)管色譜柱。柱溫程序如下：90 ℃保持1 min，此后以9 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；載氣為氮?dú)?；流速?.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣（分流比1∶10）；進(jìn)樣量為1 μL；檢測(cè)器溫度為280 ℃。

③ARA百分含量的計(jì)算。

ARA百分含量的計(jì)算采用面積歸一法，即ARA在氣相檢測(cè)圖譜中的峰面積占總峰面積的百分比，用以評(píng)估ARA在總油脂含量中所占百分含量。④ARA產(chǎn)量的計(jì)算。按照以下公式計(jì)算ARA產(chǎn)量：ARA產(chǎn)量（g/L）=生物量（g/L）×油脂百分含量（%）×ARA百分含量（%）。

2結(jié)果與分析

2.1碳源優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1單一碳源對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)及發(fā)酵的影響。

選擇甘油、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖為單一碳源，濃度為80 g/L，培養(yǎng)基其余成分及含量不變。發(fā)酵培養(yǎng)7 d后檢測(cè)其生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量，結(jié)果表明在所有培養(yǎng)基的條件下高山被孢霉均可正常生長(zhǎng)，但添加不同種碳源其ARA產(chǎn)量不同，結(jié)果如圖1所示。在試驗(yàn)所用的5種碳源中，葡萄糖作為碳源進(jìn)行發(fā)酵所得ARA產(chǎn)量最高，為6.12 g/L，其次是乳糖作為碳源發(fā)酵所得ARA產(chǎn)量（5.65 g/L），而蔗糖作為唯一碳源發(fā)酵所得ARA產(chǎn)量最低，僅為5.19 g/L。

2.1.2復(fù)合碳源對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)及發(fā)酵的影響。

試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖為最佳單一碳源，而麥芽糖、蔗糖、甘油作為單一碳源時(shí)ARA也可積累，但產(chǎn)量較低。以葡萄糖為主要碳源，在此基礎(chǔ)上分別添加其他3種碳源作為復(fù)合碳源，發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源成分均為酵母粉20 g/L，碳源成分為：A.60 g/L葡萄糖 + 20 g/L麥芽糖；B.80 g/L葡萄糖 + 20 g/L麥芽糖；C.60 g/L葡萄糖+20 g/L蔗糖；D.80 g/L葡萄糖+20 g/L蔗糖；E.60 g/L葡萄糖+20 g/L甘油；F.80 g/L葡萄糖+20 g/L甘油。發(fā)酵培養(yǎng)7 d后檢測(cè)其生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量。從圖2可以看出，利用60 g/L葡萄糖+20 g/L蔗糖為復(fù)合碳源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，ARA產(chǎn)量最低（5.13 g/L）。80 g/L葡萄糖 + 20 g/L甘油為高山被孢霉提供碳源，最有利于其生長(zhǎng)及ARA積累，ARA產(chǎn)量達(dá)6.21 g/L。

2.2氮源優(yōu)化

在高山被孢霉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，普遍使用酵母粉作為氮源，但因其成分復(fù)雜，且穩(wěn)定性差，不同生產(chǎn)批次也會(huì)略有不同，導(dǎo)致產(chǎn)量波動(dòng)，并會(huì)對(duì)基礎(chǔ)理論的研究產(chǎn)生一定的影響，因此選擇合適的無機(jī)氮源至關(guān)重要。氮源主要包括NH4OH、硫酸氨（生理酸性物質(zhì)）、硝酸鉀（生理堿性物質(zhì)）、維生素、核苷混合物和氨基酸混合物。其中，核苷酸和氨基酸混合物的濃度主要參考文獻(xiàn)[13]并做適當(dāng)調(diào)整，具體試驗(yàn)組成分如下：

A.酵母粉20.0 g/L；

B.氨基酸混合物（蛋氨酸184 mg/L、胱氨酸184 mg/L、絲氨酸92 mg/L、蘇氨酸92 mg/L）；

C.硝酸鉀5.0 g/L；

D.NH4OH 2.5 g/L；

E.硫酸氨3.0 g/L；

F.維生素混合物（VB6 2 mg/L、煙酸2 mg/L、泛酸鈣2 mg/L、生物素2 mg/L、葉酸2 mg/L）。

利用上述各組組分制備的發(fā)酵液培養(yǎng)高山被孢霉7 d后進(jìn)行檢測(cè)。從圖3可以看出，以無機(jī)氮源硝酸鉀、NH4OH等替代有機(jī)氮源酵母粉會(huì)明顯影響ARA產(chǎn)量，約為正常發(fā)酵（A組）ARA產(chǎn)量的30%。但是，以氨基酸混合物為氮源時(shí)，ARA產(chǎn)量達(dá)2.82 g/L，略高于其他無機(jī)氮源組，推測(cè)這是由于氨基酸混合物除了能為高山被孢霉發(fā)酵提供氮源外，還可作為生長(zhǎng)因子參與到高山被孢霉生長(zhǎng)及代謝過程中，因此推測(cè)在酵母粉提供氮源的基礎(chǔ)上，氨基酸混合物作為生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)高山被孢霉發(fā)酵中ARA的積累。

45卷9期潘 淼等響應(yīng)面法優(yōu)化高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸的合成培養(yǎng)基研究

2.3響應(yīng)面法分析多因素發(fā)酵液組分對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)和ARA積累的影響

響應(yīng)面法（Response surface methodology）是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析優(yōu)化工藝參數(shù)，預(yù)測(cè)響應(yīng)值的一種統(tǒng)計(jì)方法[14]。隨著統(tǒng)計(jì)學(xué)在各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用，響應(yīng)面法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品學(xué)、工程學(xué)、生態(tài)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域[15]。

通過中心組合設(shè)計(jì)（Central composite design，CCD），取4因素5水平[± α（軸向點(diǎn)）、± 1（因素點(diǎn)）和中心點(diǎn)]，對(duì)α值進(jìn)行設(shè)定，試驗(yàn)取α=2采用中心組合設(shè)計(jì)對(duì)最陡爬坡試驗(yàn)確定的中心區(qū)域進(jìn)行考察，使用Minitab 17軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果確定的各顯著影響因素的最佳取值及預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證和可靠性分析，得到最終的優(yōu)化結(jié)果。

2.3.1中心試驗(yàn)點(diǎn)的確定。

通過上述試驗(yàn)得到對(duì)高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)量具有顯著影響的4個(gè)因素：葡萄糖（A）、甘油（B）、酵母粉（C）、氨基酸混合物（D），其中氨基酸混合物為蛋氨酸∶胱氨酸∶絲氨酸∶蘇氨酸=2∶2∶1∶1。

針對(duì)這4種因素的濃度進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，顯著因素的變化方向、步長(zhǎng)和試驗(yàn)結(jié)果見表1，將4種顯著因素采用擬合的回歸方程模型的系數(shù)符號(hào)及大小來確定顯著因素的步長(zhǎng)及變化方向，使響應(yīng)值快速地逼近最大響應(yīng)區(qū)間。由表1可知，

利用發(fā)酵成分組合（葡萄糖80.0 g/L，甘油12.0 g/L，酵母粉20.0 g/L和氨基酸混合物0.3 g/L）進(jìn)行發(fā)酵，ARA產(chǎn)量最高，因此以第4組的試驗(yàn)水平作為中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3.2中心組合設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析。

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，運(yùn)用Minitab 17軟件中的組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)4因素5水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2和3。利用Minitab 17軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，經(jīng)過擬合得到二次回歸方程模型。

ARA產(chǎn)量（g/L）=7.076+0.191 0A-0.172 9B+0.256 6C-0.087 2D-0.355 7A2

-0.404 5B2-0.433 7C2-0.594 4D2+0.025 9AB+0111 3AC+0.295 0AD+0.092 7BC +0235 0BD -0.097 2CD

根據(jù)響應(yīng)面分析三維圖，可得出碳源葡萄糖（A）、甘油（B）、氮源酵母粉（C）和生長(zhǎng)因子氨基酸混合物（D）4因素對(duì)ARA產(chǎn)量的影響，具體如圖4所示。

通過回歸方程得到以下優(yōu)化結(jié)果：A=99.390 g/L、B=9090 g/L、C=25.495 g/L、D=0.459 6 g/L，預(yù)測(cè)最大響應(yīng)值為7.166 4 g/L。從圖4可以看出，兩兩因素間的交互作用較明顯，最佳預(yù)測(cè)值在試驗(yàn)考察范圍內(nèi)，因此可采用此方法所得的各因素最佳值進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)酵效果驗(yàn)證。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)最優(yōu)化的4因素成分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行3批次試驗(yàn)驗(yàn)證，每批次設(shè)5個(gè)平行瓶，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)7 d后檢測(cè)ARA產(chǎn)量，結(jié)果表明平均ARA產(chǎn)量為7.084 1 g/L，與預(yù)測(cè)值（7.166 4 g/L）接近。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)11 d后檢測(cè)ARA產(chǎn)量，平均ARA產(chǎn)量達(dá)8.031 4 g/L。

3結(jié)論

筆者對(duì)高山被孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，分別對(duì)碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源及多種生長(zhǎng)因子的添加量進(jìn)行了研究。在碳源優(yōu)化研究中，考察多種單一碳源和復(fù)合碳源對(duì)高山被孢霉產(chǎn)ARA的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)搖瓶發(fā)酵時(shí)葡萄糖是最佳的單一碳源，而80 g/L葡萄糖 + 20 g/L甘油混合則是最佳的復(fù)合碳源，使用復(fù)合碳源發(fā)酵測(cè)得ARA產(chǎn)量比使用單一葡萄糖碳源提高了18.6%。在用無機(jī)鹽及多種生長(zhǎng)因子代替酵母粉提供氮源的研究中發(fā)現(xiàn)，酵母粉作為遲效氮源，最有利于高山被孢霉的生長(zhǎng)及油脂積累，并能獲得較高的ARA產(chǎn)量。以無機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子作為氮源，雖然目前尚不能滿足工業(yè)發(fā)酵的需求，但其優(yōu)勢(shì)是成分簡(jiǎn)單及含量穩(wěn)定，可避免工業(yè)生產(chǎn)中因酵母粉生產(chǎn)批次不同而導(dǎo)致ARA產(chǎn)量的不穩(wěn)定現(xiàn)象，該研究結(jié)果可為今后合成培養(yǎng)基代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)基的研究奠定基礎(chǔ)。筆者通過響應(yīng)面分析法確定了發(fā)酵培養(yǎng)基中多因素間的交互作用，得出最優(yōu)培養(yǎng)基組成，為高山被孢霉在工業(yè)生產(chǎn)中的發(fā)酵應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)。

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