響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取白頭翁總皂苷

于爽　郝婧瑋　孫曉薇　高劍　李帥　楊傳偉

摘要：采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波法輔助提取白頭翁總皂苷（pulsatilla saponin）的條件。以白頭翁皂苷B4提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法，確定最佳提取條件。結(jié)果表明，超聲波輔助提取白頭翁總皂苷的最佳工藝參數(shù)為超聲功率240 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間30 min。在此條件下白頭翁皂苷提取得率為5.35%。響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定合理，準(zhǔn)確可靠，是提取白頭翁皂苷的可行方法。

關(guān)鍵詞：白頭翁皂苷（pulsatilla saponin）；超聲波輔助提?。豁憫?yīng)面法

中圖分類號(hào)：TS229 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）04-0707-05

中藥白頭翁為毛茛科植物白頭翁[Pulsatilla Chinensis（Bge.） Regel]的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性味苦寒，具有清熱解毒、涼血止痢、燥濕殺蟲之功效[1，2]。其化學(xué)成分有白頭翁皂苷（pulsatilla saponin），胡蘿卜甙，白頭翁素等，主要有效成分為白頭翁三萜皂苷[3，4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，它具有增強(qiáng)免疫力，抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物等作用[5，6]，尤其在抗腫瘤及抗癌的新藥開發(fā)方面有很大的應(yīng)用潛力[7，8]。近年研究還發(fā)現(xiàn)其所含的某些活性成分對(duì)治療老年性癡呆（阿爾茨海默?。┬Ч@著[9，10]。

近年來，超聲波技術(shù)已經(jīng)被普遍應(yīng)用于提取植物中生物活性物質(zhì)，其具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點(diǎn)。超聲波在液體介質(zhì)中傳播時(shí)，可以在樣品和溶劑間產(chǎn)生特殊的空化作用，超聲波空化時(shí)產(chǎn)生的極大壓力可以提高細(xì)胞壁的通透性，使細(xì)胞內(nèi)的成分釋放，直接與溶劑接觸并溶解，提高了成分從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率[11-13]。本研究以白頭翁皂苷B4的提取得率為指標(biāo)，研究了影響白頭翁總皂苷超聲輔助提取效果的各因素，并通過響應(yīng)面分析法，確定了最佳提取工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用白頭翁的藥用價(jià)值提供了可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白頭翁飲片，產(chǎn)地東北，購(gòu)自藺氏盛泰藥業(yè)有限公司；白頭翁皂苷B4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（貴州迪大生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純。Waters 2695高效液相色譜儀（Waters公司）；Microfuge 22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；JAC-600超聲波中藥處理機(jī)（山東濟(jì)寧超聲電器有限公司）；色譜柱（4.6 mm×150 mm）；BSA2245S-CW電子分析天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；FZ102微型植物粉碎機(jī)（江東精密儀器公司）；自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Shimadzu VP-ODS （4.6 mm×150 mm，4.6 μm），流動(dòng)相為乙腈-水-磷酸（27∶73∶0.1，v/v），等度洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為201 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣體積10 μL，收集時(shí)間為17.201 min，定量方法為外標(biāo)工作曲線法。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 精密稱取白頭翁皂苷B4標(biāo)準(zhǔn)品3.00 mg置于5 mL容量瓶中，加入無水甲醇溶液定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，將白頭翁皂苷B4標(biāo)準(zhǔn)品母液依次梯度稀釋為0.300、0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以峰面積Y和皂苷含量X進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=2 586.4X-26.734，r=0.999 6，白頭翁皂苷含量在0.025～0.600 mg/mL。

1.2.3 樣品中白頭翁皂苷的測(cè)定 將白頭翁根粉碎，過50目篩，準(zhǔn)確稱取5.00 g按一定的料液比，分別加入一定濃度的乙醇溶液，設(shè)定超聲功率和超聲時(shí)間進(jìn)行提取，提取完畢后，濾液4 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，精密吸取各供試品溶液10 μL，按上述給定的條件測(cè)定峰面積，以回歸方程計(jì)算含量。

Y=CV/M×100%

式中，Y為提取得率；C為白頭翁皂苷B4濃度（mg/mL）；V為提取液體積（mL）；M為原料質(zhì)量（mg）。

1.2.4 超聲波輔助提取白頭翁皂苷的單因素試驗(yàn) 分別選取不同的粒徑大小、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比（g/mL，下同）、超聲時(shí)間、超聲功率和超聲次數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各單因素對(duì)白頭翁皂苷提取得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化白頭翁皂苷的提取條件 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)白頭翁皂苷提取效果的影響，利用Box-Behnken來設(shè)計(jì)試驗(yàn)，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以白頭翁皂苷提取得率為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法，對(duì)超聲提取條件進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助法提取白頭翁皂苷的單因素試驗(yàn)

2.1.1 粒徑大小對(duì)白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖1可見，白頭翁粉末顆粒越小，白頭翁皂苷提取得率越高。當(dāng)達(dá)到50目的粒徑時(shí)，白頭翁皂苷提取得率可達(dá)到5.19%，雖然60目的粒徑，白頭翁皂苷提取得率會(huì)略有增加，但樣品過于細(xì)小會(huì)將其他的糖等物質(zhì)溶出，不利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行，故選擇50 目的白頭翁粉末。

2.1.2 料液比對(duì)白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖2可見，當(dāng)料液比為1∶8時(shí)，白頭翁皂苷的提取得率可以達(dá)到最大，溶劑的量再繼續(xù)增加，白頭翁皂苷提取得率反而下降，其原因可能是當(dāng)溶劑用量增大到一定程度時(shí)，超聲波能量過多的作用于溶劑，影響了白頭翁皂苷提取得率，故料液比確定為1∶8。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖3可見，增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，白頭翁皂苷提取得率呈上升趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，皂苷提取得率達(dá)到最大值5.33%，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，皂苷提取得率反而呈下降趨勢(shì)。可能原因是過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)使得細(xì)胞壁處于收縮狀態(tài)，阻礙了皂苷的溶出，故確定60%為乙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)。

2.1.4 超聲功率對(duì)白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖4可見，隨著超聲功率的增加，白頭翁皂苷提取得率呈上升趨勢(shì)，超聲功率為60%（240 W）時(shí)，皂苷提取得率達(dá)到最大值5.33%，當(dāng)超聲功率超過60%（240 W）時(shí)，皂苷提取得率開始下降。因此確定超聲提取功率為60%（240 W）。

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖5可見，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，白頭翁皂苷的提取得率先升高后降低，在30 min時(shí)得率達(dá)到最高為5.24%；30 min后皂苷的得率降低，原因可能是白頭翁皂苷分子的化學(xué)鍵等被持續(xù)的超聲波破壞，甚至是斷裂，得到了其他產(chǎn)物，所以確定超聲提取時(shí)間為30 min。

2.1.6 超聲次數(shù)對(duì)白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖6可見，隨著超聲次數(shù)的增加，白頭翁皂苷提取得率呈上升趨勢(shì)，且在第2次提取時(shí)增加明顯，進(jìn)一步增加超聲次數(shù)，白頭翁皂苷提取得率有所提高但不顯著，考慮降低能耗及成本、節(jié)約溶劑，確定提取2次為宜。

綜上所述，根據(jù)單因素條件試驗(yàn)，初步選定過 50目的白頭翁粉末料液比1∶8，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲功率240 W，超聲時(shí)間30 min，超聲次數(shù)2次為最佳提取條件，采用響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助提取白頭翁皂苷工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助溶劑提取白頭翁皂苷

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析分析 超聲功率（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲時(shí)間（C）3個(gè)因素對(duì)白頭翁皂苷得率（Y）的影響，采用響應(yīng)面進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2。將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過軟件Design expert 7.0進(jìn)行多元回歸擬合，白頭翁皂苷提取得率與超聲提取各因素變量的二次回歸方程模型為：

Y=5.220+0.140A-0.096B+0.150C-0.200AB-0.089BC-0.470A2-0.560B2-0.630C2

根據(jù)回歸方程模型及試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)其各項(xiàng)進(jìn)行方差分析（表3）。由表3可知，二次回歸方程模型可達(dá)到極顯著（P<0.01）水平，其中，失擬項(xiàng)F=5.26（P>0.05）且誤差小，表明該方程模型對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及分析的結(jié)果有效可靠，決定系數(shù)為0.918 5，說明該模型的解釋程度較高，可以反映出91.85%的響應(yīng)值變化，擬合精度較好，可以預(yù)測(cè)白頭翁皂苷的不同提取條件。根據(jù)各因素的F值比較可知，影響程度最大的因素是C，其次為B，A的影響程度相對(duì)較小。一次項(xiàng)（A、C）交互項(xiàng)（AB）對(duì)結(jié)果有著顯著影響（P<0.05），二次項(xiàng)（A2、B2、C2）對(duì)結(jié)果影響極顯著（P<0.01）。

2.2.2 響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)面圖形是反映響應(yīng)值與各個(gè)試驗(yàn)因素之間變化的三維圖形，可從中分析出參數(shù)與最佳參數(shù)間的相互作用關(guān)系，測(cè)試因素間的交互作用關(guān)系由等高線的形狀反映，若兩因素相互作用顯著則呈現(xiàn)橢圓形。當(dāng)其形狀越向圓形趨近時(shí)，交互作用越弱。如果為標(biāo)準(zhǔn)圓形，可認(rèn)為這兩因素之間的相互作用可忽略不計(jì)。由圖7-圖9可以看出，超聲功率（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲時(shí)間（C）3個(gè)因素與白頭翁皂苷的提取得率（Y）呈拋物線關(guān)系，在自變量A、B、C的取值范圍內(nèi)，Y有著相應(yīng)的極高值與其對(duì)應(yīng)。

3 提取工藝條件的確定

為進(jìn)一步確定最佳工藝點(diǎn)，在模型濃度范圍內(nèi)選擇出發(fā)點(diǎn)，按照模型使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化，可得最佳理論工藝條件為超聲時(shí)間29.35 min，超聲功率59.08%，乙醇體積分?jǐn)?shù)60.95%?？紤]到實(shí)際應(yīng)用，將提取工藝參數(shù)修正為超聲時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲功率為60%（240 W），白頭翁皂苷提取得率達(dá)到5.45%，與理論值接近。因此，基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

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