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    菌糠中產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選、鑒定及增殖條件響應面法優(yōu)化

    2017-03-21 11:12:59秦翠靜陳寶江忻龍祚
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2016年11期
    關鍵詞:纖維素酶枯草芽孢桿菌響應面法

    秦翠靜+陳寶江+忻龍祚

    摘要:為了從菌糠中篩選高產(chǎn)纖維素酶的菌株,鑒定并優(yōu)化其培養(yǎng)條件,利用纖維素剛果紅篩選平板初篩,搖瓶復篩后得到菌株,鑒定后通過響應面法優(yōu)化培養(yǎng)條件。結(jié)果表明,分離篩選得到的高產(chǎn)纖維素酶的菌株,經(jīng)過形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16S rRNA序列分析,初步鑒定為芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),命名為S-4。采用響應面法對菌株S-4進行增殖條件的優(yōu)化,得到3個顯著因子,分別為葡萄糖添加量13.08 g/L,蛋白胨添加量 6.52 g/L,KH2PO4添加量0.37 g/L。通過響應面法優(yōu)化后,活菌量比初始培養(yǎng)提高了34.49%。

    關鍵詞:菌糠;枯草芽孢桿菌;纖維素酶;響應面法;培養(yǎng)基優(yōu)化

    中圖分類號:S816.3 文獻標志碼:A

    文章編號:1002-1302(2016)11-0457-03

    菌糠是培育食用菌后所剩的糠類物質(zhì),含有豐富的纖維素、粗蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)。隨著我國對食用菌需求量的加大,菌糠的產(chǎn)量也大大增加,菌糠資源的二次利用以及環(huán)境保護等方面面臨極大的挑戰(zhàn)[1-2]。近年來的大量研究表明,利用微生物發(fā)酵菌糠可以制成微生物制劑及飼料,纖維素、木質(zhì)素等被不同程度地降解,粗蛋白、粗脂肪均高于未經(jīng)發(fā)酵的基質(zhì),可以緩解資源的浪費[3]。另外,將菌糠制備成益生菌制劑用于動物飼養(yǎng),不僅有利于動物的消化吸收,而且降低了飼料成本[4-5]。

    以往研究中的發(fā)酵菌糠所用菌株多為保藏菌種,關于菌糠中菌種利用的報道很少。本試驗從菌糠中篩選出1株產(chǎn)纖維素酶能力強的菌株S-4,該菌株產(chǎn)生的纖維素酶可以更好地利用菌糠中的纖維素,降低纖維素含量。經(jīng)生理生化、16S rRNA序列對比及分析鑒定,菌株S-4為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase enzyme,CMCase)活力為67.5 U/ml。采用軟件Design-Expert 8.0的Plackett-Burman試驗篩選出對響應值影響較大的3個因素,利用最陡爬坡試驗逼近最大響應區(qū)域,用Box-Behnken試驗進一步優(yōu)化得到最大響應值及最優(yōu)增殖條件。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 樣品 菌糠樣品由河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院提供。

    1.1.2 試劑 羧甲基纖維素鈉(簡稱CMC-Na)、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏均由北京奧博星有限公司提供。MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4、葡萄糖由天津福晨化學試劑廠提供。

    1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、加水補足至1 000 mL,pH值7.0~8.0,121 ℃ 滅菌20 min,備用;發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基:CMC-Na 10 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、酵母粉5 g,加水補足至1 000 mL,121 ℃滅菌20 min,備用。剛果紅篩選培養(yǎng)基:CMC-Na 2 g、(NH4)2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 1 g、NaCl 0.5 g、剛果紅0.4 g、瓊脂20 g,加水補足至1 000 mL,pH值7.0,121 ℃滅菌30 min。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌株篩選

    1.2.1.1 富集培養(yǎng) 菌糠中添加2%糖蜜、1%硫酸銨、60%水,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵后的菌糠按 1 ∶9 的比例置于生理鹽水中,靜置30 min,5 000 r/min離心 5 min,將離心后得到的菌懸液進行梯度稀釋,涂布后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h。

    1.2.1.2 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩 將培養(yǎng)后的菌糠按1 ∶9的比例溶于生理鹽水中,5 000 r/min離心5 min,將離心后得到的菌懸液進行梯度稀釋,并涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基上,37 ℃ 培養(yǎng)24 h后放置2 d,測量透明圈直徑與菌落直徑,挑選出透明圈直徑與菌落直徑比值(簡稱圈菌比)較大的作為初篩菌株[6-7],在剛果紅初篩平板上進行劃線分離純化,并于斜面保存菌種。

    1.2.1.3 產(chǎn)纖維素酶菌株復篩 將初篩得到的菌株接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,于37 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h,后于4 ℃、5 000 r/min 離心10 min,測定上清液的羧甲基纖維素酶活性[8]。

    1.2.2 菌株鑒定

    1.2.2.1 形態(tài)學特征及生理生化鑒定 觀察菌株的菌落形態(tài),革蘭氏染色后觀察菌株顯微形態(tài)。利用細菌微量生化鑒定管進行生理生化鑒定[9]。

    1.2.2.2 菌株的基因鑒定 提取菌株的基因組,并對基因組進行擴增,采用試劑盒割膠回收之后連接片段,進行熱轉(zhuǎn)化,對基因片段進行PCR擴增。擴增引物的合成以及測序工作由華大基因完成。得到16S序列后,在NCBI系統(tǒng)通過Blast進行序列比對分析,利用Mega 5.0軟件的鄰接法創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10-12]。

    1.2.3 響應面法優(yōu)化菌株S-4發(fā)酵條件 通過Plackett-Burman(PB)試驗設計,從7個試驗因素中篩選出3個顯著影響因子[13-14],利用最陡爬坡試驗,使因素水平值逼近最大響應區(qū)域,結(jié)合響應面法BB試驗設計進一步研究,并利用Design Expert軟件進行回歸分析[15-16],尋求最佳水平,得到最優(yōu)發(fā)酵條件[17]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌糠篩菌

    由表1可知,圈菌比最大的菌株S-4為產(chǎn)纖維素酶能力最強的菌株。

    搖瓶發(fā)酵復篩結(jié)果顯示,菌株S-1、S-4的CMC活性分別為22.4、67.5 U/mL(表2)。綜合圈菌比和CMC活性可知,S-4為目的菌株。

    2.2 菌株S-4的鑒定

    2.2.1 形態(tài)學特征及生理生化鑒定 形態(tài)觀察表明,菌株 S-4 菌落形態(tài)為圓形,邊緣不整齊,表面褶皺,干燥不透明,白色;液體培養(yǎng)形成菌膜,分層明顯;經(jīng)過染色后,油鏡下觀察到菌體形態(tài)為桿狀,單個排列,革蘭氏染色陽性,有芽孢。表3為菌株S-4的生理生化鑒定結(jié)果。

    2.2.2 菌株的分子鑒定 提取菌株S-4的基因,進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳。S-4菌株16S rRNA序列的擴增產(chǎn)物約為1 500 bp。序列信息在NCBI進行Blast比對,S-4菌株16S rRNA序列與枯草芽孢桿菌的16S rRNA序列同源性為97%。從系統(tǒng)進化發(fā)育樹分析可知,菌株S-4與枯草芽孢桿菌的16S rRNA序列相似度最高(圖1)。結(jié)合序列對比分析,初步判斷菌株S-4為枯草芽孢桿菌。

    2.3 響應面法優(yōu)化菌株S-4發(fā)酵條件

    2.3.1 PB試驗 以枯草芽孢桿菌S-4為試驗菌株,以菌懸液D546 nm為響應值,于37 ℃、160 r/min搖床發(fā)酵,分析影響發(fā)酵的7個因素:A,葡萄糖;B,酵母粉;C,KH2PO4;D,K2HPO4;E,MgSO4;F,蛋白胨;G,牛肉膏。由表4可見,該模型相關性極顯著(P值=0.000 1<0.01),在90%的置信區(qū)間內(nèi),對于活菌量影響顯著的3個因素依次為A:葡萄糖,F(xiàn):蛋白胨,C:KH2PO4,以此作進一步的響應面分析。

    2.3.2 最陡爬坡試驗 根據(jù)一階方程,確定其變化的步長以及方向,試驗組合設計及結(jié)果見表5,可見第2組的Y值(D546 nm),即發(fā)酵后菌液中菌種生物含量最高。因此, 將葡萄糖含量12 g/L、蛋白胨含量6 g/L、KH2PO4含量0.4 g/L作為后續(xù)響應面Box-Behnken試驗的中心點。

    2.3.3 響應面Box-Behnken試驗 在本研究的條件和方法的基礎上,將A(葡萄糖12 g/L)、B(蛋白胨6 g/L)、C(KH2PO4 0.4 g/L)作為Box-Behnken試驗的中心點,采用Design Expert 8.0軟件對Box-Behnken試驗結(jié)果進行方差分析和二次多項擬合。由表6可知,模型的P值=0.000 4,此模型高度顯著,可信度高。A、C、AB、BC、A2、B2、C2對響應值都有顯著影響,表明3個因素對響應值不是簡單的線性關系。另外模型的R2=0.966 2,校正R2=0.913 7,說明該模型可以很好地模擬和驗證試驗的結(jié)果。變異系數(shù)為1.77%,置信度比較高,說明模型可以反映真實的試驗值。

    2.3.4 響應面分析 采用響應面法分析研究培養(yǎng)基成分,將PB試驗、最陡爬坡試驗、Box-Behnken試驗結(jié)合。結(jié)果顯示,當3個顯著因子分別為葡萄糖含量為13.08 g/L、蛋白胨含量為6.52 g/L、KH2PO4含量為0.37 g/L時,優(yōu)化后活菌量比初始培養(yǎng)提高了34.49%。由圖2、圖3、圖4可知,AB、BC之間具有十分明顯的交互作用,AC之間的交互作用較小。為了驗證結(jié)果的可靠性,保證發(fā)酵條件一致,分別于基礎培養(yǎng)基、優(yōu)化后的培養(yǎng)基中對菌株S-4進行試驗,每組3個平行,并取平均值,得到優(yōu)化后的D546 nm為3.478±0.034,與響應面分析預測結(jié)果擬合良好,基礎培養(yǎng)基D546 nm為2.586±0.026,優(yōu)化后的D546 nm比初始培養(yǎng)的提高了34.49%。

    3 討論與結(jié)論

    通過對菌糠樣品富集培養(yǎng),利用纖維素篩選平板初篩、搖瓶發(fā)酵復篩,得到1株高產(chǎn)纖維素酶的菌株S-4。經(jīng)過生理生化鑒定,并結(jié)合16S rRNA序列對比分析,鑒定為枯草芽孢桿菌,CMC活性為67.5 U/mL。采用響應面法分析培養(yǎng)基成分得出,當3個顯著因子分別為葡萄糖含量 13.08 g/L、蛋白胨含量6.52 g/L、KH2PO4含量0.37 g/L時,優(yōu)化后活菌量比初始培養(yǎng)提高了34.49%??莶菅挎邨U菌為飼用益生菌,且高產(chǎn)纖維素酶,用它來發(fā)酵菌糠,不僅可以降低粗纖維的含量,還能提高蛋白含量??莶菅挎邨U菌也可以提高動物腸道內(nèi)的消化利用率[18-19]。響應面法優(yōu)化增殖培養(yǎng)條件,試驗次數(shù)少,周期較短,且對影響試驗的各個因素進行分析總結(jié),分析顯著影響因子之間的交互作用,是一種高效優(yōu)化發(fā)酵條件的途徑[20-22]。

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