大竹蟶源多肽與鈣螯合物的制備工藝及生物活性研究

王夢(mèng)婭++陳媛媛++錢(qián)文舉++胡沁瑩++周宇++王夢(mèng)璠++韓曜平

摘要：以大竹蟶肉蛋白和氯化鈣為原料，復(fù)合酶解法制備大竹蟶源多肽螯合鈣，考察螯合溫度、時(shí)間、大竹蟶源多肽與鈣離子的質(zhì)量比和pH對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響。根據(jù)響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果，在溫度50 ℃，時(shí)間40 min，質(zhì)量比1∶2，pH7.0條件下，螯合率為32.73%，螯合物中鈣含量為41.89%。傅里葉變換紅外光譜掃描檢測(cè)結(jié)果表明，竹蟶源多肽與鈣離子形成了螯合物，以硫代巴比妥酸法和抑菌圈試驗(yàn)分別驗(yàn)證此螯合物具有抗氧化活性和抑菌活性。

關(guān)鍵詞：大竹蟶；多肽鈣螯合物；制備工藝；抗氧化活性；抑菌活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S986.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）08-1530-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.031

The Bioactivity and Preparation Technology for Peptides-Ca2+ from Solen grandis Proteins

WANG Meng-ya，CHEN Yuan-yuan，QIAN Wen-ju，HU Qin-ying，ZHOU Yu，WANG Meng-fan，HAN Yao-ping

（ College of Biology and Food Science， Changshu Institute Technology， Changshu 215500， Jiangsu，China）

Abstract： The combination between Solen grandis polypeptides and calcium chloride was studied based on the preparation of Solen grandis polypeptides from compound enzyme. Under given conditions，calcium binding capacity and chelated calcium content were investigated as a function of reaction temperature，time，mass ratio between Solen grandis polypeptides and calcium chloride（P/C） and pH. On the basis of the results of response surface analysis，the four reaction parameters were optimized to be 50 ℃，40 min，a P/C ratio of 1∶2 and pH 7.0，yielding a calcium binding capacity of 32.73% and a chelated calcium content of 41.89%. The formation of ca-polypeptide chelate was confirmed by the FT-IR spectra. The result indicates that the calcium chelate with Solen grsndis polypeptides. TBA test and the experiments of anti-bacterium-circles show that the chelate products are characteristic of oxidation resistance and antibacterial activity.

Key words：Solen grandis；peptides-Ca2+；preparation technology；antioxidant activity；antibacterial activity

鈣離子是機(jī)體內(nèi)各項(xiàng)生命活動(dòng)都不可缺少的一種物質(zhì)。它對(duì)于維持生物細(xì)胞膜兩側(cè)的生物電位，維持正常的神經(jīng)傳導(dǎo)功能，維持正常的肌肉伸縮及舒張功能以及神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)功能具有非常重要的作用，而且一些激素的作用機(jī)制也均需鈣離子表現(xiàn)出來(lái)，如作為凝血因子參與凝血過(guò)程；參與肌肉包括骨骼肌和平滑肌的收縮過(guò)程；參與神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，激素的合成與分泌過(guò)程；骨骼的形成等[1-3]。由于中國(guó)的膳食結(jié)構(gòu)以植食性為主，難以攝入足夠的易被人體吸收的鈣，而含鈣量較多的奶和奶制品的攝入量較少，致使中國(guó)人普遍缺鈣，是全球居民缺鈣的首要國(guó)家[4]。而鈣離子與多肽螯合形成有機(jī)肽后，能夠借助多肽在體內(nèi)的吸收機(jī)制提高其吸收率[5]。金屬鈣離子與蟶子多肽形成的螯合物具有口感好、易吸收等特點(diǎn)，并且其他方面的生物活性如抗氧化性和抗菌活性也得到了增強(qiáng)，同時(shí)提高了鈣離子和蟶子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。蟶子肉口味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，俗稱“海里的人參”，“小人仙”，一直是餐桌上的常客，而且蟶子養(yǎng)殖具有生長(zhǎng)快、生長(zhǎng)周期短、易管理、產(chǎn)量高、成本低、效益好、見(jiàn)效快等特點(diǎn)，總之價(jià)格便宜，是一種大眾化的海產(chǎn)食品，可以作為很好的多肽來(lái)源[6]。

本研究以江蘇常熟常見(jiàn)的大竹蟶為原料，采用酶法[7]水解制備得到蟶子肉蛋白水解物，將此水解物與鈣離子螯合在不同的條件下進(jìn)行螯合并研究其螯合物的抑菌活性和抗氧化活性，以期獲得最佳的螯合工藝和具有高抑菌活性和高抗氧化活性的金屬離子多肽螯合物，為具有抑菌活性和抗氧化活性的金屬離子多肽螯合物的研究與開(kāi)發(fā)以及為補(bǔ)鈣的保健品研究與開(kāi)發(fā)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

竹蟶，江蘇常熟農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，上海奧宇生物科技有限公司；亞油酸標(biāo)品、α-生育酚標(biāo)品、2-硫代巴比妥酸標(biāo)品，Sigma公司；諾氟沙星藥品，上海浩然生物技術(shù)有限公司。AKTA蛋白純化系統(tǒng)：醋酸，無(wú)水乙醇，氯化鈣，乙二胺四乙酸二鈉，鉻黑T，氨水-氯化銨緩沖液。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

臺(tái)式高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；雷磁牌臺(tái)式pH計(jì)（pHSJ-4A），上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床，上海申賢恒溫設(shè)備廠；傅里葉變換紅外光譜儀（NICOLET380型），美國(guó)Thermo公司；超凈工作臺(tái)，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)；冷凍干燥機(jī)；絞肉機(jī)；恒溫加熱磁力攪拌器。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 蟶子多肽的制備 將蟶子去殼、去雜物，洗凈蟶子的肉蛋白，絞肉機(jī)攪碎，加0.5倍的水，調(diào)pH至6.0左右，以質(zhì)量比100∶1分別加入木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，在50 ℃下，放入恒溫加熱磁力攪拌器中酶解5 h，酶解后，放入離心管中5 000 r/min離心10 min，去沉淀取上清，漏斗過(guò)濾，將濾液倒入適量大小的培養(yǎng)皿中（厚度1 cm左右），保鮮膜封住，放入冰箱冷凍成塊，膜上戳小孔，放入真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，得到凍干粉。

1.2.2 蟶子多肽與鈣螯合物的制備 按一定的質(zhì)量比稱取蟶子多肽凍干粉和氯化鈣，加入適量的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH、溫度，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行一定時(shí)間的螯合反應(yīng)，螯合結(jié)束后，向螯合溶液中加入無(wú)水乙醇進(jìn)行離心，去上清取沉淀，將沉淀放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥12 h，得到凍干粉。

1.2.3 單因素試驗(yàn) ①螯合溫度對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響。稱取5份200 mg的蟶子多肽粉末，分別加入277.5 mg的氯化鈣，用20 mL的蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH至6.5，分別在30、40、50、60、70 ℃下放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行螯合反應(yīng)40 min。②螯合時(shí)間對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響。稱取4份200 mg的蟶子多肽粉末，分別加入277.5 mg的氯化鈣，用20 mL的蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH至6.5，放入50 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行螯合反應(yīng)30、40、50、60 min。③螯合pH對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響。稱取9份200 mg的蟶子多肽粉末，分別加入277.5 mg的氯化鈣，用20 mL的蒸餾水溶解，分別調(diào)節(jié)pH為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，放入50 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行螯合反應(yīng)40 min。④多肽與鈣離子的質(zhì)量比對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響。稱取7份200 mg的蟶子多肽粉末，分別加入50、40、66、67、100、200、400、800 mg的氯化鈣，即分別以質(zhì)量比4∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4，用20 mL蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH至6.5，溫度50 ℃，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行螯合反應(yīng)40 min。

1.2.4 螯合物中鈣含量和螯合率的測(cè)定 按照“1.2.2”中的螯合反應(yīng)步驟，螯合結(jié)束后，取5 mL螯合溶液加入80%乙醇溶液45 mL離心去沉淀取上清，取10 mL上清液放入錐形瓶中，氨水-氯化銨緩沖液調(diào)pH至12左右，加鉻黑T溶液，用EDTA二鈉溶液滴定，記錄每個(gè)錐形瓶所耗EDTA二鈉溶液體積數(shù)，取平均值，按照下列公式進(jìn)行計(jì)算：

游離鈣離子質(zhì)量=CEDTA×滴定體積×40×螯合溶液稀釋倍數(shù)；

螯合物中鈣含量=

■×100%

螯合率=■×100%

1.2.5 響應(yīng)面分析確定最佳螯合工藝 利用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，4因素3水平，共29組設(shè)計(jì)配方進(jìn)行螯合及滴定試驗(yàn)，之后進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定最佳螯合工藝（表1）。

1.2.6 檢測(cè)竹蟶多肽螯合鈣離子后的變化 將蟶子多肽鈣螯合物通過(guò)凝膠柱，分離純化后的螯合物冷凍干燥使成凍干粉，然后進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)，與多肽進(jìn)行比較氨基（3 400 cm-1）和羧基 （1 700 cm-1）的變化。

1.2.7 分離純化多肽螯合物 利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，將竹蟶多肽鈣螯合物進(jìn)行分離純化，之后收集目標(biāo)峰值對(duì)應(yīng)的溶液即純化后的螯合物溶液冷凍干燥，得到凍干粉，備用。

1.2.8 抗氧化活性檢測(cè) 采用硫代巴比妥酸法[8]測(cè)定螯合物的抗氧化活性，α-生育酚作為標(biāo)準(zhǔn)品比較螯合物的抗氧化活性。

1.2.9 抑菌活性檢測(cè) 選用大腸桿菌（革蘭氏陰性）和枯草桿菌（革蘭氏陽(yáng)性）兩種菌做濾紙片[9]抑菌圈試驗(yàn)，比較抑菌圈的有無(wú)和大小，檢測(cè)螯合物的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

1）螯合溫度對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響。由圖1可知，螯合溫度對(duì)螯合物中的鈣含量影響不大，而螯合溫度50 ℃時(shí)有較好的螯合率，所以選取50 ℃為最佳的螯合溫度。

2）螯合時(shí)間對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響。由圖2可知，螯合時(shí)間對(duì)螯合物中鈣含量的影響不大，在螯合40 min后有較好的螯合率，所以選取40 min為最佳的螯合時(shí)間。

3）螯合pH對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響。由圖3可知，pH在3.0～7.5時(shí)螯合物中鈣含量變化很小，pH在7.5～9.0時(shí)螯合物中鈣含量一直在升高；而pH在3.0～7.5時(shí)螯合率變化較明顯，尤其pH為7時(shí)螯合率最高，而pH為7.5時(shí)螯合率略微下降，之后便一直上升。當(dāng)pH為7.5之后螯合物中鈣含量和螯合率一直都呈較大的上升趨勢(shì)，根據(jù)試驗(yàn)過(guò)程，推測(cè)原因是在螯合前加入的氫氧化鈉與鈣離子結(jié)合，溶液中的游離鈣離子量減少，導(dǎo)致螯合率和螯合物中鈣含量同時(shí)迅速升高。所以選擇pH為7。

4）多肽與鈣離子的質(zhì)量比對(duì)螯合率和螯合物中鈣含量的影響。由圖4可知，質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響不大；在質(zhì)量比1∶1之前，隨著質(zhì)量比的變大，螯合物中鈣含量的變化不大，在1∶1處有一個(gè)較大的提高，在1∶1之后，螯合物中鈣含量提升較快。作為最佳的制備工藝，考慮到材料的利用率，在質(zhì)量比0.5和0.25時(shí)，雖然螯合物鈣含量相對(duì)較高，但根據(jù)試驗(yàn)情況，試驗(yàn)中氯化鈣的浪費(fèi)情況較嚴(yán)重，利用率不高，而且還需要對(duì)螯合產(chǎn)品中多余氯化鈣進(jìn)行分離處理，所以選取1∶2作為最佳的質(zhì)量比。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果確定對(duì)多肽與鈣螯合反應(yīng)影響較明顯的4個(gè)因素的較好水平，由于螯合物中鈣含量變化隨著反應(yīng)條件的改變不如螯合率變化明顯，故以螯合率作為判定最佳反應(yīng)條件的響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)[10]（表2）。

利用Design expert 9.0.6軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到以螯合率為響應(yīng)值的線性擬合方程：螯合率=-644.898 75-15.254 44A+1.832 92B+2.344 5C+169.296 67D+0.033 333AB+0.053 333AC+1.02AD-0.008 75BC-0.06BD-0.195CD-1.444 44A2-0.010 88B2 -0.000 721 25C2-11.4D2。式中，A為質(zhì)量比；B為時(shí)間；C為溫度；D為pH。且通過(guò)計(jì)算得蟶子多肽與鈣螯合反應(yīng)的最佳條件是質(zhì)量比1∶2，溫度49.98 ℃，時(shí)間39.74 min，pH 6.98，預(yù)測(cè)螯合率32.73%。按照此條件，重復(fù)3次取平均值，實(shí)際螯合率為32.33%，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)際結(jié)果擬合性良好，響應(yīng)面的優(yōu)化方案可以使用，較為可靠。表3為模型顯著性分析，由表3可知A、D及AB較顯著。

2.3 多肽螯合鈣離子后的變化結(jié)果

由圖5可知，螯合物和蟶子多肽的特征峰位置相同，而每個(gè)特征峰對(duì)應(yīng)的基團(tuán)含量相差較大。在 3 400 cm-1附近多肽和螯合物都出現(xiàn)了強(qiáng)而寬的吸收峰，應(yīng)該是-COOH中的-OH與N-H的伸縮帶重疊，是因?yàn)槎嚯闹泻写罅康?COOH和-NH2，螯合物中-OH帶較多肽向低波段移動(dòng)了一些，一級(jí)螯合物中-OH吸收峰面積遠(yuǎn)小于多肽中的峰面積，由于多肽在變成螯合物后，溶解度大大降低，表明多肽中的-OH參與螯合環(huán)的構(gòu)成，-NH2也可能以提供孤電子對(duì)的方式參與螯合環(huán)的形成；在1 636 cm-1附近的吸收峰來(lái)自-C=O的伸縮振動(dòng)，螯合物中-C=O帶較多肽向低波段稍稍移動(dòng)了一些，螯合物和多肽的吸收峰面積比較后也減少了，說(shuō)明-C=O也參與了螯合環(huán)的構(gòu)成；1 402 cm-1附近的吸收峰來(lái)自酰胺鍵中的-C-N，同樣也可能參與了螯合環(huán)的形成。綜上所述，蟶子多肽和鈣離子已形成螯合物。

2.4 螯合物的分離純化

由圖6可知，為蟶子多肽與鈣螯合物經(jīng)過(guò)AKTA蛋白分離純化系統(tǒng)后的曲線?；钚詸z測(cè)表明，多肽螯合物主要集中在最高峰值處。

2.5 抗氧化性檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)硫代巴比妥酸法檢測(cè)亞油酸氧化量，檢測(cè)紅色素在535 nm處的吸光度，同α-生育酚的抗氧化性對(duì)照比較，根據(jù)公式抑制率=（M-N）/（M-W）×100%，（M表示加入50 μL純化水+0.2 mL亞油酸混合液的吸光度，N表示加入50 mg多肽+0.2 mL亞油酸混合液的吸光度，W表示加入50 μL α-生育酚+0.2 mL亞油酸混合液的吸光度），計(jì)算試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，可得出蟶子多肽鈣螯合物的抗氧化活性相當(dāng)于α-生育酚的71.08%。

2.6 抑菌活性檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)濾紙片抑菌圈試驗(yàn)，得到蟶子多肽螯合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有一定的抑菌效果。

3 結(jié)論

考慮到工藝簡(jiǎn)化，提高資源利用率，根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果得到最佳的螯合工藝為蟶子多肽與鈣離子的質(zhì)量比為1∶2，溫度49.98 ℃，時(shí)間39.74 min，pH 6.98。根據(jù)實(shí)際情況，確定最佳的大竹蟶多肽與鈣離子的最佳螯合條件為蟶子多肽與鈣離子的質(zhì)量比為1∶2，溫度50 ℃，時(shí)間40 min，pH 7.0。

螯合后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)分離純化，傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)說(shuō)明大竹蟶多肽和鈣離子進(jìn)行了螯合反應(yīng)，硫代巴比妥酸法試驗(yàn)表明其具有較好的抗氧化性，抑菌圈試驗(yàn)表明此螯合物也具有抗菌活性，所以有望作為一種良好的保健品。

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