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    枸杞棉蚜SSR—PCR反應體系的建立與優(yōu)化

    2017-05-23 20:30:43李琳琳嚴林王海春李成潔冶成祥
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2017年7期
    關(guān)鍵詞:單因素試驗棉蚜

    李琳琳+嚴林+王海春+李成潔+冶成祥+謝永麗

    摘要:采用單因素法和L25(55)正交試驗設計進行簡單重復系列PCR(SSR-PCR)反應體系優(yōu)化,并對引物退火溫度進行篩選,以建立適宜枸杞棉蚜的SSR反應體系和擴增程序。結(jié)果表明,枸杞棉蚜SSR-PCR的優(yōu)化體系總體積為25 μL,包括50 ng模板DNA,1.5U Taq DNA聚合酶,150 μmol/L Mg2+,300 μmol/L dNTPs,0.4 pmol/μL引物,優(yōu)化后的檢測體系更為經(jīng)濟有效;Ago66引物PCR適宜退火溫度為58 ℃。

    關(guān)鍵詞:棉蚜;SSR;單因素試驗;正交優(yōu)化

    中圖分類號: S435.671文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2017)07-0040-04

    運用分子生物學技術(shù)研究蚜蟲已經(jīng)成為熱點問題[1],棉蚜的分子生物學研究多集中于棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜,國內(nèi)學者孟玲等初步應用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)研究黃瓜寄主和棉花寄主的棉蚜遺傳多樣性,奠定了一定的基礎[2-3]。鄒晨輝等采用簡單重復序列(SSR)初步研究了不同地理及季節(jié)的棉花型棉蚜遺傳多樣性[4-6]。國外學者Fuller等運用SSR技術(shù)研究了歐洲、非洲、美洲、亞洲等地區(qū)多個國家的棉蚜遺傳多樣性,這些棉蚜原寄主涉及棉花、葫蘆科、棉花、茄子、馬鈴薯、辣椒、花椒、梨樹和柑橘樹[7-9]。枸杞是重要的藥用經(jīng)濟作物,棉蚜危害嚴重,國內(nèi)外尚缺少對原寄主是枸杞的棉蚜分子生物學方面的研究資料。

    微衛(wèi)星DNA是短的堿基重復序列,最早在寄居蟹中被發(fā)現(xiàn)[10],在真核生物中廣泛存在,由于點突變、不等交換、基因轉(zhuǎn)換等原因,使其變異速率高,因此具有高的多樣性及種特異性[11]。微衛(wèi)星分子標記是基于PCR的第二代分子標記技術(shù)[12],具有重復性好、多態(tài)性高、共顯性、所需DNA量少、操作簡單等優(yōu)點。正是由于微衛(wèi)星分子標記是基于PCR的,因此優(yōu)化的PCR體系與擴增條件是微衛(wèi)星分子標記的前提條件。

    單因素試驗無法考慮到因素之間的交互作用,正交試驗無法分析因素的影響趨勢,本研究綜合以上2種方法,彌補不足,以枸杞棉蚜為材料,對DNA用量、Taq聚合酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度和引物濃度5個因素進行優(yōu)化,建立枸杞棉蚜SSR-PCR試驗的最佳反應體系,并在此基礎上得到引物的最適退火溫度。本試驗探討枸杞棉蚜種群遺傳多樣性研究中 SSR-PCR方法的一致性、可靠性和可重復性,為枸杞棉蚜種群遺傳多樣性分析、生物型鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等研究奠定基礎。

    1材料與方法

    1.1材料與試劑

    1.1.1材料材料采于青海諾木洪紅枸杞栽培田,采集無翅棉蚜成蟲,樣品單頭分別放于盛有無水乙醇的1.5 mL離心管中浸泡,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2試劑試驗所用試劑10×PCR Buffer(無Mg2+)、dNTPs(2.5nmol/μL)、MgCl2(25.0nmol/μL)、Taq DNA 聚合酶(5.0 U/μL)等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。200 bp DNA Marker,購自TaKaRa公司。SSR引物采用Vanlerberghe-Masutti等于1999年設計的棉蚜微衛(wèi)星引物(表1)[13],正交試驗所用引物為Ago66,引物Ago59和Ago89為體系驗證引物,均為生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2方法

    1.2.1枸杞棉蚜總DNA提取及檢測采用楊子祥等的改進SDS法[14]提取枸杞棉蚜基因組DNA,用核酸微量測定儀(德國Eppendorf公司BioSpectrometerbasic型)檢測DNA的濃度和質(zhì)量,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性,將提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2因素設計方案本試驗設定的標準反應體系:反應總體積為25μL,其中含有80 ng模板DNA、2.5 U Taq酶、150 μmol/L Mg2+、250 μmol/L dNTPs、1.2 pmol/μL引物。為比較不同處理對SSR擴增的影響,采用單因素體系優(yōu)化試驗對影響擴增的Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物分別設置5種梯度水平。即當一種成分濃度梯度變化時,其他成分不變。其中DNA模板的梯度設計為20、40、60、80、100 ng;Taq酶的梯度設計為0.5、1、1.5、2、2.5 U;Mg2+的梯度設計為150、175、200、225、250 μmol/L;dNTPs的梯度設計為100、150、200、250、300 μmol/L;引物的梯度設計為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 pmol/μL。加ddH2O補足體積為25 μL。

    1.2.3正交優(yōu)化設計為探討反應因素間的互作效應,PCR擴增所設置因素的水平同單因素試驗一致,采用L25(55)正交試驗設計(表2)。為提高試驗準確性,正交試驗進行1次重復檢驗。

    1.2.4SSR-PCR擴增及產(chǎn)物檢測PCR反應程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,58 ℃ 60 s,72 ℃ 30 s,35次循環(huán);72 ℃ 5 min。4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測,用 DL200 Marker 作為標準分子量參照物,恒壓180 V電泳約1 h,經(jīng)固定、銀染、顯色和漂洗后,數(shù)碼相機拍照觀察。

    參照何正文等的方法[15],依據(jù)擴增條帶的敏感性和特異性進行計分,分數(shù)越高表示擴增帶的敏感性、特異性越好。

    1.2.5PCR擴增程序退火溫度的篩選在確定最佳反應體系的基礎上,對引物Ago66的退火溫度在Tm值上下設置5個溫度梯度進行篩選。

    1.2.6SSR最佳反應體系的驗證 利用引物Ago59和Ago89驗證此反應體系的可行性及穩(wěn)定性。

    2結(jié)果與分析

    2.1DNA提取

    用改進的十二烷基硫酸鈉(SDS)法提取的枸杞棉蚜DNA樣品濃度在 155~300 ng/mL,D260 nm/D280 nm值在1.65~1.88之間。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測,點樣泳道均檢測出明亮清晰的DNA條帶,說明改進的SDS法提取枸杞棉蚜的DNA質(zhì)量較高、完整、無降解,點樣孔有微量蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)(圖1)。結(jié)果表明,提取的DNA能夠滿足SSR-PCR試驗要求。

    2.2單因素優(yōu)化試驗

    以枸杞棉蚜為材料,進行單因素優(yōu)化試驗,5個因素對SSR-PCR試驗影響見圖2。

    單因素優(yōu)化試驗結(jié)果表明,DNA濃度對擴增影響不大,在設定的DNA濃度下均能擴增出譜帶,隨DNA用量增加,擴增產(chǎn)物增多,其中40 ng擴增條帶最清晰;DNA濃度高于 60 ng/μL,擴增產(chǎn)率高,但條帶模糊。

    Taq DNA 聚合酶直接影響PCR擴增效率,0.5 U反應不能擴增出目的條帶,含量高于2.5 U反應時,反而抑制擴增,使擴增條帶彌散。

    設定的Mg2+濃度不同,擴增效果不同,150~250 μmol/L均能擴增出目的條帶。Mg2+作為Taq酶的激活劑,濃度高于175 μmol/L時有非特異性擴增,Mg2+濃度升高時,會使PCR擴增產(chǎn)物背景加深。

    dNTPs是PCR擴增中磷酸基團的來源,低濃度易使其過早消耗,擴增效果差,多為擴增單鏈;高濃度的dNTPs,導致Taq酶錯誤摻入,引起錯配,產(chǎn)生非特異性擴增,濃度大于 300 μmol/L 時,過量的dNTPs會與聚合酶結(jié)合抑制PCR反應。

    引物作為PCR擴增的原料,引物成功與模板DNA結(jié)合,便可擴增出有效片段,0.3~0.6 pmol/μL引物模板均能與DNA模板有效結(jié)合,都能擴增出條帶,引物模板濃度高于 0.7 pmol/μL,引物易與自身結(jié)合并擴增,形成引物二聚體。

    2.3正交優(yōu)化試驗

    由圖3可見,重復1中有5個組合沒有擴出條帶,另有2個組合條帶很弱;重復2中有1個組合沒有擴增條帶,說明正交試驗所設計的各個試驗因素濃度梯度均沒有偏離最適范圍。依照評分標準,對各處理進行等級評分,依據(jù)條帶強弱及雜帶多少,2次處理評分結(jié)果分別為7、6,6、6,4、4,6、2,6、8,6、6,7、5,5、3,2、2,6、6,8、6,1、3,1、3,2、4,6、6,6、7,1、1,6、3,1、6,4、6,5、6,1、4,6、5,5、6,1、1。其中處理14重復性好,分值均較高,對比單因素試驗結(jié)果,選擇處理14作為最佳反應體系(50 ng模板DNA,1.5 U Taq DNA聚合酶,150 μmoL/L Mg2+,300 μmol/L dNTPs,0.4 pmoL/μL引物)。

    本研究首先根據(jù)電泳平均得分求出每個因素下各水平的和Ti,然后求出每個因素下各水平的均值ki;最后求出同一因素ki的極差R。R越大,影響越大。極差分析結(jié)果(表3)表明,各因素影響大小排序為dNTPs>Mg2+>引物> Taq DNA聚合酶=DNA。因極差分析不能估計試驗誤差,無法確定分析的精度,為了判斷各因素對棉蚜SSR-PCR反應的影響是否顯著,筆者利用 SPSS 17.0對結(jié)果進一步進行方差分析,與極差分析結(jié)果一致,由Ⅲ型平方和比較可知,對擴增的影響排序為dNTPs>Mg2+>引物> Taq DNA聚合酶=DNA。dNTPs、Mg2+、引物對棉蚜SSR-PCR反應的影響極顯著,Taq DNA聚合酶、DNA對棉蚜SSR-PCR反應的影響顯著(表4)。

    2.4PCR反應退火溫度的篩選

    退火溫度決定PCR的特異性,引物退火溫度在理論退火溫度基礎上進行設置,共設置5個溫度梯度,依次為58、61、64、67、70 ℃。圖4結(jié)果表明,PCR試驗不同退火溫度的條帶特異性和敏感度均比較好,泳道的背景顏色隨著退火溫度升高而加深,其中58 ℃的條帶特異性最優(yōu)。

    2.5最佳反應體系的驗證

    利用獲得的最佳體系,用引物Ago53、Ago89對反應體系的驗證結(jié)果(圖5)表明,2對引物條帶清晰,重復性好。

    3結(jié)論和討論

    利用單因素試驗結(jié)果分別分析5個因素對PCR反應的影響趨勢,并利用正交優(yōu)化試驗研究5個因素對PCR反應的綜合影響。綜合單因素試驗和正交設計試驗結(jié)果,同時考慮到試劑成本,最終獲得枸杞棉蚜SSR-PCR最優(yōu)組合:枸杞棉蚜SSR-PCR的優(yōu)化體系總體積為25 μL,包括50 ng模板DNA、 1.5 U Taq DNA聚合酶、150 μmoL/L Mg2+、300 μmol/L dNTPs、0.4 pmoL/μL引物PCR;適宜擴增程序為94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、58 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s、35次循環(huán),72 ℃ 5 min。

    單因素試驗表明,模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物濃度5個因素均具有促進或抑制SSR-PCR擴增的影響。同劉永剛等利用單因素研究的桃蚜SSR最優(yōu)反應體系[16]相比,枸杞棉蚜SSR研究所用Taq酶及DNA的量較少,說明Taq DNA聚合酶及DNA對SSR-PCR影響較小,少量即可滿足枸杞棉蚜SSR-PCR,優(yōu)化后的體系更為經(jīng)濟。正交試驗表明,5個因素的影響大小排序為dNTPs>Mg2+>引物>Taq DNA 聚合酶=DNA。這一結(jié)果同謝家楠等研究的白背飛虱簡單重復序列區(qū)間(ISSR)反應體系結(jié)果[17]基本一致,同張敏哲等研究的寬翅曲背蝗SSR反應體系結(jié)果相比,影響因素大小排序完全相反[18],這可能是由于材料物種的差異造成的。

    dNTPs是影響枸杞棉蚜SSR-PCR的最主要因素,為擴增時的4種核苷酸原料,低濃度使其過早消耗,擴增效率低。高濃度的dNTPs導致Taq酶錯誤摻入,引起錯配,產(chǎn)生非特異性擴增,而濃度過高則會與 Taq DNA聚合酶競爭性結(jié)合Mg2+,使酶反應活性降低,從而降低擴增效率。單因素擴增表明,dNTPs濃度為300 μmol/L時,過量的dNTPs會與聚合酶結(jié)合而抑制PCR反應;但是,由于存在5個因子的互作作用,在正交試驗中,優(yōu)化的體系中dNTPs濃度為300 μmol/L。Mg2+是影響枸杞棉蚜SSR-PCR的主要因素,它作為Taq DNA 聚合酶的催化劑,當濃度高于175 μmol/L時,能抑制Taq DNA 聚合酶的活性,有非特異性擴增,Mg2+離子濃度升高時,會使PCR擴增產(chǎn)物背景加深。本研究單因素試驗與正交試驗結(jié)果表明,150 μmol/L Mg2+是最適濃度。引物對 SSR-PCR影響也較大,單因素試驗表明,作為結(jié)合模板DNA的原料的引物,引物濃度過高易產(chǎn)生引物二聚體或抑制擴增,并且正交試驗結(jié)果也表明,適合的引物濃度為0.4 pmoL/μL。本研究中Taq DNA 聚合酶、模板DNA、引物的退火溫度對SSR-PCR的影響較小,少量的Taq DNA 聚合酶、模板DNA和低的退火溫度即可獲得明亮清晰的特異性條帶。

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