米非司酮治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的TGFβ—Smad機(jī)制研究

陳旭偉　郭錦芳　厲華卿

[摘要] 目的 分析大鼠子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的TGFβ-Smad信號(hào)通路參與機(jī)制及米非司酮的改善作用。 方法 將雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、子宮內(nèi)膜異位癥模型組、小劑量和大劑量米非司酮組（n=10）。采用免疫印跡法檢測(cè)各組大鼠異位組織中TGFβ-Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白及細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 子宮內(nèi)膜異位癥模型組大鼠的TGFβ-Smad信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白TGFβ、Smad1、Smad2及Smad3的表達(dá)均明顯增高（P<0.01）；促細(xì)胞凋亡蛋白Bax及Caspase-3表達(dá)增強(qiáng)而Bcl-2表達(dá)降低（P<0.01）；米非司酮組大鼠的上述蛋白的異常得到顯著恢復(fù)（P<0.01或P<0.05），且大劑量組效果明顯優(yōu)于小劑量組（P<0.05）。 結(jié)論 米非司酮可通過抑制激活的TGFβ-Smad通路改善大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的異常。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜異位癥；TGFβ-Smad信號(hào)通路；米非司酮；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R711.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）09-0039-04

Study on the effect of mifepristone on the TGFβ-Smad mechanism of the pathogenesis of endometriosis in rats

CHEN Xuwei GUO Jinfang LI Huaqing

Department of Gynecology， Dongyang Peoples Hospital in Zhejiang Province， Dongyang 322100， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of TGFβ-Smad signaling pathway in the pathogenesis of endometriosis in rats and the improvement of mifepristone. Methods Female SD rats were randomly divided into sham operation group， endometriosis model group and mifepristone low dose group and high dose group（n=10）. The expression of key proteins in the TGFβ-Smad signaling pathway and the expression of apoptosis proteins such as Bax， Bcl-2 and Caspase-3 in ectopic tissues of rats were detected by immunoblotting method. Results The expression of key proteins in the TGFβ-Smad signalling pathway such as TGFβ， Smad1， Smad2 and Smad3 were significantly increased in the rats in the endometriosis model group（P<0.01）； the expression of apoptosis proteins such as Bax and Caspase-3 was increased and the expression of Bcl-2 was decreased（P<0.01）； the abnormalities of the above proteins in the mifepristone group were significantly recovered（P<0.01 or P<0.05）， and the effect in the high dose group was significantly better than that in the low dose group（P<0.05）. Conclusion Mifepristone can improve the abnormalities of endometriosis in rats by inhibiting the activated TGFβ-Smad pathway.

[Key words] Endometriosis； TGFβ-Smad signaling pathway； Mifepristone； Apoptosis

子宮內(nèi)膜異位癥是臨床上常見的婦科疾病，主要表征為內(nèi)膜細(xì)胞在不正常的位置生長(zhǎng)[1，2]。子宮內(nèi)膜異位癥與多種因素相關(guān)，如遺傳因素、環(huán)境因素及機(jī)體的免疫功能等[3，4]。但是目前關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥確切發(fā)病機(jī)制尚不明確。TGFβ-Smad信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最常見的信號(hào)通路之一，參與了多種婦科疾病的發(fā)生及發(fā)展過程[5，6]。本研究旨在分析米非司酮對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的TGFβ-Smad信號(hào)通路的影響，為子宮內(nèi)膜異位癥的診治提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

雌性清潔SD大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），許可證號(hào)SYXK（滬）2008-0047，體重110～130 g。所有動(dòng)物均性成熟但未交配。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性培養(yǎng)1周。將雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（不進(jìn)行子宮內(nèi)膜異位癥造模）、子宮內(nèi)膜異位癥模型組（進(jìn)行子宮內(nèi)膜異位癥造模，不采用藥物治療）、小劑量和大劑量米非司酮組（n=10）。

1.2 方法

子宮內(nèi)膜異位癥造模：大鼠麻醉、固定，清潔消毒開腹處皮膚，開腹分離結(jié)扎大鼠左側(cè)子宮，縱向剪開宮腔，剝離子宮內(nèi)膜，宮體與右側(cè)腹膜壁層縫合，關(guān)腹，繼續(xù)飼養(yǎng)。

進(jìn)行子宮內(nèi)膜異位癥造模后1周開始，喂給小鼠口服米非司酮（上海新華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H10950202），小劑量組每日給予1次，每次10 mg/kg，大劑量組每日給予1次，每次100 mg/kg，連服3 d。

1.3 免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

取出大鼠的右側(cè)腹膜壁層組織，通過組織形態(tài)學(xué)觀察確認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位組織生長(zhǎng)，即為造模成功，將造模成功的子宮內(nèi)膜組織充分勻漿后，加入等量蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳及半干法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)膜后將硝酸纖維素膜用脫脂牛奶封閉，然后與第一抗體（1∶500）溫孵4 h，無菌PBS漂洗3次后與HRP標(biāo)記二抗（1∶200）室溫反應(yīng)1 h漂洗后顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度，進(jìn)行蛋白表達(dá)的定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1模型組大鼠TGFβ蛋白的異常表達(dá)及米非司酮的干預(yù)作用

模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織TGFβ較假手術(shù)組高（P<0.01），小劑量和大劑量的米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到明顯改善，且與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1、圖1。

2.2模型組大鼠Smad1/2/3蛋白的異常表達(dá)及米非司酮的干預(yù)作用

模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織Smad1、Smad2和Smad3蛋白較假手術(shù)組高（P<0.01），小劑量和大劑量的米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到明顯改善，且與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1、圖2。

2.3模型組大鼠細(xì)胞凋亡蛋白的異常表達(dá)及米非司酮的干預(yù)作用

模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，而Bcl-2表達(dá)明顯低于假手術(shù)組，且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；小劑量和大劑量的米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到明顯改善，且與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1、圖3。

3討論

子宮內(nèi)膜異位癥是臨床上常見的婦科疾病，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量[7]。子宮內(nèi)膜異位癥患者臨床上多表現(xiàn)為痛經(jīng)、不孕、月經(jīng)異常及性交疼痛等，也可能出現(xiàn)周期性的尿頻、尿痛和尿血等[8，9]。子宮內(nèi)膜異位癥的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確[10]，其主要治療手段是藥物和手術(shù)治療[11]。藥物治療療效不明顯，易復(fù)發(fā)，有一定的不良反應(yīng)發(fā)生[12]。本文在分析大鼠子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的機(jī)制及米非司酮的改善作用時(shí)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥模型組大鼠的TGFβ-Smad信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白TGFβ、Smad1、Smad2及Smad3的表達(dá)均明顯增高；促細(xì)胞凋亡蛋白Bax及Caspase-3表達(dá)增強(qiáng)而Bcl-2表達(dá)降低；米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到顯著恢復(fù)，且大劑量組效果明顯優(yōu)于小劑量組。因此，米非司酮能夠通過抑制孕激素的分泌，改變垂體促性腺細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)，阻斷受體與孕酮結(jié)合并產(chǎn)生雌激素生物學(xué)效應(yīng)[13]，抑制激活的TGFβ-Smad通路改善大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的異常[14]，抗子宮內(nèi)膜增殖[15]，誘導(dǎo)異位內(nèi)膜發(fā)生變性、萎縮與壞死，治療子宮內(nèi)膜異位療效顯著，且不良反應(yīng)小[16]。TGFβ-Smad信號(hào)通路參與了多種婦科疾病的病理學(xué)過程，且可以作為藥物治療的潛在靶點(diǎn)[17]。在研究Smad4在卵巢上皮癌組織中表達(dá)及意義的研究中發(fā)現(xiàn)Smad4蛋白可能與卵巢上皮癌的發(fā)展有一定的相關(guān)性[18]。在研究Smad4和MMP-9在卵巢上皮性癌組織中表達(dá)意義的研究中，也發(fā)現(xiàn)Smad4在卵巢上皮癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，且與基質(zhì)金屬蛋白酶9有密切的相關(guān)性，二者可以作為臨床診斷卵巢上皮癌預(yù)后的重要參數(shù)[19]。在對(duì)TGFβ1的表達(dá)與宮頸癌相關(guān)性的研究中也證實(shí)TGFβ1的表達(dá)與宮頸鱗癌的發(fā)展呈明顯的正相關(guān)性，且其可以作為宮頸癌早期診斷、治療及預(yù)后的重要指標(biāo)[20]。本文在分析子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠發(fā)病機(jī)制的研究中也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織TGFβ及Smad1、Smad2和Smad3蛋白的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；小劑量和大劑量的米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到明顯改善，且與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明激活的TGFβ-Smad信號(hào)通路參與了大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程，米非司酮能夠通過抑制該信號(hào)通路的激活發(fā)揮改善作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序化死亡過程，也與婦科疾病的發(fā)病密切相關(guān)。本文也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，而Bcl-2表達(dá)明顯低于假手術(shù)組，且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；小劑量和大劑量的米非司酮組大鼠的上述蛋白異常得到明顯改善，且與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明細(xì)胞凋亡也參與了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生過程，且藥物也能夠通過抑制該過程發(fā)揮改善作用。

綜上，米非司酮能夠通過抑制激活的TGFβ-Smad通路改善大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的異常。

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（收稿日期：2016-12-07）